实验1-叶绿体的分离与荧光分析

植物叶绿体色素的分析一、实验目的：1、学会叶绿体色素的分离方法。

2、掌握叶绿素的定量测定。

一、3、了解高等植物叶绿体色素的种类组成、性质。

二、实验原理：1、叶绿体色素的提取：（1）原理：叶绿体色素是植物捕获太阳能进行光合作用的重要物质，高等植物的叶绿体色素一般由叶绿素a、叶绿素b、胡萝卜素和叶黄素等组成。

叶绿体色素的提取是利用叶绿体色素能溶于有机溶剂的特性,将待测的植物叶片用研钵研磨让植物组织破碎，利用丙酮的溶解能力将叶绿体色素溶于丙酮中，通过用滤纸过滤分离植物组织碎片，即可以得到叶绿体色素的丙酮粗提液。

（2）步骤：称取新鲜的植物叶子(菠菜等)4g，放入研体中加5ml80%丙酮，少许碳酸钙和石英砂,研磨成匀浆,再加入20ml丙酮，以漏斗过滤到棕色瓶中备用2、叶绿体色素的分离：（1）原理：叶绿体色素的分离提纯一般用层析的方法，其中纸层析是最简单的一种。

当溶剂不断地从纸上流过时，由于混合物中各成分在流动相和固定相间具有不同的分配系数，引起它们的移动速度不同，因而使混合物分离。

（2）步骤：1）取滤纸条(6.5×30cm),在离纸边1.5cm处用铅笔划一直线，在另一端两角分别拴上一根线(见图1)，用毛细管取吸绿素提取液沿着铅笔线划一条样带，使样带宽度在3mm以内，如色素过淡用电吹风吹干后再点数次，直到样带呈深绿色为止。

2）在层析缸中加入四氯化碳20ml及少许无水硫酸钠,然后将滤纸吊在层析缸中,使下端浸入溶剂中,色素点要略高于液面,滤纸条边缘不可碰到层析缸璧(如图2)用聚乙烯薄膜两层封住层析缸,直立于暗处层析。

3）0.5小时后，观察色素带分布(最上端是橙黄色的胡萝卡素，其次是黄色的叶黄素，然后是兰绿色的叶绿素a和黄绿色的叶绿素b)，记录色谱图。

如图所示：3、叶绿体色素的性质（一）荧光现象：叶绿体色素在吸收光能以后可以从基态跃迁到激发态，当处于第一单线态（激发态）的电子再回到基态时其携带的能量将以光的形式放射出来产生荧光，叶绿素荧光的颜色是红色的。

一、实验目的1. 学习叶绿体色素提取和分离的方法。

2. 掌握叶绿体色素的理化性质和定量分析方法。

3. 了解叶绿素在植物光合作用中的作用。

二、实验原理叶绿体是植物细胞中进行光合作用的细胞器，其中含有多种色素，包括叶绿素、类胡萝卜素等。

叶绿素主要吸收红光和蓝紫光，类胡萝卜素主要吸收蓝紫光。

通过测定叶绿体色素的吸收光谱，可以了解叶绿素的含量和种类。

本实验采用分光光度法，利用95%乙醇提取植物叶片中的叶绿体色素，然后通过层析法分离叶绿素a、叶绿素b和类胡萝卜素，最后测定各色素的浓度，以了解叶绿素的含量和种类。

三、实验材料与仪器1. 实验材料：新鲜菠菜叶片、番茄叶片2. 实验仪器：分光光度计、研钵、漏斗、100ml三角瓶、玻璃棒、层析柱、层析板、毛细管、剪刀、镊子、滤纸、吸水纸、移液管、量筒、电子天平四、实验步骤1. 提取叶绿体色素（1）将新鲜菠菜叶片和番茄叶片分别洗净、晾干，剪成小块。

