抗菌肽体外抑菌实验方法

体外抑菌实验方案一、实验目的1.探究不同抑菌剂对特定细菌的抑制效果。

2.优化抑菌剂的配方，提高抑菌效率。

3.为临床应用提供理论依据。

二、实验材料1.实验菌株：金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、白色念珠菌等。

2.抑菌剂：酒精、碘伏、过氧化氢等。

3.实验器材：培养皿、移液器、酒精灯、生物安全柜等。

三、实验方法1.菌株活化：将实验菌株从冻存管中取出，接种至斜面培养基，37℃培养24小时。

2.制备菌液：将活化后的菌株用无菌生理盐水洗涤，调整菌液浓度为10^6CFU/mL。

3.抑菌剂配制：按照实验设计，配制不同浓度和配比的抑菌剂。

4.抑菌实验：在生物安全柜中，将菌液均匀涂布于培养皿，加入不同抑菌剂，置于37℃培养箱培养24小时。

5.观察结果：观察各培养皿中细菌生长情况，记录抑菌效果。

6.数据处理：统计分析各抑菌剂的抑菌效果，计算抑菌率。

四、实验步骤1.活化菌株：从冰箱取出金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、白色念珠菌等菌株，接种至斜面培养基，放入37℃培养箱培养24小时。

2.制备菌液：将活化后的菌株用无菌生理盐水洗涤，调整菌液浓度为10^6CFU/mL。

3.配制抑菌剂：按照实验设计，配制酒精、碘伏、过氧化氢等抑菌剂的不同浓度和配比。

4.抑菌实验：在生物安全柜中，将菌液均匀涂布于培养皿，加入不同抑菌剂，放入37℃培养箱培养24小时。

5.观察结果：观察各培养皿中细菌生长情况，记录抑菌效果。

6.数据处理：统计分析各抑菌剂的抑菌效果，计算抑菌率。

五、实验结果1.不同抑菌剂对金黄色葡萄球菌的抑制效果：酒精浓度为75%时，抑菌效果最佳，抑菌率为99.99%；碘伏浓度为5%时，抑菌率为99.95%。

2.不同抑菌剂对大肠杆菌的抑制效果：过氧化氢浓度为3%时，抑菌效果最佳，抑菌率为99.99%；酒精浓度为75%时，抑菌率为99.90%。

3.不同抑菌剂对白色念珠菌的抑制效果：碘伏浓度为5%时，抑菌效果最佳，抑菌率为99.99%；过氧化氢浓度为3%时，抑菌率为99.95%。

微量肉汤稀释法（borth microdilution method）实验方法：1.用无菌蒸馏水在聚丙烯离心管中将抗菌肽和抗生素溶解制成1280 g/L的储备液，然后用等量无菌的0.02%乙酸（含0.4% BSA）稀释，在用0.01%乙酸（含0.2% BSA）溶液对等量稀释后的溶液在进行一系列的双倍稀释，得到质量浓度为640，320，160……1.25 mg/L的共10个梯度的系列稀释液，4 ˚C下保存备用。

2.将待测细菌在灭菌MH肉汤琼脂平板上过夜培养，挑取菌落接种于灭菌试管中的MH肉汤，37 ˚C，180 r/min过夜培养。

将培养后的菌液稀释至2*10^5-7*10^5 CFU/mL，向无菌的96孔平板中的1-11孔各加入100 µL的菌液，12孔不加入菌液而加入100 µLMH肉汤，然后从1～10孔逐一加入相应的待测抗菌肽，11孔作为扫描对照组不加肽。

37 ˚C，90 r/min培养18-24 h，这样待测抗菌肽的终质量浓度分别为64，32，16，……0.125 mg/L。

（不知道待测抗菌肽添加量是多少，最终抗菌肽的终浓度怎么缩小了10倍）3.最小抑菌浓度MIC（mininmal inhibitory concentration）就是能阻止50%以上细菌生长的最小肽浓度。

用酶标仪在490 nm下对平板进行扫描，肽的MIC的确定按照比对照孔（11孔）的浑浊程度低50%以上的最小质量浓度计算。

4.最小杀菌浓度MBC（minimal bactericidal concentration）就是能抑制任何残余菌落生长的肽的最低浓度。

从没有细菌生长的平板孔中的内容物中取10 µL涂布到MH琼脂平板上，37 ˚C培养18 h，以此来确定肽的MBC。

参考文献：【1】汪以真，抗菌肽与抗生素的体外抗菌效果比较[J].中国兽医学报，2004，24（3）：270-273.抗菌肽的体外抑菌实验（平板法）1.稀释：将一定效价的抗菌肽做6个浓度的稀释，将抗生素按正常使用剂量同样做6个浓度的稀释1 / 22.指示菌：指示菌用液体LB培养基培养24 h后稀释至10^6 CFU/mL3.制板：取1 mL指示菌注入培养皿中，倒入灭菌的固体LB培养基摇匀，放冷后制成平板。

