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高产胸苷磷酸化酶的大肠杆菌的诱变筛选杨妍;丁茹;乔焕焕;周燕霞【摘要】目的:大肠杆菌(Escherichia coli)产生的胸苷磷酸化酶能够促进胸苷转化为胸腺嘧啶,是合成核苷类药物的关键酶。
本研究利用紫外线诱导法诱变大肠杆菌使其高产胸苷磷酸化酶,并筛选出3株能够高产该酶的菌株。
方法:紫外诱变采用二次照射法,第1次照射60s后停止照射10min后,各继续照射5~30s梯度时间,增加大肠杆菌的正突变率。
结果:筛选出E17、E23、E32三株产胸苷磷酸化酶量较高的菌株。
结论:经过紫外诱变筛选后,这3株大肠杆菌产胸苷磷酸化酶的能力比原始菌株强,并且可以稳定遗传。
【期刊名称】《生物化工》【年(卷),期】2016(000)003【总页数】3页(P20-22)【关键词】大肠杆菌;核苷;胸苷磷酸化酶;紫外诱变;筛选【作者】杨妍;丁茹;乔焕焕;周燕霞【作者单位】渭南师范学院化学与环境学院【正文语种】中文【中图分类】Q93核苷类药物是现代临床医学上用于治疗病毒感染性、恶性肿瘤、AIDS等疾病的一类重要药物。
现如今，在使用的抗病毒药物中有近50%是核苷类药物[1]。
胸苷磷酸化酶广泛存在于动物、植物器官及微生物体内，是生物体内嘧啶核苷补救途径中关键酶，也是体外酶法合成核苷类物质的重要酶[2]。
目前生产核苷磷酸化酶类主要通过微生物发酵法，此方法原料简单易得且繁殖能力强，操作相对来说较为简单，试验时间较短，微生物产酶率高，且不易染菌[3]。
因此,筛选获得具有优良性能的工业微生物是酶法合成核苷类物质的关键。
工业微生物菌株多是通过传统诱变与合理筛选得到[4]，而紫外诱变育种技术是最常用的传统诱变技术之一，其主要原理是使DNA相邻的胸腺嘧啶形成二聚体，阻碍DNA的解链、复制和碱基的正常配对，引起突变[5]。
本研究以大肠杆菌为研究菌株，利用紫外诱变引发突变、紫外分光光度法测定胸苷磷酸化酶活力，有效地筛选出高产胸苷磷酸化酶的大肠杆菌菌株。
实验十一紫外诱变技术及抗药性突变菌株的筛选Ⅰ. 紫外诱变技术一实验目的以紫外线处理细菌细胞为例，学习微生物诱变育种的基本技术。
了解紫外线对细菌细胞的作用。
二实验材料和用具菌株：大肠杆菌（Escherichia coli）培养基：营养肉汤（nutrient broth）固体和液体培养基生理盐水等器皿：10ml及1ml的移液管，无菌试管，无菌培养皿，无菌三角瓶（内有无菌的玻璃珠20~40粒），无菌漏斗（内有两层擦镜纸），无菌离心管，离心机，紫外诱变箱等。
三实验原理以微生物的自然变易作为基础的筛选菌种的机率并不很高。
因为自发突变率小，一个基因的自发突变率仅为10-6~10-10左右。
为了加大突变频率，可采用物理或化学的因素进行诱发突变。
物理因素中目前使用得最方便且十分有效是UV，UV诱变一般采用15w的紫外灭菌灯，其光谱比较集中在253.7nm处，这与DNA的吸收波长一致，可引起DNA分子结构发生变化，特别是嘧啶间形成胸腺嘧啶二聚体，从而引起菌种的遗传特性发生变易。
在生产和科研中可利用此法获得突变株。
