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抑菌试验方法总结用于测定抗菌药物体外抑制细菌生长效力的试验称为抑菌试验。
通过抑菌实验，可以测定一个药物的最低抑菌浓度，用以评价该药物的抑菌性能，这是抗菌药物的最基本的药效学数据。
主要方法有进行定性测定的扩散法（如抑菌斑试验）和进行定量测定的稀释法（如最低抑菌浓度实验）。
1、定性测定（1）纸片扩散法(disk diffusion test)，K-B法：WHO推荐的全球统一的标准方法。
原理：含有定量抗菌货物的纸睡帖在已接种测试菌的琼脂平板上，纸片中所含的药物吸取琼脂中的水分溶解后便不断地向纸片周围区域扩散，形成递减的梯度浓度。
在纸片周围抑菌浓度范围内的细菌的生长被抑制，形成透明的抑菌圈。
抑菌圈的大小反映测试菌对测定药物的敏感程度，并与该药对测试菌的MIC呈负相关。
质控：标准菌株的抑菌圈直径应落在预期范围内，如果超出该范围，应视为失控而予以纠正。
影响因素：培养基的质量、药敏纸片的质量、接种菌量、试验操作质量、孵育条件、抑菌圈测量工具的精度和质控菌株本身的药敏特性等均能影响试验结果的准确性。
操作方法：按每1000 ml蒸馏水称取Muller-hinton Agar 38 g配备M—H琼脂，按每个平皿(直径9 mm)25 ml进行分装。
将孵育16—24 h的菌种分别接种生理盐水试管中，校正浓度至0.5麦氏标准(相当于1.0×108 CFU／m1)。
用无菌棉签拭蘸取菌液，在试管内壁旋转挤去多余菌液后在M—H琼脂表面，均匀涂布接种3次，每次旋转平板60度，最后沿平板内缘涂抹1周。
平板在室温下干燥3—5 min后用无菌镊子将药物纸片紧贴于琼脂表面．置35℃孵育16 18 h。
记录抑菌圈的直径，实验。
重复10次。
主要用于比较不同抗菌物质，或者通过不同方法提取的同一种物质的效果。
（2）打孔法药敏实验：待M—H平板干后，用无菌棉签蘸取菌液(相当于1.0×108CFU／m1)，在培养基平板上密集划线接种。
《生物工程综合实验平台》——《抗菌药物的体外抑菌及体内抗菌实验》专业班级：学号：姓名：小组成员：实验日期：5月27日-5月30日微生物综合实验抗菌药物的体外抑菌及体内抗菌实验班级16级生物技术1、2班姓名学号座位号实验日程安排抗菌药物的体外抑菌及体内抗菌实验一、实验原理抗菌药物一般是指具有抑菌或杀菌活性的药物，包括各种抗生素、磺胺类、咪唑类、硝基咪唑类、喹诺酮类等化学合成药物。
由细菌、放线菌、真菌等微生物经培养而得到的某些产物，或用化学半合成法制造的相同或类似的物质，也可化学全合成。
抗菌药物在一定浓度下对病原体有抑制和杀灭作用。
药物的体外抑菌实验，是指在体外测定药物抑制或杀灭细菌能力的实验。
它是常用抗菌实验的方法，其中最常用的方法有系列稀释法和琼脂扩散法。
稀释法有液体培养基连续稀释法和固体稀释法（斜面法）两种，这两种方法都可以用来测定药物的最小抑菌浓度（MIC）：是指该药物能抑制细菌生长的最低浓度，通常用ug/ml或U/ml表示。
其结果判断方法为凡无肉眼可见细菌生长的药物最低浓度即为该菌的最小抑菌浓度（MIC）。
琼脂扩散法是将抗菌药物加至接种试验菌的平板表面，抗菌药物在琼脂胶内向四周自由扩散，其浓度随扩散距离增大而降低。