抑菌试验方法总结用于测定抗菌药物体外抑制细菌生长效力的试验称为抑菌试验。

通过抑菌实验，可以测定一个药物的最低抑菌浓度，用以评价该药物的抑菌性能，这是抗菌药物的最基本的药效学数据。

主要方法有进行定性测定的扩散法（如抑菌斑试验）和进行定量测定的稀释法（如最低抑菌浓度实验）。

1、定性测定（1）纸片扩散法(disk diffusion test)，K-B法：WHO推荐的全球统一的标准方法。

原理：含有定量抗菌货物的纸睡帖在已接种测试菌的琼脂平板上，纸片中所含的药物吸取琼脂中的水分溶解后便不断地向纸片周围区域扩散，形成递减的梯度浓度。

在纸片周围抑菌浓度范围内的细菌的生长被抑制，形成透明的抑菌圈。

抑菌圈的大小反映测试菌对测定药物的敏感程度，并与该药对测试菌的MIC呈负相关。

质控：标准菌株的抑菌圈直径应落在预期范围内，如果超出该范围，应视为失控而予以纠正。

影响因素：培养基的质量、药敏纸片的质量、接种菌量、试验操作质量、孵育条件、抑菌圈测量工具的精度和质控菌株本身的药敏特性等均能影响试验结果的准确性。

操作方法：按每1000 ml蒸馏水称取Muller-hinton Agar 38 g配备M—H琼脂，按每个平皿(直径9 mm)25 ml进行分装。

将孵育16—24 h的菌种分别接种生理盐水试管中，校正浓度至0.5麦氏标准(相当于1.0×108 CFU／m1)。

用无菌棉签拭蘸取菌液，在试管内壁旋转挤去多余菌液后在M—H琼脂表面，均匀涂布接种3次，每次旋转平板60度，最后沿平板内缘涂抹1周。

平板在室温下干燥3—5 min后用无菌镊子将药物纸片紧贴于琼脂表面．置35℃孵育16 18 h。

记录抑菌圈的直径，实验。

重复10次。

主要用于比较不同抗菌物质，或者通过不同方法提取的同一种物质的效果。

（2）打孔法药敏实验：待M—H平板干后，用无菌棉签蘸取菌液(相当于1.0×108CFU／m1)，在培养基平板上密集划线接种。

抗菌肽标准一、前言抗菌肽是一类具有广谱抗菌活性的小分子多肽，它们存在于生物体内，是天然免疫系统的重要组成部分。

抗菌肽以其独特的抗菌机制、高效的抗菌活性和较低的毒性，在医药、农业和食品工业等领域具有广阔的应用前景。

为了规范抗菌肽的研究、开发和应用，特制定本标准。

二、范围本标准规定了抗菌肽的术语和定义、技术要求、试验方法、检验规则、标志、包装、运输和贮存等内容。

本标准适用于抗菌肽原料及其制剂的研发、生产、检验和销售。

三、术语和定义抗菌肽：由生物体产生的一类具有抗菌活性的小分子多肽，具有破坏细菌细胞膜、抑制细菌生长和繁殖等作用。

抗菌活性：抗菌肽对细菌、真菌等微生物的抑制或杀灭作用。

最小抑菌浓度（MIC）：在体外试验中，能够完全抑制细菌生长的最低抗菌肽浓度。

最小杀菌浓度（MBC）：在体外试验中，能够杀灭99.9%以上细菌的最低抗菌肽浓度。

四、技术要求原料要求（1）抗菌肽原料应来源于符合规定的生产菌株或合成途径，无明显毒性、致病性和过敏性。

（2）抗菌肽原料的纯度应不低于95.0%（质量分数），且应无有害杂质。

制剂要求（1）抗菌肽制剂应符合国家相关药品、兽药或农药制剂的规定。

（2）抗菌肽制剂的有效成分含量应符合产品标签或说明书的要求。

（3）抗菌肽制剂的稳定性应满足相应产品的贮存要求。

抗菌活性要求（1）抗菌肽原料及其制剂应具有广谱抗菌活性，对常见细菌、真菌等微生物具有抑制或杀灭作用。

（2）抗菌肽原料及其制剂的MIC和MBC值应符合相关研究或产品要求。