四实验内容1、对出发菌株进行处理，制备单细胞悬液；2、紫外线进行处理；3、用平板菌落计数法测定致死率；五 操作步骤（一）出发菌株菌悬液的制备1. 出发菌株移接新鲜斜面培养基，37℃培养16~24h ；2. 将活化后的菌株接种于液体培养基，37℃ 110rpm 振荡培养过夜（约16h ），第二天，以20~30%接种量转接新鲜的营养肉汤培养基，继续培养2~4h ；3. 取4ml 培养液与5ml 离心管中，10000rpm 离心3~5min ，弃去上清液，加4ml 无菌生理盐水，重新悬浮菌体，再离心，弃去上清，重复上述步骤用生理盐水恢复成菌悬液；4. 将上述菌悬液倒入装有小玻璃珠的无菌三角瓶内，振荡20~30min ，以打散细胞；5. 取诱变前的0.5ml 菌悬液进行适当稀释分离，取三个合适的稀释度倾注肉汤平板，每一梯度倾注两皿，每皿加1ml 菌液，37℃倒置培养24~36h ，进行平板菌落计数。
实验二十二大肠杆菌紫外诱变实验【实验目的】初步掌握诱变方案的设计和紫外诱变的实验手段。
理解自发突变和紫外诱变的机理，分析不同诱变目的、诱变手段和诱变筛选在诱变应用中的关系。
了解诱变育种在微生物工业中的作用。
【实验原理】微生物菌种质量优劣对发酵工业具有至关重要的作用，由于自然界中的菌种一般在生产上都有不同程度的缺陷，而且自然突变频率低，突变幅度小，单纯依靠自然界中微生物群体来进行的自然选择有很大的局限性，往往不能满足实际生产的需要。
因此现在的微生物发酵生产菌种绝大多数都是经过人工改造的，而菌种改造有诱变改造和基因改造两方面。
虽然现在基因工程菌已经成为越来越重要的菌种改造方式，但通过物理化学诱变对菌种品质进行改造仍然是工业生产菌重要的来源。
诱变分为物理诱变和化学诱变。
物理诱变采用紫外光、X射线、α射线、β射线、γ射线、快中子和超声波等，其中紫外光诱变因其效果好、实验设备简单等优点而成为应用最广泛的物理诱变剂。
而化学诱变则是采用一些可以和DNA起作用，改变其分子结构，最终引起遗传改变的化学物质对诱变对象进行处理，得到诱变菌种的方法。
实验室中常用的有亚硝酸、硫酸二乙酯、亚硝酸胍等（这3种诱变剂诱变效果依次增加，毒性也依次增大）。
物理诱变往往被分为电离辐射和非电离辐射，常用的电离辐射有X射线、β射线、γ射线、快中子等。
电离辐射的特点是穿透力强，对生物作用分为直接作用和间接作用。
辐射的直接作用是指辐射所产生的直接物理损伤，是由于能量量子直接与染色体作用而造成的原始损伤，是一种物理作用；而辐射的间接作用则是一种化学作用，是由于生物细胞中的水分子受到辐射作用产生各种自由基，这些自由基和溶质分子或直接和染色体发生作用产生遗传损伤。
由于不同作用的时效差别，辐射的作用过程大体可分为物理、物理化学、化学和生物学效应等4个阶段，时效发生可以从10-12s到几年。
辐射中常采用的剂量单位为伦琴（R）。
一个伦琴相当于在00C及101325Pa（760mmHg）下，每立方厘米干燥空气中能产生2.082⨯109个离子对的电离剂量。
实验名称：抗药性突变株的获取和突变率测定姓名：学号：系别：实验日期：同组同学名单:本实验利用紫外线诱变，获得大肠杆菌的链霉素抗性突变株，学习了解微生物诱变育种的基本技术。
试验后，通过计算紫外照射造成的死亡率以及自发突变频率和诱导条件下突变频率，进一步加深对紫外诱导的认识。
【实验目的】1.掌握获取细菌自发和经诱变产生的突变株的基本方法。
2.了解突变株频率和突变率的计算。
3.了解微生物诱变育种的基本技术。
4.【实验材料】1.菌种大肠杆菌（E. coli）2.培养基及试剂牛肉膏蛋白胨液体培养基、牛肉膏蛋白胨固体培养基、蒸馏水、链霉素（母液10 mg/mL；终浓度10 µg/mL）。