在药物一定的扩散距离内，由于药物的抗菌效应，试验菌不能生长，此无菌生长的范围称为抑菌圈。
抑菌圈的大小与药物的抑菌效应成正比。
琼脂扩散法常有纸片法、管碟法、打洞法和挖沟法。
一般药敏实验常采用纸片法，我们可以根据抑菌圈的大小，来判断菌种对药物的敏感性，是敏感，中度敏感还是耐药。
世界卫生组织规定了抗菌药物的敏感性评定标准，在标准实验条件下根据抑菌圈的大小来判断，如：药物的体内抗菌实验又称为动物实验治疗试验或保护力试验。
当抗菌药物进入机体后，其效力的发挥要受体内各种因素的影响。
如血液及组织内的蛋白质或磷脂、浓汁内的核酸均与药物结合，降低药物的活性；坏死组织内的酸性环境也能影响药物的活性。
实验六、抗菌药物的体外药效试验(药敏试验）各种病原菌对抗菌药物的敏感性不同，同种细菌的不同菌株对同一药物的敏感性有差异，检测细菌对抗菌药物的敏感性，可筛选最有疗效的药物，用于临床对控制细菌性传染病的流行至关重要。
此外,通过药物敏感试验可为新抗菌药物的筛选提供依据。
药敏试验的方法很多，普遍使用的有滤纸片扩散试验(Kirby —Baueer Dice Diffusion）;最低抑菌浓度试验（Minimum Inhibitory Concentration，MIC）和最低杀菌浓度试验(Minimum Bactericidal Concentration, MBC）.［目的要求］1、熟悉体外抗菌试验操作技术。
2、掌握药物抗菌能力体外测定的常用方法及其用途.［实验原理］常用的体外测定药物抑菌能力的方法有两大类：琼脂渗透法与浓度系列稀释法.琼脂渗透法时利用药物能够渗透至琼脂培养基的性能，将实验菌混入琼脂培养基后倾注成平板；或将试验菌均匀涂于琼脂平板的表面,然后用不同的方法将药物置于已含试验菌的琼脂平板上。
根据加药的操作方法不同而有滤纸片法、打洞法、管碟法及挖沟法等。
经适宜温度培养后观察药物的抑菌能力.浓度系列稀释法时把药物稀释成不同的系列浓度，混入培养基内,加入一定量的试验菌，经适宜温度培养后观察结果，求得药物的最低抑菌浓度（MIC）.1、细菌:所用细菌应包括主要致病菌。
革兰氏阳性球菌包括金黄色葡萄球菌(产酶与不产酶菌株)、表皮葡萄球菌，链球菌、肠球菌等。
革兰氏阴性球菌如淋球菌等。
革兰氏阴性杆菌包括流感杆菌、肠杆菌科细菌8～10种，绿脓杆菌与其它假单孢菌属及不动杆菌属等，厌氧菌包括脆弱类杆菌、消化球菌和消化链球菌等.对临床应用有代表性的菌株数量，创新药应不小于1000株。
其它类新药根据新药抗菌谱宽窄可作200—500株。
试验时应包括有国际公认质控菌株(如金葡菌ATCC25925，大肠杆菌ATCC25922和绿脓杆菌ATCC27853等)。
抑菌试验方法总结用于测定抗菌药物体外抑制细菌生长效力的试验称为抑菌试验。
通过抑菌实验，可以测定一个药物的最低抑菌浓度，用以评价该药物的抑菌性能，这是抗菌药物的最基本的药效学数据。
主要方法有进行定性测定的扩散法（如抑菌斑试验）和进行定量测定的稀释法（如最低抑菌浓度实验）。
1、定性测定（1）纸片扩散法(disk diffusion test)，K-B法：WHO推荐的全球统一的标准方法。
原理：含有定量抗菌货物的纸睡帖在已接种测试菌的琼脂平板上，纸片中所含的药物吸取琼脂中的水分溶解后便不断地向纸片周围区域扩散，形成递减的梯度浓度。