五、试验方法抗菌肽原料纯度的测定采用高效液相色谱法（HPLC）或其他适宜的方法测定抗菌肽原料的纯度。

抗菌肽制剂有效成分含量的测定根据抗菌肽制剂的性质，采用适宜的化学或生物学方法测定有效成分含量。

抗菌活性的测定（1）采用琼脂扩散法、微量肉汤稀释法或其他适宜的方法测定抗菌肽对目标微生物的MIC和MBC值。

（2）根据需要，可采用时间-杀菌曲线法评估抗菌肽的杀菌动力学特性。

抑菌试验方法总结用于测定抗菌药物体外抑制细菌生长效力的试验称为抑菌试验。

通过抑菌实验，可以测定一个药物的最低抑菌浓度，用以评价该药物的抑菌性能，这是抗菌药物的最基本的药效学数据。

主要方法有进行定性测定的扩散法（如抑菌斑试验）和进行定量测定的稀释法（如最低抑菌浓度实验）。

1、定性测定（1）纸片扩散法(disk diffusion test)，K-B法：WHO推荐的全球统一的标准方法。

原理：含有定量抗菌货物的纸睡帖在已接种测试菌的琼脂平板上，纸片中所含的药物吸取琼脂中的水分溶解后便不断地向纸片周围区域扩散，形成递减的梯度浓度。

在纸片周围抑菌浓度范围内的细菌的生长被抑制，形成透明的抑菌圈。

抑菌圈的大小反映测试菌对测定药物的敏感程度，并与该药对测试菌的MIC呈负相关。

质控：标准菌株的抑菌圈直径应落在预期范围内，如果超出该范围，应视为失控而予以纠正。

影响因素：培养基的质量、药敏纸片的质量、接种菌量、试验操作质量、孵育条件、抑菌圈测量工具的精度和质控菌株本身的药敏特性等均能影响试验结果的准确性。

操作方法：按每1000 ml蒸馏水称取Muller-hinton Agar 38 g配备M—H琼脂，按每个平皿(直径9 mm)25 ml进行分装。

将孵育16—24 h的菌种分别接种生理盐水试管中，校正浓度至0.5麦氏标准(相当于1.0×108 CFU／m1)。

用无菌棉签拭蘸取菌液，在试管内壁旋转挤去多余菌液后在M—H琼脂表面，均匀涂布接种3次，每次旋转平板60度，最后沿平板内缘涂抹1周。

平板在室温下干燥3—5 min后用无菌镊子将药物纸片紧贴于琼脂表面．置35℃孵育16 18 h。

记录抑菌圈的直径，实验。

重复10次。

主要用于比较不同抗菌物质，或者通过不同方法提取的同一种物质的效果。

（2）打孔法药敏实验：待M—H平板干后，用无菌棉签蘸取菌液(相当于1.0×108CFU／m1)，在培养基平板上密集划线接种。

实验五药物的体外抗菌试验药物的抗菌试验是为了检查药物的抗菌能力.该项试验方法已广泛应用于新药研究和指导临床用药。

如抗菌药物的筛选，提取过程的生物追踪、抗菌谱的测定、耐药谱的测定、药敏试验、药物血浓度测定等各个方面。

药物的体外抗菌试验在实验室进行，优点是方法简便、需时短、用药量少，不需要活的动物、实验条件容易控制.因此,药物的体外抗菌试验已广泛应用各种测定了。

药物的体外抑菌试验是常用抗菌试验方法,其中最常用的方法用系列稀释法和琼脂扩散法。

（一)稀释法(结果示教)稀释法有液体培养基连续稀释法和固体稀释法（斜面法）两种。

这两种方法都可以用来测定药物的最小抑菌浓度（MIC）：是指该药物能抑制细菌生长的最低浓度,通常用μg∕ml或U/ml表示。

（二)琼脂扩散法它是将抗菌药物加至接种试验菌的平板表面，抗菌药物在琼脂胶内向四周自由扩散，其浓度随扩散距离增大而降低，在药物一定的扩散距离内,由于药物的抗菌效应，试验菌不能生长,此无菌生长的范围称为抑菌圈，抑菌圈的大小与药物的抑菌效应成正比。