3.仪器及用具三角瓶（300 mL）、9 cm培养皿、6 cm培养皿、离心管（1.5 mL）、恒温摇床、恒温培养箱、紫外照射箱、磁力搅拌器、大头针、涂布器、酒精灯【实验方法及步骤】（一）出发菌株培养液的制备1. 取斜面或冻存菌种划平板，获得单克隆一个。
2. 取单克隆，37°C条件下在牛肉膏蛋白胨液体培养基培养8~24h；稀释培养液，取102 ~103 个细菌个体转移到新鲜牛肉膏蛋白胨液体培养基，过夜培养。
（二）培养基的制备倒牛肉膏蛋白胨固体培养基平板（非选择性培养基），以及含有链霉素的牛肉膏蛋白胨固体培养基平板（选择性培养基平板；链霉素终浓度10 µg/mL，在倒平板前加入到培养基中）（三）自发突变的测定取过夜培养液，稀释106倍（用1.5mL离心管装0.99mL 无菌蒸馏水，将10 µL 培养液加入到0.99 mL蒸馏水，震荡或吹打混匀，连续三次），取100µL 涂布在非100µL涂布在选择性培养基平板上。
（四）诱导突变以及测定1. 紫外灯预热20 min。
2. 紫外照射：2 mL细菌培养液放入带有搅拌子的培养皿（6 cm），放置在紫外灯下方的磁力搅拌器上，静止1分钟后开启磁力搅拌仪旋纽进行搅拌，然后打开皿盖，处理15s，盖上皿盖，关闭搅拌和紫外灯。
![[详细讲解]细菌营养缺陷型菌株的诱变和筛选鉴定实验报告](https://img.taocdn.com/s1/m/96df62ccb04e852458fb770bf78a6529647d3574.png)
工业微生物育种实验细菌营养缺陷型菌株的诱变和筛选鉴定关于菌株的几个概念：野生型菌株：从自然界分离到的微生物在其发生突变前的原始状态。
营养缺陷型：野生型菌株经过人工诱变或自然突变失去合成某种营养的能力，只有在基本培养基中补充所缺乏的营养因子才能生长。
原养型：营养缺陷型菌株经回复突变或重组后产生的菌株，其营养要求在表型上和野生型相同关于培养基：基本培养基（minimal medium，MM）：仅能满足微生物野生型菌株生长需要的培养基，用[－]来表示。
完全培养基（complete medium，CM）：凡可满足一切营养缺陷型菌株营养需要的天然或半组合培养基。
用[＋]来表示。
补充培养基（supplemental medium，SM）：凡只能满足相应的营养缺陷型生长需要的组全培养基，它是在基本培养基中加入该菌株不能合成的营养因子而组成。
摘要：本实验选用紫外线为诱变剂，来诱发大肠杆菌突变，并用青霉素法淘汰野生型，逐个测定法检出缺陷型，获得100#大肠杆菌菌株，最后经生长谱法鉴定出该菌株为脯氨酸缺陷型。
关键词：大肠杆菌紫外线营养缺陷型青霉素逐个测定法生长谱法一、实验目的1、了解营养缺陷型突变株选育的原理。
2、学习并掌握细菌氨基酸营养缺陷型的诱变、筛选与鉴定方法。
二、实验原理筛选营养缺陷型菌株一般具有四个环节：诱变处理、营养缺陷性的浓缩、检出、鉴定缺陷型。
本实验选用紫外线为诱变剂，来诱发突变，并用青霉素法淘汰野生型，逐个测定法检出缺陷型，最后经生长谱法鉴定细菌的营养缺陷型。
三、实验器材离心机，紫外线照射箱，冰箱，恒温箱，高压灭菌锅；三角烧瓶，试管，离心管，移液管，培养皿，接种针四、实验材料(一)菌种E.coli(二)培养基、1LB培养液：酵母膏，0.5g；蛋白胨，1g；NaCl，0.5g；水，100ml，pH7.2 121℃灭菌15min22×LB培养液：其它不变，水，50ml。