（2）将菠菜叶片和番茄叶片分别称取0.1g，放入研钵中。

（3）加入少量石英砂和碳酸钙粉，再加入3～5ml 95%乙醇。

（4）研磨至组织变白，继续研磨3～5min。

（5）将提取液倒入100ml三角瓶中，用玻璃棒搅拌均匀。

2. 分离叶绿体色素（1）将层析板固定在层析柱上，将滤纸剪成适当大小，覆盖在层析板上。

（2）用移液管吸取少量提取液，用毛细管滴加在层析板上，形成一条细线。

（3）将层析柱置于黑暗环境中，用移液管加入适量无水乙醇，使层析板上的色素溶解并开始分离。

（4）观察层析板上的色素带，分别收集叶绿素a、叶绿素b和类胡萝卜素。

3. 测定叶绿体色素浓度（1）将收集到的叶绿素a、叶绿素b和类胡萝卜素分别置于100ml容量瓶中。

（2）用移液管加入适量95%乙醇，定容至刻度线。

（3）将溶液倒入比色杯中，用分光光度计在特定波长下测定吸光度。

（4）根据吸光度计算叶绿素a、叶绿素b和类胡萝卜素的浓度。

五、实验结果与分析1. 叶绿素a、叶绿素b和类胡萝卜素的吸收光谱图根据实验结果，绘制叶绿素a、叶绿素b和类胡萝卜素的吸收光谱图，分析各色素的吸收特性。

实验十一叶绿体的分离和荧光观察一．实验目的了解细胞匀浆和差速离心分级分离细胞组分的原理。

了解提取叶绿体的基本原理及其过程，通过光学显微镜的观察了解体外分离的叶绿体的一般形态，增加对叶绿体的感性认识。

掌握吖啶橙染色叶绿体的方法。

掌握显微数码拍照的方法。

二．实验内容提取叶绿体，吖啶橙染色，观察染色结果。

显微数码拍照。

三．实验原理将组织匀浆后悬浮在等渗介质中进行差速离心，是分离细胞器的常用方法。

在一定的离心场中，同一时间内，密度和大小不同的颗粒其沉降速度不同。

依次增加离心力和离心时间，就能够使非均一悬浮液中的颗粒按其大小、密度先后分批沉降在离心管底部。

叶绿体的分离应在等渗溶液（0.35mol/LNacl或0.4mol/L 蔗糖溶液）中进行。

离心后可得沉淀的叶绿体。

四．实验方法与步骤1．取嫩叶3g，洗净去柄去叶脉，剪碎放入研钵中。

2．加4ml0.35mol/LNacl，研磨匀浆，尼龙布过滤于离心管中1ml。

3．1000rpm离心2分钟弃去沉淀。

4．3000rpm离心15分钟，弃去上清液，将沉淀用少量0.35mNacl悬浮。

5．提取叶绿体观察：①普通光镜②荧光光镜③加吖啶橙。

6．撕取叶表皮观察：①普通光镜②荧光光镜③加吖啶橙。

a．在普通光镜下，可看到叶绿体为绿色椒榄形，在高倍镜下看到叶绿体内部含有较深的绿色的绿色小颗粒即基粒。

b．在荧光显微镜下，叶绿体发出火红色荧光。

c．加入吖啶橙染后，叶绿体可发也桔红色荧光。

而其中混有的细胞核发出绿色荧光菠菜叶手切片观察。

d．在普通光镜下可以看到三种细胞：表皮细胞：为边缘吐锯齿表的鳞片状细胞。

保卫细胞：为构成气孔的成对存在的肾形细胞。

叶肉细胞：为排成栅状的长形和椭圆形细胞。

5．显微数码拍照。

五．实验结果。

实验名称：叶绿体色素的提取、分离、理化性质系别：机械工程系班级：机械11实验者：潘霖学号：2011010389同组姓名：肖鹤翀实验日期：2011.10.22Ⅰ提取与分离一、实验目的：1.学习应用薄层色谱法分离叶绿体色素的实验方法。