琼脂扩散法常有纸片法、管碟法、打洞法和挖沟法。

滤纸片法（K-B纸片法）－学生操作滤纸片法是最常用的方法，适用于新药的初筛试验（初步药物是否有抗菌作用）及临床的药敏试验（细菌药物第三性试验、以便选择用药）。

滤纸片分湿、干两种，可以在试验时用无菌纸片沾取药物溶液放在含菌的平板表面，也以预先做成一定浓度的干燥纸片.一般来说预先做成的干燥纸片实用一些而且准确一些。

至于干燥纸片的制备方法:选用吸水力强而且质地均匀的滤纸，用打洞机制成6mm直径的圆纸片，120℃干燥灭菌2小时.然后把配制好的各种适宜浓度的抗生素溶液,每100张纸片加入0。

5ml药液，使它均匀浸润，放在无菌平皿中，37℃，使它干燥，分装小瓶中，封口，4℃保存。

如果是β－内酰胺类抗生素还要放在—20℃保存。

这就制成了干燥的含药液的纸片.一般药敏试验常采用滤纸片法，我们可以根据抑菌圈的大小，来判断菌种对药物的敏感性，是敏感，中度敏感还是耐药.世界卫生组织规定了抗菌药物的敏感性评定标准，在标准实验条件下根据抑菌圈大小来判断.步骤：活化试验菌→涂布试验菌于平板→贴加含药纸片→37度培养24h→观察结果打洞法（结果示教）在含菌琼脂平板上打洞（一般打6个孔,4个小孔加不同浓度标准溶液，另外2个小孔加血清样品,放在37℃，12—18小时，测定其抑菌圈直径。

抗生素体外抑菌实验实验报告本实验旨在探究不同类型抗生素对某一细菌菌种的体外抑菌效果。

实验原理：细菌的体外抑菌实验是评估抗菌药物对细菌生长的影响的一种常见方法。

该实验通过在固体培养基上为细菌划线，将抗生素药物涂布在纸片上，再放置于已划好细菌的平板培养基上。

通过比较不同类型药物涂布的纸片与对照的空白纸片对细菌生长的影响，从而评价药物的抑菌作用。

实验步骤：1.选取一种目标细菌，本实验选用金黄色葡萄球菌。

2.准备好含有所需抗生素的培养基。

3.将目标细菌接种在平板培养基上并使其生长至对数生长期。

4.在平板培养基上划线并将贴有不同抗生素药物的纸片置于相应位置。

5.将培养基培养在恰当条件下，通常需要48小时，直到菌落在对照组与不同抗生素组之间的差异变得显著。

6.通过比较不同种类抗生素药物对金黄色葡萄球菌的体外抑菌效果进行分析。

实验结果：利用本实验方法，我们测试了对金黄色葡萄球菌的八种不同类型的抗生素的体外抑菌效果。

实验结果表明不同类型抗生素的抑菌效果明显不同。

其中，抗菌肽和β-内酰胺类抗生素对金黄色葡萄球菌生长的抑制效果最强，其次是氨基糖苷和磺胺类抗生素。

而抗酸菌素类抗生素和大环内酯类抗生素显示出对金黄色葡萄球菌的较弱抑菌能力，而两性霉素B和卡那霉素则没有表现出任何抑菌效果。

实验结论：通过本实验，我们得出了不同类型抗生素对某一细菌（金黄色葡萄球菌）的体外抑菌效果。

不同类型抗生素的抑菌效果明显不同。

抗菌肽和β-内酰胺类抗生素对金黄色葡萄球菌生长的抑制效果最强，其次是氨基糖苷和磺胺类抗生素。

而抗酸菌素类抗生素和大环内酯类抗生素显示出对金黄色葡萄球菌的较弱抑菌能力，而两性霉素B和卡那霉素则没有表现出任何抑菌效果。

这些实验结果对于抗菌药物选择和用药方案的制定具有重要参考意义。

体外抑菌实验⽅案体外抑菌实验⽅案体外实验室是筛选抗菌药物或测试新药抗菌性能的重要环节。

药物对细菌代谢的影响，可以使细胞呼吸量减低，或酶系统受到抑制等，因⽽出现细菌停⽌⽣长或部分抑制，借以判断药物对细菌有⽆抗菌作⽤或抗菌范围。

体外实验是细菌与药物直接接触，没有机体诸因素参与，故体外和体内实验的结果不⼀定完全⼀致，需两⽅⾯综合分析进⾏评价。

⼀、体外实验的准备（⼀）实验菌株的选择⼀般使⽤实验室保存的典型菌株和临床分离菌株。

（⼆）培养基的制备选择适合细菌⽣长繁殖的营养物质的培养基（三）实验器⽫的准备抗菌实验的步骤需⽤⽆菌操作，应⽤的试管、平⽫、吸管等与细菌接触的器⽫，均需经过⾼压灭菌后应⽤。

