实验4 药物体外抗菌试验

第4章抗菌药物敏感试验一、需氧菌和兼性厌氧菌的体外抗菌药物敏感试验1.扩散法（K-B法）（1）原理将含有定量抗菌药物的纸片贴在接种有待检菌的琼脂平板上，该点称为抗菌药源。

药物向周围扩散，形成了随着药源距离增加，琼脂中药物浓度递减的浓度梯度。

在药源周围可抑菌浓度范围内待检菌的生长被抑制，形成无菌生长的透明圈即抑菌圈，其大小可以反映待检菌对测定药物的敏感性，并与该药对待检菌的最低抑菌浓度（MIC）呈负相关，即抑菌圈愈大，MIC愈小。

（2）实验材料①培养基：采用水解酪蛋白（M-H）琼脂，pH为7.2，琼脂厚度4mm。

对生长条件要求高的细菌，如链球菌属细菌需加入5%脱纤维羊血，嗜血杆菌属细菌需加入1%血红蛋白（含Ⅴ因子）和1%Ⅹ因子复合物。

②抗菌药物纸片：选用直径为6.35mm，吸水量20μl的专用药敏纸片。

制备时取灭菌药敏纸片，经加样或浸泡药物溶液后冷冻干燥，置4℃保存备用，在有效期内使用。

③接种菌液挑取平板上形态相同的菌落4～5个，接种于3～5ml M-H肉汤中，于35℃中培养2～8h。

嗜血杆菌属和链球菌属细菌需用加血肉汤培养过夜。

用生理盐水或肉汤校正菌液至0.5麦氏比浊标准（相当于1.5×109/ml的含菌量）后在15min内接种。

（3）试验方法以无菌棉拭蘸取已制备好的菌液（其浊度为0.5麦氏比浊标准），在M-H琼脂表面均匀涂布接种3次，每次平板旋转60°，最后沿平板内缘涂抹１周。

平板置室温干燥3～5min，后用无菌镊子或专用纸片分配器将含药纸片贴于琼脂表面。

纸片应贴得均匀，各纸片中心相距＞24mm，纸片距平板内缘＞15mm。

直径为90mm的平板可贴6张纸片。

纸片贴牢后应避免再移动。

平板室温放置15min后倒置于35℃培养箱中培养16～18h后读取结果。

（4）结果解释平板置黑色背景上，从背面量取包括纸片直径在内的抑菌圈直径，单位为mm。

培养基中如果加有血液须打开皿盖从正面测量抑圈菌。

实验四清热药的体抑抗菌实验【实验目的】通过实验，掌握中药体外抗菌实验的方法，了解清热药对病原菌的抑制和杀死作用。

【实验原理】【实验内容】【实验组织】（一）班级进行分组，每个实验小组３名学生；（二）每４个实验小组组由一名专业教师或实验教师（兼职教师）进行指导。

【实验准备】（一）菌种根据实验条件可选用大肠杆菌、沙门氏杆菌、肺炎球菌、链球菌、绿脓杆菌、金黄葡萄球菌，一种或数种。

先接种在适于生长的培养基内，置于37℃恒温箱中培养24h，待菌种复壮后使用。

再取复壮的菌种一环，放在适宜的培养基内，置于37℃恒温箱中培养。

培养时间及所需培养基因细菌的各类不同而异。

一般细菌培养6h，菌液浓度每ml相当于9亿左右，再用肉汤液1：500稀释后供使用。

链球菌、肺炎双球菌等培养18h，菌液浓度相当于每ml 3亿左右，再用肉汤液1：5稀释后供使用。

（二）培养基一般细菌如葡萄球菌、肠道杆菌等，可采用普通肉汤培养基或普通肉汤琼脂培养基。

链球菌、肺炎双球菌等对营养要求较高的病原菌，可采用羊血肉汤培养基。

（三）实验器材试管（高压灭菌后备用），接种环，酒精灯等。

（四）实验药品清热药如黄连、黄芩、地丁、栀子等。

将欲试药物制成100%水煎剂（１：１煎剂）。

经55157.6Pa（即8lb）气压灭菌20min，冷却后置冰箱中备用。

【方法步骤】（一）试管法用普通肉汤培养基或羊血肉汤培养基与100%中药煎剂进行倍比稀释（第一管双倍培养基），稀释度为1：2、1：4、1：8……1：256，每管量为1ml。