2.了解叶绿素的组成、性质和测定叶绿素有助于理解光合作用的本质。

二、实验原理:叶绿体是进行光合作用的细胞器。

叶绿体中的叶绿素a，叶绿素b，胡萝卜素和叶黄素与类囊体膜结合成为色素蛋白复合体。

这些色素都不溶于水，而溶于有机溶剂，故可用乙醇等有机溶剂提取。

提取液可用薄层色谱法加以分离和鉴别。

薄层层析色谱法是将吸附剂均匀地涂在玻璃板上成一薄层，将此吸附剂薄层作为固定相，把待分离的样品溶液点在薄层板的下端，然后用一定量的溶剂作流动相，将薄层板的下端浸入到展开剂当中。

由于吸附剂对不同物质的吸附能力大小不同，吸附力强的物质相对移动慢一些，而吸附力弱的物质则相对移动快一些，从而使各组分有不同的移动速度而彼此分开。

植物活性成分的分离常用薄层层析法和柱层析法，其中柱层析适用于大量制备。

本实验采用薄层层析色谱法，其中固定相用硅胶预制板。

三、实验材料与试剂:1.新鲜的菠菜叶片。

2.体积分数为95%的乙醇，碳酸钙粉末，展开剂（石油醚：丙酮：苯=7:5:1，体积比）。

3.研钵，漏斗，三角瓶，剪刀，点样毛细管，层析缸，硅胶预制板，滤纸。

四、实验步骤:（一）色素提取液的制备1.取新鲜叶片4~5片，洗净，擦干叶表面，去除中脉剪碎，放入研钵中。

2.向研钵中加入少量CaCO3粉末，再加2~3ml体积分数为95%的乙醇，充分研磨至糊状，再加10~15ml体积分数为95%的乙醇，上清液用漏斗过滤出，残渣再用10ml体积分数为95%的乙醇冲洗一次，一同过滤于三角瓶中，即制成叶绿体色素提取液。

提取液应避光保存，因提取量较大，可用于其他相关实验（如后面的叶绿素理化性质的验证）。

（二）叶绿体色素的分离1.取硅胶预制板一个，用点样毛细管吸取上述提取液，平行于硅胶板的短边，距下边缘1cm处用毛细管划线，保证划线细直。

中国海洋大学实验报告2019年 3 月30 日姓名杨慧慧学号17050031803 系年级海洋生命学院2017 专业生物技术科目细胞生物学实验上课时间周六12节题目实验一叶绿体的分离和荧光观察一、实验目的1.通过植物细胞叶绿体的分离, 了解细胞器分离的一般原理和方法。