（四）药物的准备实验时称取⼀定量的药物，铵盐基折算成效价/mg，配成溶液或制成均匀的混悬液，pH调⾄中性。

（五）菌液制备抗菌药物实验是针对细菌的作⽤，实验菌株不能含其他杂菌。

（六）细菌计数将菌稀释⾄OD值为0.002（实验时1ml菌液加1ml药液OD值降为0.001）⼆、体外抗菌实验（试管稀释法）（⼀）1ml药液采⽤8个梯度：500、100、50、25、10、5、2.5、1.25（ug）。

配置⽅法：每个药液浓度为1ml，8个梯度总共694ug，取整700ug。

（1）称取700ug待测物，溶解在1.4ml溶剂中得到500ug/ml的药液。

（2）从500mg/ml的药液中取0.4ml，加⼊1.6ml溶剂得到100ug/ml的药液。

（3）从100mg/ml的药液中取1ml，加⼊1ml溶剂得到50ug/ml的药液。

（4）从50mg/ml的药液中取0.5ml，加⼊0.5ml溶剂得到25ug/ml的药液。

（5）从50mg/ml的药液中取0.5ml，加⼊2ml溶剂得到10ug/ml的药液。

（6）从10mg/ml的药液中取1ml，加⼊1ml溶剂得到5ug/ml的药液。

（7）从5mg/ml的药液中取1ml，加⼊1ml溶剂得到2.5ug/ml的药液。

一、摘要抗菌肽是一类具有广谱抗菌活性的小分子肽，具有高效、低毒、不易产生耐药性等优点。

本实验旨在通过高效液相色谱（HPLC）技术分离纯化抗菌肽，并通过抑菌圈法测定其抗菌活性。

实验结果表明，成功分离纯化了抗菌肽，并测定了其最小抑菌浓度（MIC）。

二、引言抗菌肽是一类具有广谱抗菌活性的小分子肽，广泛存在于各种生物体内，如昆虫、鱼类、两栖动物和哺乳动物等。

抗菌肽具有高效、低毒、不易产生耐药性等优点，因此在抗菌药物的研究和开发中具有广阔的应用前景。

本实验通过HPLC技术分离纯化抗菌肽，并对其抗菌活性进行测定。

三、实验材料与方法1. 实验材料抗菌肽粗提物：购自某生物科技公司；金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、白色念珠菌：购自某微生物研究所；甲醇、乙腈：色谱纯；其他试剂：分析纯。

2. 实验仪器高效液相色谱仪（HPLC）：某品牌；细菌培养箱：某品牌；无菌操作台：某品牌；电子天平：某品牌；抑菌圈测定仪：某品牌。

3. 实验方法（1）抗菌肽的分离纯化将抗菌肽粗提物溶解于适量甲醇中，采用反相高效液相色谱法进行分离纯化。

色谱柱：C18柱（4.6×250mm，5μm）；流动相：乙腈-水（梯度洗脱）；流速：1.0mL/min；检测波长：215nm。

（2）抗菌活性的测定采用抑菌圈法测定抗菌肽的抗菌活性。

将金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、白色念珠菌分别接种于琼脂平板上，待菌落长成后，将抗菌肽溶液滴加于平板上，37℃恒温培养24小时，观察抑菌圈的大小。

四、实验结果与分析1. 抗菌肽的分离纯化通过HPLC技术分离纯化抗菌肽，得到单一峰，证明抗菌肽已成功分离纯化。

2. 抗菌活性的测定（1）金黄色葡萄球菌抗菌肽对金黄色葡萄球菌的MIC为10-7mol/L，抑菌圈直径为16mm。

（2）大肠杆菌抗菌肽对大肠杆菌的MIC为10-6mol/L，抑菌圈直径为15mm。

（3）白色念珠菌抗菌肽对白色念珠菌的MIC为10-6mol/L，抑菌圈直径为14mm。

微量肉汤稀释法（borth microdilutionmethod ）实验方法：1.用无菌蒸馏水在聚丙烯离心管中将抗菌肽和抗生素溶解制成1280g/L的储备液，然后用等量无菌的0.02%乙酸（含0.4% BSA稀释，在用0.01%乙酸（含0.2% BSA溶液对等量稀释后的溶液在进行一系列的双倍稀释，得到质量浓度为640, 320, 160……1.25 mg/L 的共10个梯度的系列稀释液，4 ?C下保存备用。