3基本培养基：葡萄糖0.5 g，(NH4)2SO4 0.1 g，柠檬酸钠0.1 g，MgSO4·7H2O0.02 g，K2HPO4 0.4 g，KH2PO4 0.6 g，重蒸水100 mL，pH 7.2，110℃灭菌20 min。
工业微生物育种实验细菌营养缺陷型菌株的诱变和筛选鉴定|;关于菌株的几个概念：\野生型菌株：从自然界分离到的微生物在其发生突变前的原始状态。
营养缺陷型：野生型菌株经过人工诱变或自然突变失去合成某种营养的能力，只有在基本培养基中补充所缺乏的营养因子才能生长。
原养型：营养缺陷型菌株经回复突变或重组后产生的菌株，其营养要求在表型上和野生型相同关于培养基：基本培养基（minimal medium，MM）：仅能满足微生物野生型菌株生长需要的培养基，用[－]来表示。
完全培养基（complete medium，CM）：凡可满足一切营养缺陷型菌株营养需要的天然或半组合培养基。
用[＋]来表示。
补充培养基（supplemental medium，SM）：凡只能满足相应的营养缺陷型生长需要的组全培养基，它是在基本培养基中加入该菌株不能合成的营养因子而组成。
摘要：本实验选用紫外线为诱变剂，来诱发大肠杆菌突变，并用青霉素法淘汰野生型，逐个测定法检出缺陷型，获得100#大肠杆菌菌株，最后经生长谱法鉴定出该菌株为脯氨酸缺陷型。
关键词：大肠杆菌紫外线营养缺陷型青霉素逐个测定法生长谱法一、实验目的1、了解营养缺陷型突变株选育的原理。
@2、学习并掌握细菌氨基酸营养缺陷型的诱变、筛选与鉴定方法。
二、实验原理筛选营养缺陷型菌株一般具有四个环节：诱变处理、营养缺陷性的浓缩、检出、鉴定缺陷型。
本实验选用紫外线为诱变剂，来诱发突变，并用青霉素法淘汰野生型，逐个测定法检出缺陷型，最后经生长谱法鉴定细菌的营养缺陷型。
三、实验器材离心机，紫外线照射箱，冰箱，恒温箱，高压灭菌锅；三角烧瓶，试管，离心管，移液管，培养皿，接种针四、实验材料(一)菌种(二)培养基、1LB培养液：酵母膏，0.5g；蛋白胨，1g；NaCl，0.5g；水，100ml， 121℃灭菌15min22×LB培养液：其它不变，水，50ml。
3￥4基本培养基：葡萄糖 0.5 g，(NH4)2SO40.1 g，柠檬酸钠 0.1 g，MgSO4·7H2O0.02 g，K2HPO40.4 g，KH2PO40.6 g，重蒸水 100 mL，pH ，110℃灭菌 20min。
一、实验目的1. 理解细菌营养缺陷型突变株的选育原理。
2. 学习并掌握细菌氨基酸营养缺陷型的诱变和筛选方法。
3. 通过实验，提高微生物学实验操作技能。
二、实验原理细菌的营养缺陷型是由于基因突变导致细菌丧失合成某些物质（如氨基酸、维生素、核苷酸等）的能力，因而它们不能在基本培养基上生长，必须补充相应的物质才能生长。
本实验以大肠杆菌为材料，通过紫外线诱变处理，筛选出氨基酸营养缺陷型突变株。
三、实验材料与试剂1. 实验材料：大肠杆菌野生型菌株。
2. 试剂：牛肉膏-蛋白胨培养基、基本培养基、紫外线照射装置、无菌水、青霉素、氨基酸（L-亮氨酸、L-异亮氨酸、L-苏氨酸等）。
四、实验方法1. 诱变处理：将野生型大肠杆菌接种于牛肉膏-蛋白胨培养基中，37℃培养过夜。
取适量菌液，以无菌水稀释至一定浓度，置于紫外线照射装置下，分别照射10S、20S、30S、40S、50S、60S。
照射过程中，注意控制紫外线强度，避免过强或过弱。