2.观察叶绿体的自发荧光和次生荧光, 并熟悉荧光显微镜的使用方法。

二、实验原理1.将组织匀浆后悬浮在等渗介质中进行差速离心，是分离细胞器的常用方法。

2.叶绿体的分离应在等渗溶液中进行, 以免渗透压的改变使叶绿体受到损伤。

3.因为叶绿体有自发荧光，因此用荧光显微镜进行观察。

三、实验用品1.材料：新鲜菠菜。

2.试剂：0.35mol/L氯化钠溶液，0.01%吖啶橙(acridine orange)。

3.器材：(1)主要设备: 普通离心机、组织捣碎机、粗天平、荧光显微镜。

(2)小型器材: 烧杯, 量筒, 滴管, 刻度离心管, 纱布，无荧光载片和盖片。

四、实验步骤与方法一、叶绿体的分离与观察1.选取新鲜的嫩菠菜叶，洗净擦干后去除叶梗脉，称30g于150ml 0.35mol/L NaCl溶液中，装入组织捣碎机。

2.低速匀浆3~5min。

3.将匀浆用6层纱布过滤于500ml烧杯中。

4.每组取滤液4ml，1000r/min下离心2min，弃去沉淀。

5.将上清液在3000r/min下离心5min，弃去上清液，沉淀即含叶绿体(混有部分细胞核)。

6.将沉淀用0.35mol/L NaCl溶液悬浮。

7.取叶绿体悬液一滴滴于载玻片上，加盖玻片后即可在普通光镜和荧光显微镜下观察。

(1)在普通光镜下观察。

(2)在荧光显微镜下观察叶绿体的直接荧光。

(3)在荧光显微镜下观察叶绿体的间接荧光：取叶绿体悬液一滴滴在无荧光载片上，再滴加一滴0.01%吖啶橙荧光染料, 加盖片后即可在荧光显微镜下观察。

二、菠菜叶手撕片观察轻轻撕取新鲜嫩菠菜叶的表皮，展平置于载玻片上，滴加1~2滴0.35mol/L NaCl溶液，加盖片后置显微镜下观察。

第1篇一、实验目的1. 了解叶绿体的基本结构、功能和生理特性。

2. 掌握叶绿体色素的提取、分离和鉴定方法。

3. 学习使用显微镜观察叶绿体的形态和分布。

二、实验原理叶绿体是植物细胞中的一种重要细胞器，负责光合作用，将光能转化为化学能，为植物生长提供能量。

叶绿体主要由类囊体、基质和基质蛋白组成，其中类囊体是光合作用的主要场所。

叶绿体中含有多种色素，如叶绿素、类胡萝卜素等，这些色素对光的吸收和传递起着重要作用。

三、实验材料与仪器1. 实验材料：新鲜植物叶片（如菠菜、甘蓝等）、酒精、碳酸钙、石英砂、蒸馏水、滤纸、剪刀、研钵、漏斗、三角瓶、烧杯、显微镜、载玻片、盖玻片、滴管等。