然后将菌液分别接种于不同浓度的药液培养基中，接种量为已稀释好的菌液0.1ml。

同时设药液（药液与培养基1：２）；细菌（细菌与培养基0.1：1）；培养基（不加药液与菌液）各一管，做为对照。

将上述试管摇匀后，置于37℃恒温箱中培养24h，再观察结果。

（二）平板法先将药物按试管法稀释为1：2～1：256等不同浓度。

将各稀释度的药液1ml，置于无菌平皿中，然后将各平皿加已溶化的琼脂培养基9ml，迅速与药液混匀，对照用10ml琼脂培养基。

实验五药物的体外抗菌试验药物的抗菌试验是为了检查药物的抗菌能力。

该项试验方法已广泛应用于新药研究和指导临床用药。

如抗菌药物的筛选，提取过程的生物追踪、抗菌谱的测定、耐药谱的测定、药敏试验、药物血浓度测定等各个方面.药物的体外抗菌试验在实验室进行，优点是方法简便、需时短、用药量少,不需要活的动物、实验条件容易控制.因此，药物的体外抗菌试验已广泛应用各种测定了.药物的体外抑菌试验是常用抗菌试验方法,其中最常用的方法用系列稀释法和琼脂扩散法.(一)稀释法（结果示教）稀释法有液体培养基连续稀释法和固体稀释法（斜面法）两种.这两种方法都可以用来测定药物的最小抑菌浓度（MIC）：是指该药物能抑制细菌生长的最低浓度,通常用μg∕ml或U/ml表示.（二）琼脂扩散法它是将抗菌药物加至接种试验菌的平板表面,抗菌药物在琼脂胶内向四周自由扩散,其浓度随扩散距离增大而降低,在药物一定的扩散距离内，由于药物的抗菌效应，试验菌不能生长，此无菌生长的范围称为抑菌圈，抑菌圈的大小与药物的抑菌效应成正比.琼脂扩散法常有纸片法、管碟法、打洞法和挖沟法.滤纸片法（K—B纸片法)－学生操作滤纸片法是最常用的方法，适用于新药的初筛试验（初步药物是否有抗菌作用)及临床的药敏试验(细菌药物第三性试验、以便选择用药）.滤纸片分湿、干两种，可以在试验时用无菌纸片沾取药物溶液放在含菌的平板表面，也以预先做成一定浓度的干燥纸片。

一般来说预先做成的干燥纸片实用一些而且准确一些.至于干燥纸片的制备方法：选用吸水力强而且质地均匀的滤纸，用打洞机制成6mm直径的圆纸片，120℃干燥灭菌2小时.然后把配制好的各种适宜浓度的抗生素溶液，每100张纸片加入0。

5ml药液,使它均匀浸润,放在无菌平皿中，37℃，使它干燥，分装小瓶中，封口，4℃保存.如果是β－内酰胺类抗生素还要放在—20℃保存.这就制成了干燥的含药液的纸片。

一般药敏试验常采用滤纸片法，我们可以根据抑菌圈的大小，来判断菌种对药物的敏感性,是敏感，中度敏感还是耐药。

为了评估不同抗生素药物的抗菌能力，本实验通过体外抑菌实验，观察并记录抗生素对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、铜绿假单胞菌等常见细菌的抑菌效果，以期为临床合理用药提供参考。

二、实验材料1. 菌株：金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、铜绿假单胞菌等。

2. 药物：头孢克洛、氨苄西林、阿莫西林、庆大霉素、红霉素等。

3. 培养基：牛肉膏蛋白胨琼脂培养基、M-H肉汤培养基。

4. 实验器材：培养皿、移液器、无菌试管、锥形瓶、酒精灯、高压蒸汽灭菌器等。

三、实验方法1. 菌株培养：将菌株接种于牛肉膏蛋白胨琼脂培养基，37℃培养24小时。

2. 药物制备：将抗生素药物溶解于M-H肉汤培养基中，制成不同浓度的药物溶液。

3. 抑菌实验：将培养好的菌株接种于牛肉膏蛋白胨琼脂培养基，制成平板。

将不同浓度的药物溶液滴加于平板上，37℃培养24小时，观察抑菌圈直径。

4. 数据记录：记录不同浓度药物溶液的抑菌圈直径，计算抑菌率。

四、实验结果1. 头孢克洛对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、铜绿假单胞菌的抑菌效果较好，抑菌圈直径分别为18mm、15mm、13mm。