2. 培养：将照射后的菌液分别涂布于牛肉膏-蛋白胨培养基上，37℃培养过夜。
3. 筛选：配置基本培养基，添加L-亮氨酸、L-异亮氨酸、L-苏氨酸等氨基酸，使其浓度分别为0.1g/L、0.2g/L、0.5g/L。
将培养过夜的菌落分别接种于上述培养基上，37℃培养过夜。
4. 挑取：观察菌落生长情况，挑取在基本培养基上不生长，而在添加相应氨基酸的培养基上生长的菌落，即为氨基酸营养缺陷型突变株。
五、实验结果与分析1. 诱变处理：经过紫外线照射，部分菌落出现变异，生长形态、大小等发生变化。
2. 筛选：在添加L-亮氨酸的培养基上，部分菌落生长不良；在添加L-异亮氨酸的培养基上，部分菌落生长良好；在添加L-苏氨酸的培养基上，部分菌落生长不良。
这说明部分菌落具有氨基酸营养缺陷。
3. 挑取：挑取在基本培养基上不生长，而在添加L-异亮氨酸的培养基上生长的菌落，进行进一步鉴定。
六、实验结论1. 通过紫外线诱变处理，成功筛选出大肠杆菌的氨基酸营养缺陷型突变株。
紫外诱变大肠杆菌str(链霉素)抗性突变株的筛选一、目的要求1 、观察紫外线对链霉素产生抗性的诱变效应2 、学习并掌握物理诱变育种的方法。
二、基本原理紫外线的波长在200~380 nm 之间，但对诱变最有效的波长仅仅是在253~265 nm，一般紫外线杀菌灯所发射的紫外线大约有80%是254 nm。
紫外线诱变的主要生物学效应是由于DNA 变化而造成的，DNA 对紫外线有强烈的吸收作用，尤其是碱基中的嘧啶，它比嘌呤更为敏感。
紫外线引起DNA 结构变化的形式很多，如DNA 链的断裂、碱基破坏。
但其最主要的作用是使同链DNA 的相邻嘧啶间形成胸腺嘧啶二聚体，阻碍碱基间的正常配对，从而引起微生物突变或死亡。
经紫外线损伤的DNA，能被可见光复活，因此，经诱变处理后的微生物菌种要避免长波紫外线和可见光的照射，故经紫外线照射后样品需用黑纸或黑布包裹。
另外，照射处理后的孢子悬液不要贮放太久，以免突变在黑暗中修复。
三、实验材料(一) 菌种大肠杆菌(二) 培养基（完全培养基）1. 肉膏蛋白胨培养基牛肉膏 0.5 g蛋白胨 1.0 gNaCl 0.5 g水 100 mLpH 7.2100 KPa 、121℃高压蒸汽灭菌20min。
如配制固体培养基需加琼脂1.5%～2%。
如配制半固体培养基则加琼脂0.7%～0.8%。
(三) 主要药品牛肉膏、蛋白胨、NaCl、可溶性淀粉、链霉素。
(四) 主要器皿试管30支、移液管1mL10支、5mL3支、10mL1支、锥形瓶10个、量筒、烧杯、培养皿30个、离心管、20 W 紫外灯、磁力搅拌器、离心机、紫外诱变箱等。
四、实验内容(一) 诱变1. 菌悬液的制备出发菌株移接新鲜斜面培养基，37℃培养16～24h。
取已培养20 h 的活化大肠杆菌斜面一支，用10 mL 生理盐水将菌苔洗下，取4mL 于5mL离心管中离心(3000 r/min)15min，弃上清液，将菌体用无菌生理盐水洗涤2 次，最后制成菌悬液并倒入盛有玻璃珠的锥形瓶中，强烈振荡10 min，以打碎菌块制成单菌悬液，用血球计数板在显微镜下直接计数。
大肠杆菌紫外诱变实验
【实验目的】初步掌握诱变方案的设计和紫外诱变的实验手段。
理解自发突变和紫外诱变的机理，分析不同诱变目的、诱变手段和诱变筛选在诱变应用中的关系。
了解诱变育种在微生物工业中的作用。