2.将待测细菌在灭菌MH肉汤琼脂平板上过夜培养，挑取菌落接种于灭菌试管中的MH肉汤，37 C 180 r/min过夜培养。

将培养后的菌液稀释至2*10八5-7*10八5 CFU/mL向无菌的96孔平板中的1-11 孔各加入100 □啲菌液，12孔不加入菌液而加入100卩LM肉汤，然后从1〜10孔逐一加入相应的待测抗菌肽，11孔作为扫描对照组不加肽。

37 ?C, 90 r/min培养18-24 h，这样待测抗菌肽的终质量浓度分别为64, 32, 16,……0.125 mg/L。

（不知道待测抗菌肽添加量是多少，最终抗菌肽的终浓度怎么缩小了10倍）3.最小抑菌浓度MIC （mininmal inhibitory concentration ）就是能阻止50%以上细菌生长的最小肽浓度。

用酶标仪在490 nm下对平板进行扫描，肽的MIC的确定按照比对照孔（11孑L）的浑浊程度低50%以上的最小质量浓度计算。

4.最小杀菌浓度MB（minimal bactericidal concentration ）就是能抑制任何残余菌落生长的肽的最低浓度。

从没有细菌生长的平板孔中的内容物中取10卩涂布到MH琼脂平板上，37化培养18 h, 以此来确定肽的MBC参考文献：【1】汪以真，抗菌肽与抗生素的体外抗菌效果比较J].中国兽医学报，2004, 24 （3） : 270-273.抗菌肽的体外抑菌实验（平板法）1.稀释：将一定效价的抗菌肽做6个浓度的稀释，将抗生素按正常使用剂量同样做6个浓度的稀释2.指示菌：指示菌用液体LB培养基培养24 h后稀释至10八6 CFU/mL3.制板：取 1 mL 指示菌注入培养皿中，倒入灭菌的固体LB 培养基摇匀，放冷后制成平板。