在纸片周围抑菌浓度范围内的细菌的生长被抑制，形成透明的抑菌圈。
抑菌圈的大小反映测试菌对测定药物的敏感程度，并与该药对测试菌的MIC呈负相关。
质控：标准菌株的抑菌圈直径应落在预期范围内，如果超出该范围，应视为失控而予以纠正。
影响因素：培养基的质量、药敏纸片的质量、接种菌量、试验操作质量、孵育条件、抑菌圈测量工具的精度和质控菌株本身的药敏特性等均能影响试验结果的准确性。
操作方法：按每1000 ml蒸馏水称取Muller-hinton Agar 38 g配备M—H琼脂，按每个平皿(直径9 mm)25 ml进行分装。
将孵育16—24 h的菌种分别接种生理盐水试管中，校正浓度至0.5麦氏标准(相当于1.0×108 CFU／m1)。
用无菌棉签拭蘸取菌液，在试管内壁旋转挤去多余菌液后在M—H琼脂表面，均匀涂布接种3次，每次旋转平板60度，最后沿平板内缘涂抹1周。
平板在室温下干燥3—5 min后用无菌镊子将药物纸片紧贴于琼脂表面．置35℃孵育16 18 h。
记录抑菌圈的直径，实验。
重复10次。
主要用于比较不同抗菌物质，或者通过不同方法提取的同一种物质的效果。
（2）打孔法药敏实验：待M—H平板干后，用无菌棉签蘸取菌液(相当于1.0×108CFU／m1)，在培养基平板上密集划线接种。
抑菌试验：用于测定抗菌药物体外抑制细菌生长效力的试验称为抑菌试验。
通过抑菌实验,可以测定一个药物的最低抑菌浓度,用以评价该药物的抑菌性能,这是抗菌药物的最基本的药效学数据。
主要方法有进行定性测定的扩散法（如抑菌斑试验）和进行定量测定的稀释法（如最低抑菌浓度实验）。
1.常量肉汤稀释法抗菌药物贮存液制备1.1.1.抗菌药物贮存液制备抗菌药物贮存液浓度不应低于1000μg/ml(如1280μg/ml)或10倍于最高测定浓度。
溶解度低的抗菌药物可稍低于上述浓度。
抗菌药物直接购自厂商或相关机构。
所需抗菌药物溶液量或粉剂量可公式进行计算。
例如：需配制100 ml浓度为1280μg/ml的抗生素贮存液，所用抗生素为粉剂，其药物的有效力为750μg/mg。
用分析天平精确称取抗生素粉剂的量为182.6 mg。
根据公式计算所需稀释剂用量为：（182.6 mg×750μg/ml）/1280μg/ml=107.0ml，然后将182.6 mg 抗生素粉剂溶解于107.0ml稀释剂中。
制备抗菌药物贮存液所用的溶剂和稀释剂见表5。
配制好的抗菌药物贮存液应贮存于-60℃以下环境，保存期不超过6个月。
药敏试验用抗菌药物浓度范围1.1.2.药敏试验用抗菌药物浓度范围根据NCCLS抗菌药物敏感性试验操作标准，药物浓度范围应包含耐药、中介和敏感分界点值，特殊情况例外。
培养基1.1.3. 培养基NCCLS推荐使用Mueller-Hinton（MH）肉汤，pH7.2~7.4。
需氧菌及兼性厌氧菌在此培养基中生长良好。
在测试葡萄球菌对苯唑西林的敏感性时，应在肉汤中加入2%（W/V）氯化钠，按制造厂家的要求配制需要量的MH肉汤。
嗜血杆菌属菌使用HTM肉汤，肺炎链球菌和其它链球菌使用含2%~5%溶解马血的MH肉汤。