【实验原理】微生物菌种质量优劣对发酵工业具有至关重要的作用，由于自然界中的菌种一般在生产上都有不同程度的缺陷，而且自然突变频率低，突变幅度小，单纯依靠自然界中微生物群体来进行的自然选择有很大的局限性，往往不能满足实际生产的需要。
因此现在的微生物发酵生产菌种绝大多数都是经过人工改造的，而菌种改造有诱变改造和基因改造两方面。
虽然现在基因工程菌已经成为越来越重要的菌种改造方式，但通过物理化学诱变对菌种品质进行改造仍然是工业生产菌重要的来源。
诱变分为物理诱变和化学诱变。
物理诱变采用紫外光、X射线、射线、射线、射线、快中子和超声波等，其中紫外光诱变因其效果好、实验设备简单等优点而成为应用最广泛的物理诱变剂。
而化学诱变则是采用一些可以和DNA起作用，改变其分子结构，最终引起遗传改变的化学物质对诱变对象进行处理，得到诱变菌种的方法。
实验室中常用的有亚硝酸、硫酸二乙酯、亚硝酸胍等（这3种诱变剂诱变效果依次增加，毒性也依次增大）。
物理诱变往往被分为电离辐射和非电离辐射，常用的电离辐射有X射线、射线、射线、快中子等。
电离辐射的特点是穿透力强，对生物作用分为直接作用和间接作用。
辐射的直接作用是指辐射所产生的直接物理损伤，是由于能量量子直接与染色体作用而造成的原始损伤，是一种物理作用；而辐射的间接作用则是一种化学作用，是由于生物细胞中的水分子受到辐射作用产生各种自由基，这些自由基和溶质分子或直接和染色体发生作用产生遗传损伤。
由于不同作用的时效差别，辐射的作用过程大体可分为物理、物理化学、化学和生物学效应等4个阶段，时效发生可以从10-12s到几年。
辐射中常采用的剂量单位为伦琴（R）。
一个伦琴相当于在00C及101325Pa（760mmHg）下，每立方厘米干燥空气中能产生个离子对的电离剂量。
此外还有拉德（rad）、尔格（erg）、居里（Ci）等单位。
其换算关系如下：
1rad=100erg/g=10-
次衰变/秒
非电离辐射最典型的就是紫外线，其电磁波谱位置为40~390nm。
而由于DNA分子的紫外吸收峰位于260 nm。
因而波长在200~300 nm之间的紫外线被用于紫外诱变。
紫外诱变时的剂量与所用紫外灯管的功率以及照射距离和照射时间相关，实验中往往采用改变照射时间来改变照射剂量。
由于照射致死率在95%~99%的时候回复突变株出现率最高，因而实践中多用70%~80%的致死率进行诱变。
化学诱变和物理诱变相比主要的差别是诱变的特异性强，往往专一作用于DNA分子的特定结构。
化学诱变主要分为4大类：碱基类似物、烷化剂、移码突变剂和其他类。
由于不同的化学诱变剂性能差别很大，在使用前必须对影响其效果的温度、PH值、光照、溶剂等做清楚的分析，同时对其半衰期、毒性及防护也要充分了解，这样才能保证使用的有效性和人体安全性。
化学诱变的剂量是由使用浓度和处理时间决定的，操作中可以根据需要选择高浓度短时间处理或是低浓度长时间处理。
在诱变中制定好诱变方案是很重要的，诱变育种包括诱变和筛选两步。
首先制定一个明确的筛选目标，因为诱变是不定向的，我们必须采用定向的筛选方法将我们所需要的菌株从原始菌和突变株中分离出来，同时还应考虑选出的菌种在生长速度、温度适应、产孢子等方面不能产生过多不适应生产的变化。
在充分考虑了实验的工作量要求后结合本实验室的人力、物力和时间要求提出诱变和筛选方案。
在筛选方法选择中要考虑到兼顾筛选色工作量和可信度。
当筛选方法可信度高时，往往检测方法是比较繁琐的（尤其是涉及一些蛋白质或氨基酸含量变化的突变类型）。