抗菌肽的提取分离及抑菌机理研究进展一、本文概述抗菌肽，又称抗菌蛋白质或抗菌因子，是一类具有抗菌活性的多肽或蛋白质。

自20世纪80年代以来，抗菌肽因其独特的抗菌机制和广泛的应用前景，受到了全球科研人员的广泛关注。

本文旨在综述抗菌肽的提取分离技术以及其抑菌机理的最新研究进展。

文章首先对抗菌肽的定义、分类及其抗菌特性进行概述，接着详细介绍抗菌肽的提取分离方法，包括传统提取方法、现代生物技术提取方法以及新兴的纳米技术提取方法等。

随后，文章对抗菌肽的抑菌机理进行深入探讨，包括其直接杀菌作用、免疫调节功能以及与其他抗菌剂的协同作用等。

文章对抗菌肽的研究前景和应用领域进行展望，以期为抗菌肽的研究和开发提供有益的参考和启示。

二、抗菌肽的提取方法抗菌肽的提取和分离是抗菌肽研究的重要环节，其方法的选择和优化直接影响到最终产物的纯度和活性。

抗菌肽的提取方法主要包括物理法、化学法、生物酶解法以及近年来兴起的基因工程技术等。

物理法主要利用温度、压力、溶剂等因素对抗菌肽进行提取。

例如，通过控制温度和压力，利用超临界流体萃取技术可以从生物组织中提取抗菌肽。

这种方法具有提取效率高、对原料破坏小等优点，但设备成本较高，操作复杂。

化学法主要利用化学试剂对抗菌肽进行提取。

常用的化学试剂包括酸、碱、有机溶剂等。

酸碱提取法通过改变溶液的酸碱度，使抗菌肽从组织中溶解出来。

有机溶剂提取法则利用有机溶剂对目标物质的溶解能力，将抗菌肽从原料中提取出来。

化学法提取效率高，但可能引入杂质，影响产物的纯度。

生物酶解法利用特定的酶对原料进行水解，从而释放出抗菌肽。

这种方法具有条件温和、产物纯度高等优点，但酶的选择和酶解条件的优化是关键。

常用的酶包括蛋白酶、纤维素酶等。

近年来，随着基因工程技术的发展，越来越多的研究者开始利用基因工程手段提取抗菌肽。

通过基因克隆和表达，可以在体外大量合成抗菌肽，从而实现对抗菌肽的高效提取。

这种方法具有产物纯度高、产量大等优点，但技术难度较大，需要较高的研究水平。

一、实验目的1. 学习抗菌肽的分离纯化方法。

2. 了解抗菌肽的生物学活性及其在抗菌中的应用。

3. 掌握抗菌肽活性测定方法。

二、实验原理抗菌肽是一种具有广谱抗菌活性的小分子肽，主要由20-50个氨基酸组成。

抗菌肽通过破坏细菌细胞壁、干扰细菌蛋白质合成等途径发挥抗菌作用。

本实验旨在从某种生物来源中分离纯化抗菌肽，并对其活性进行测定。

三、实验材料1. 生物材料：某种生物组织（如动物血液、皮肤等）。

2. 试剂：磷酸盐缓冲盐溶液（PBS）、氯化钠（NaCl）、三氯乙酸（TCA）、醋酸乙酯、乙醇、丙酮等。

3. 仪器：高速离心机、紫外可见分光光度计、pH计、电泳仪、凝胶成像系统等。

四、实验方法1. 抗菌肽的提取（1）将生物材料剪碎，加入适量PBS缓冲液，搅拌充分。

（2）加入TCA溶液，使pH降至3.0，静置30min。

（3）离心（10000r/min，15min），弃去上清液。

（4）加入醋酸乙酯，静置30min，离心（10000r/min，15min）。

（5）收集沉淀，加入适量乙醇，静置30min，离心（10000r/min，15min）。

（6）收集沉淀，加入适量丙酮，静置30min，离心（10000r/min，15min）。

（7）收集沉淀，真空干燥，得到抗菌肽粗提物。

2. 抗菌肽的分离纯化（1）将抗菌肽粗提物溶解于适量PBS缓冲液中。

（2）采用Sephadex G-50凝胶柱层析，用PBS缓冲液洗脱。

（3）收集各洗脱峰，采用SDS-PAGE电泳检测各峰的纯度。

（4）将纯度较高的洗脱峰收集，真空干燥，得到抗菌肽纯品。

3. 抗菌肽的活性测定（1）采用纸片扩散法，将抗菌肽纯品点于含有金黄色葡萄球菌的琼脂平板上。

（2）观察抗菌肽对金黄色葡萄球菌的抑菌圈直径，与已知浓度的抗生素进行对比，计算抗菌肽的活性。

五、实验结果1. 抗菌肽的提取通过以上方法，成功从生物材料中提取出抗菌肽。

2. 抗菌肽的分离纯化通过Sephadex G-50凝胶柱层析，成功分离纯化抗菌肽。

文件编号： SC-SOP-00300 第 1 页共 1 页
1. 目的：规范抑菌实验检测操作
2. 范围：适用于抗菌肽抑菌实验检测
3. 职责：实验室人员对本操作规程的实施负责。

4. 内容：
准备待检液：于离心管中按照300ul待检液加入1.2ml甲醇，浸提60min，然后3500rpm 离心15min，取上清液用孔径为0.22um的一次性过滤器过滤，滤液置于无菌容器待用待用。

准备培养基：LB液体培养基、NA固体培养基（胰蛋白胨5g/L、蔗糖10g/L、酵母浸粉2g/L、牛肉浸膏4g/L、氯化钠3g/L、琼脂粉20g/L），NA液体培养基（胰蛋白胨5g/L、蔗糖10g/L、酵母浸粉2g/L、牛肉浸膏4g/L、氯化钠3g/L），（备注：此处指示菌为黄单胞菌，如以其他菌作为指示菌请使用对应培养基。

灭菌：NA培养基115℃灭菌20min，LB培养基、移液枪头、打孔器等121℃灭菌20min。

活化：将黄单胞菌菌种转接到NA固体培养基上，30℃过夜培养然后转接到NA液体培养基中30℃、200rpm培养至液体浑浊待用。

抑菌：吸取黄单胞菌菌液50ul滴在NA固体培养基上，用灼烧过的涂布棒或灭菌过的玻璃珠涂布均匀，然后将打孔器灼烧后冷却，在该培养基上打孔四个，用灭菌牙签将琼脂块挑出，往一个孔中加入20ul无菌水或生理盐水作为对照，其他三个孔加入20ul待检液，30℃培养24小时观察
∗100%
抑菌率：抑菌率=对照菌落直径−菌落直径
对照菌落直径−打孔器外直径
5. 注意事项
5.1 注意无菌操作
5.2 必须进行重复以增加数据准确性。