接种物的制备1.1.4.接种物的制备有2种方法配制接种物，一是细菌生长方法，用接种环挑取形态相似待检菌落3-5个，接种于4-5ml的水解酪蛋白（MH）肉汤中，35℃孵育2-6h。
实验五药物的体外抗菌试验
药物的抗菌试验是为了检查药物的抗菌能力。
该项试验方法已广泛应用于新药研究和指导临床用药。
如抗菌药物的筛选，提取过程的生物追踪、抗菌谱的测定、耐药谱的测定、药敏试验、药物血浓度测定等各个方面。
药物的体外抗菌试验在实验室进行，优点是方法简便、需时短、用药量少，不需要活的动物、实验条件容易控制。
因此，药物的体外抗菌试验已广泛应用各种测定了。
药物的体外抑菌试验是常用抗菌试验方法，其中最常用的方法用系列稀释法和琼脂扩散法。
（一）稀释法（结果示教）
稀释法有液体培养基连续稀释法和固体稀释法（斜面法）两种。
这两种方法都可以用来测定药物的最小抑菌浓度（MIC）：是指该药物能抑制细菌生长的最低浓度，通常用μg∕ml或U/ml表示。
（二）琼脂扩散法
它是将抗菌药物加至接种试验菌的平板表面，抗菌药物在琼脂胶内向四周自由扩散，其浓度随扩散距离增大而降低，在药物一定的扩散距离内，由于药物的抗菌效应，试验菌不能生长，此无菌生长的范围称为抑菌圈，抑菌圈的大小与药物的抑菌效应成正比。
琼脂扩散法常有纸片法、管碟法、打洞法和挖沟法。
滤纸片法（K-B纸片法）－学生操作
滤纸片法是最常用的方法，适用于新药的初筛试验（初步药物是否有抗菌作用）及临床的药敏试验（细菌药物第三性试验、以便选择用药）。
滤纸片分湿、干两种，可以在试验时用无菌纸片沾取药物溶液放在含菌的平板表面，也以预先做成一定浓度的干燥纸片。
一般来说预先做成的干燥纸片实用一些而且准确一些。
至于干燥纸片的制备方法：选用吸水力强而且质地均匀的滤纸，用打洞机制成6mm直径的圆纸片，120℃干燥灭菌2小时。
然后把配制好的各种适宜浓度的抗生素溶液，每100张纸片加入0.5ml药液，使它均匀浸润，放在无菌平皿中，
37℃，使它干燥，分装小瓶中，封口，4℃保存。
如果是β－内酰胺类抗生素还要放在-20℃保存。
这就制成了干燥的含药液的纸片。
一般药敏试验常采用滤纸片法，我们可以根据抑菌圈的大小，来判断菌种对药物的敏感性，是敏感，中度敏感还是耐药。
世界卫生组织规定了抗菌药物的敏感性评定标准，在标准实验条件下根据抑菌圈大小来判断。
步骤：
活化试验菌→涂布试验菌于平板→贴加含药纸片→37度培养24h→观察结果
打洞法（结果示教）
在含菌琼脂平板上打洞（一般打6个孔，4个小孔加不同浓度标准溶液，另外2个小孔加血清样品，放在37℃，12-18小时，测定其抑菌圈直径。
所以说微量法适于药物血浓度的监测。
优点是微量（血清用量少）敏感，操作简便。
管碟法（结果示教）
与打洞法原理相同，只是把药液加入放到琼脂板上的牛津杯中。
加药量相对比较多，适合中药的体外抗菌试验。
挖沟法（结果示教）
方法是先制备普通琼脂平板，并在平板上挖直沟，在沟内滴加药液，在沟侧接种细菌。
经过培养以后观察家细菌生长的情况。
我们可以根据沟和细菌间的抑菌距离的长短，来判断该药物对这些细菌的抗菌能力。
复习题：
1药物体外抑菌试验常用的方法有哪几种？具体的试验操作方法？
2如何测定药物的最小致死浓度？
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