2. 氨苄西林对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌的抑菌效果较好，对铜绿假单胞菌的抑菌效果较差，抑菌圈直径分别为12mm、10mm、5mm。

3. 阿莫西林对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌的抑菌效果较好，对铜绿假单胞菌的抑菌效果较差，抑菌圈直径分别为10mm、8mm、4mm。

4. 庆大霉素对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、铜绿假单胞菌的抑菌效果较好，抑菌圈直径分别为20mm、18mm、16mm。

5. 红霉素对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌的抑菌效果较好，对铜绿假单胞菌的抑菌效果较差，抑菌圈直径分别为14mm、12mm、6mm。

1. 头孢克洛、庆大霉素等抗生素对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、铜绿假单胞菌具有较强的抑菌效果，可作为临床治疗此类细菌感染的首选药物。

2. 氨苄西林、阿莫西林等抗生素对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌的抑菌效果较好，但对铜绿假单胞菌的抑菌效果较差，临床应用时需注意。

药物的体外抗菌试验-第十九章第十九章药物的体外抗菌试验教学要求.（一）掌握常用的体外抑菌试验（连续稀释法、琼脂扩散法）。

.（二）熟悉杀菌试验（最低杀菌浓度、最低致死浓度的含义及测定的方法，活菌计数法，石碳酸系数测定法）；联合抗菌试验（纸条试验、梯度平板纸条试验、棋盘格法），协同、拮抗、无关、累加的概念。

.（三）了解体外抗菌试验的影响因素。

第一节常用的体外抑菌试验一、药物的体外抗菌试验.又称药敏试验，主要用于筛选抗菌药物或测定细菌对药物的敏感性。

.最低抑菌浓度（MIC）：指药物完全抑制某种微生物生长的最低浓度。

.优点：方法简便、需时短、用药量少，不需要动物。

.缺点：不能根据体外试验结果肯定或否定一个药物的抗菌作用。

试验菌.细菌、霉菌和酵母菌常用.标准菌株：来自专门机构，我国是卫生部生物制品检定所菌种保藏中心提供。

.临床分离株：经形态、生化及血清学等方面鉴定。

不得有杂菌污染，不宜用传代多次的菌种，最好是重新活化的。

控制培养时间。

.接种菌量的多少的计算培养基.根据试验菌的营养要求进行选择.培养基质量控制供试药物.药物的浓度和总量要精确配制.供试药物用适宜溶剂溶解并稀释至所需浓度，难溶药物加助溶剂。

.中草药或某些生药原粉的样品，应先提取，再浓缩至所需浓度对照试验.试验菌对照：在无药情况下，应能在培养基内正常生长.已知药物对照：已知抗菌药对标准的敏感菌株应出现预期的抗菌效应，对已知的抗药菌应不出现抗菌效应。

.溶剂及稀释剂对照：抗菌药物配制时所用的溶剂及稀释剂应无抗菌作用（一）连续稀释法.方法：液体法和固体法。

.用于测定药物的最低抑菌浓度（MIC）和最低杀菌浓度（MBC）。

.抑菌：药物可抑制微生物生长繁殖，但不杀死它，在药物除去后，微生物又可恢复生长.杀菌：药物能杀死微生物，当药物去除后，微生物不再继续生长。

1、液体培养基稀释法.方法：两倍稀释法.步骤：液体培养基稀释药物成系列递减的浓度每管加入一定量试验菌24-48小时后肉眼观察试管浑浊情况，记录能抑制细菌生长的最低浓度（MIC）将未见细菌生长的各试管内的培养液（各吸取0.1ml）移种到新鲜的琼脂培养基上重新长出细菌的只具有抑菌作用，无菌生长（菌落数﹤5个）具有杀菌作用，记录最低杀菌浓度（MBC）。