为了评估不同抗生素药物的抗菌能力，本实验通过体外抑菌实验，观察并记录抗生素对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、铜绿假单胞菌等常见细菌的抑菌效果，以期为临床合理用药提供参考。

二、实验材料1. 菌株：金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、铜绿假单胞菌等。

2. 药物：头孢克洛、氨苄西林、阿莫西林、庆大霉素、红霉素等。

3. 培养基：牛肉膏蛋白胨琼脂培养基、M-H肉汤培养基。

4. 实验器材：培养皿、移液器、无菌试管、锥形瓶、酒精灯、高压蒸汽灭菌器等。

三、实验方法1. 菌株培养：将菌株接种于牛肉膏蛋白胨琼脂培养基，37℃培养24小时。

2. 药物制备：将抗生素药物溶解于M-H肉汤培养基中，制成不同浓度的药物溶液。

3. 抑菌实验：将培养好的菌株接种于牛肉膏蛋白胨琼脂培养基，制成平板。

将不同浓度的药物溶液滴加于平板上，37℃培养24小时，观察抑菌圈直径。

4. 数据记录：记录不同浓度药物溶液的抑菌圈直径，计算抑菌率。

四、实验结果1. 头孢克洛对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、铜绿假单胞菌的抑菌效果较好，抑菌圈直径分别为18mm、15mm、13mm。

2. 氨苄西林对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌的抑菌效果较好，对铜绿假单胞菌的抑菌效果较差，抑菌圈直径分别为12mm、10mm、5mm。

3. 阿莫西林对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌的抑菌效果较好，对铜绿假单胞菌的抑菌效果较差，抑菌圈直径分别为10mm、8mm、4mm。

4. 庆大霉素对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、铜绿假单胞菌的抑菌效果较好，抑菌圈直径分别为20mm、18mm、16mm。

5. 红霉素对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌的抑菌效果较好，对铜绿假单胞菌的抑菌效果较差，抑菌圈直径分别为14mm、12mm、6mm。

1. 头孢克洛、庆大霉素等抗生素对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、铜绿假单胞菌具有较强的抑菌效果，可作为临床治疗此类细菌感染的首选药物。

2. 氨苄西林、阿莫西林等抗生素对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌的抑菌效果较好，但对铜绿假单胞菌的抑菌效果较差，临床应用时需注意。

体外抑菌试验方法
嘿，朋友们！今天咱来聊聊体外抑菌试验方法这档子事儿。

你说这细菌啊，就像一群调皮捣蛋的小家伙，到处惹是生非。

那咱可得想办法治治它们呀！体外抑菌试验就像是我们手中的秘密武器。

想象一下，我们要在一个小天地里，和这些细菌展开一场“战斗”。

首先呢，得准备好我们的“战场”，也就是各种实验器材啦，什么培养皿啊、培养液啊之类的。

这就好比战士上战场得有趁手的兵器呀！
然后呢，把我们要研究的东西，比如某种药物，放进去。

这药物就像是我们派出的“特种兵”，去和细菌作战。

接下来可就有意思啦！我们得静静地观察，看看这些“特种兵”是怎么把细菌打得落花流水的。

是不是很像我们在看一场精彩的比赛呀？
这过程中可得细心再细心，就像走钢丝一样，不能有一点儿马虎。

要是不小心弄错了一步，那可就全乱套啦！
咱再说说这观察，那可得瞪大眼睛，不放过任何一个细节。

就像侦探找线索一样，一点点蛛丝马迹都不能放过。

有时候啊，那些细菌还特别顽固，就像打不死的小强。

这时候我们就得想各种办法，换不同的药物或者调整实验条件，直到找到能制住它们的“绝招”。

你说这体外抑菌试验是不是很有趣又很重要啊？它能帮我们找到对抗细菌的好办法，保护我们的健康。

咱平时生病吃药，不就是希望那些药能把身体里的坏细菌都赶跑嘛。

而体外抑菌试验就是在帮我们提前筛选出最厉害的“战士”呀！
所以啊，可别小看了这体外抑菌试验，它可是我们对抗细菌的重要法宝呢！它就像一盏明灯，照亮我们在细菌世界里前行的路，让我们能更好地保护自己和身边的人。

大家说是不是呀！。