这时为了提高筛选工作量往往降低筛选的可信度，减少筛选的繁琐程度，而在复筛中进一步加以确定。
根据筛选目的和实验室条件选用合适的诱变剂。
筛选方案确定后，不要经常改变，保持工作的稳定性，这样有利于总结提高。
本实验以大肠杆菌为材料，选择紫外线为诱变剂，进行诱变处理：筛选青霉素抗性菌，绘制致死曲线并计算诱变率。
【实验用具及材料】
1.菌种大肠杆菌（Escherchia coli）
2.实验试剂及培养基BP培养基（牛肉膏蛋白胨培养基），见附录I。
青霉素BP培养基，见附录II。
生理盐水，见附录III。
3.其他用具培养皿、三角瓶、离心管、试管、吸管、取液器、台式离心机、水浴锅、紫外线照射箱等。
【实验方法及步骤】
1.菌体准备
（1）细菌培养：接种E. coli到BP液体培养基（500mL三角瓶装100mL培养基），置370C、200r/min 培养16-18h，这时摇瓶中的菌液密度为107-108个菌/mL。
（2）收集菌体：将三角瓶中的菌液转入离心管中，4000r/min离心10min。
离心后，倒去上清液，加入100 mL无菌生理盐水溶液和玻璃珠将细菌沉淀打匀，待用（取用之前务必摇匀）。
2.细菌计数
（1）菌液稀释：取三角瓶中的菌液0.5 mL，采用10倍稀释法，稀释到10-4-10-6 。
（2）平皿涂布：分取3个稀释度的菌液各0.1 mL加入BP固体培养基平皿中，用无菌涂棒将菌液涂匀。
每个稀释度涂布2个平皿。
将平皿置于370C培养箱中。
培养过夜。
（3）细菌统计：对培养后的平皿进行活菌统计，依照附录IV中的统计原则进行统计，算出原菌液中的菌密度。
3.自发突变取三角瓶中0.1 mL菌液加入到含有青霉素的BP固体培养基平皿中，涂布3个平皿。
依照步骤2）进行细菌培养和计数。
1）诱变处理由于紫外诱变引起的DNA变化有光复活作用，因而在诱变实验中最好在红光下进行操作，操作后将涂布好的平皿用报纸包好后置于370C培养箱中培养，操作过程如下：（1）分别吸取三角瓶中菌液3 mL于4个无菌培养皿内。
将培养皿放在10-15W的紫外灯下：距离30cm左右。
（2）在诱变前先打开紫外灯稳定15-30min（使紫外灯输出功率稳定后进行实验，使致死曲线更准确），将待处理的4培养皿连盖放在紫外灯下灭菌1min，将4个培养皿开盖后进行紫外照射，分别在15s、30 s、1 min和2 min的时候将培养皿的盖子盖上，然后关上紫外灯（如果有条件，应将平皿放在磁力搅拌器上，在照射过程中对菌液进行搅拌，使菌液均匀便于紫外线的作用）。
（3）分别对照射5s、30 s、1 min和2 min的4个培养皿做菌液稀释计数。
分别稀释到10-4、10-3、10-2和10-1进行2个稀释度的涂布，每个涂布2个培养皿，进行培养计数，结合步骤2进行致死曲线绘制（如果有条件，应该做“计数，应做3个稀释度3个重复样的计数）。
（4）将照射后的4个培养皿中的菌液0.1mL分别加入到含有青霉素的BP固体培养基平皿中，涂布3个平皿。
依照步骤2）进行细菌培养和计数。
2）光复活实验操作基本同于步骤4）诱变处理，其中在操作（2）之后将平皿暴露在白光中30min，然后再进行操作（3）之后的操作。
3）实验记录
（1）原菌液计数见表1
【作业及思考题】
（1）紫外诱变中要求菌液深度不超过2mm，为什么？
（2）自发突变和诱变在机理上有什么不同？
（3）比较暗操作和光复活情况下的致死率和抗青霉素突变率的差别。