2. 实验仪器：显微镜、研钵、漏斗、三角瓶、烧杯、剪刀、研钵、滤纸、载玻片、盖玻片、滴管等。

四、实验步骤1. 叶绿体色素的提取与分离（1）取新鲜植物叶片1克，洗净、擦干，去掉中脉，剪碎，放入研钵中。

（2）加入少量石英砂、碳酸钙粉和2-3 mL 95%乙醇，研磨至糊状。

（3）再加入2-3 mL 95%乙醇，继续研磨，直至形成均匀的糊状物。

（4）将糊状物倒入漏斗中，用滤纸过滤，收集滤液。

（5）将滤液倒入三角瓶中，加入少量碳酸钙粉，充分搅拌，静置一段时间。

（6）取少量滤液，滴在滤纸上，用铅笔轻轻画出滤液滴的形状，作为色素带的标记。

2. 叶绿体色素的鉴定（1）观察滤纸上的色素带，记录各色素带的颜色、宽度和位置。

（2）将滤纸上的色素带与标准色素带进行对比，确定各色素带的成分。

3. 叶绿体的观察（1）取新鲜植物叶片，制作临时装片。

（2）将装片置于显微镜下，观察叶绿体的形态、大小、分布和数量。

五、实验结果与分析1. 叶绿体色素的提取与分离实验中，从新鲜植物叶片中成功提取了叶绿体色素，并分离出叶绿素a、叶绿素b、胡萝卜素和叶黄素等色素。

2. 叶绿体色素的鉴定通过观察滤纸上的色素带，并与标准色素带进行对比，确定各色素带的成分。

实验结果与理论相符。

3. 叶绿体的观察在显微镜下观察到叶绿体呈椭球状，分布在细胞质基质中，数量较多。

叶绿体的分离纯化及荧光观察叶绿体是植物细胞中的一种细胞器，它是进行光合作用的主要场所。

叶绿体具有一定的自复制能力，可以独立分离出来，纯化叶绿体样品可以方便地进行进一步的实验研究。

本文将详细介绍叶绿体的分离、纯化以及荧光观察的方法。

一、叶绿体的分离1.实验材料准备为了分离叶绿体，我们需要充足的植物组织样品。

可以选择新鲜的叶片或者细胞培养物作为实验材料。

同时，需要准备好一系列试剂，例如缓冲液、葡萄糖、EDTA、PEG等。

2.组织破碎和提取液的准备首先，将植物组织样品冷冻在液态氮中，然后用超声波处理器将样品破碎。

接下来，将破碎的样品用缓冲液溶解，加入适量的葡萄糖和EDTA。

将溶解后的样品在低温条件下离心，然后取出上清液。

3.叶绿体的沉淀将提取液中的上清液用PEG逐渐沉淀叶绿体。

首先加入PEG溶液，并轻轻搅拌。

然后，将样品在低温条件下离心，离心后会出现一个绿色的沉淀。

这个沉淀就是叶绿体。

4.叶绿体的洗涤和纯化将叶绿体的沉淀用缓冲液洗涤数次，然后用离心将叶绿体沉淀下来。

最后，将沉淀的叶绿体用缓冲液悬浮，即可得到纯化的叶绿体样品。

二、叶绿体的荧光观察1.荧光探针的准备为了观察叶绿体的荧光，我们需要准备好合适的荧光探针。

通常使用的探针有二苯基苯酚（DPBF）和二聚(4-乙基-5-（4-甲基吡啶氧基）-2-溴脱氧葡萄糖（DAB）等。

2.荧光探针的添加将纯化的叶绿体置于含有荧光探针的溶液中，静置一段时间。

荧光探针会与叶绿体中的一些分子发生作用，从而产生荧光。

3.荧光观察使用荧光显微镜观察叶绿体的荧光。

将样品放置于荧光显微镜下，设置合适的激发波长和观察波长。

然后观察荧光显微镜中的图像，即可看到叶绿体的荧光。

4.结果分析通过观察叶绿体的荧光，可以得到关于叶绿体活性和光合作用效率的信息。

例如，如果观察到荧光强度较高，可以推测叶绿体的光合作用效率较低。

总结：叶绿体的分离、纯化及荧光观察是研究植物生物学和光合作用的重要方法之一、通过正确的操作流程和合适的实验材料，可以得到纯化的叶绿体样品，并通过荧光观察了解叶绿体的活性和光合作用效率。

姓名班级 13级生命基地班学号同组者：科目细胞生物学实验实验题目叶绿体的分离与荧光观察【实验题目】叶绿体的分离与荧光观察【实验目的】1、通过对植物细胞叶绿体的分离，了解细胞器分离的一般原理和方法。

2、观察叶绿体的自发荧光和次生荧光3、熟悉荧光显微镜的使用方法。

【实验材料与用品】1. 器材：离心机、组织捣碎机、天平、荧光显微镜、烧杯、量筒、胶头滴管、刻度离心管六层纱布，载玻片、盖玻片等2. 材料：新鲜菠菜3. 试剂：0.35 mol/L氯化钠溶液，0.01％吖啶橙(acridine orange)【实验原理】I.叶绿体分离的原理匀浆破碎细胞：利用差速离心方法分离等渗介质中的悬浮颗粒，收集类叶绿体大小的颗粒，得到叶绿体。

差速离心:颗粒在离心场中的沉降速率取决于颗粒的大小、形状和密度，也同离心力以及悬浮介质的黏度有关。

在一给定的离心场中，同一时间内，密度和颗粒大小不同的颗粒其沉降速度也不同。

依次增加离心力和离心时间，就能使非均一悬浮液中的颗粒按其大小、密度先后分批沉降在离心管底部，分批收集即可获得各种亚细胞组分。

叶绿体的分离应在等渗溶液中进行（0.35mol/L氯化钠溶液或0.4mol/L蔗糖溶液），以免渗透压的改变使叶绿体受到损伤。

分离过程最好在0-5℃条件下进行：如果在室温下，要姓名班级 13级生命基地班学号同组者：科目细胞生物学实验实验题目叶绿体的分离与荧光观察迅速分离和观察。

II.差速离心特点：介质密度均一，速度由高到低，逐级离心；用途：分离大小相差悬殊的细胞和细胞器；沉降顺序：核---线粒体---溶酶体和过氧化物酶体---内质网与高尔基体---核蛋白体，可将细胞器初步分离，常需要进一步通过密度梯度离心再进行分离纯化。

III.①荧光的概念光致发光：某些物质在照射下，吸收光能进入激发态，当从激发态回到基态时，可以以电磁辐射的形式释放出吸收的光能，这种现象称为“光致发光”。

紫外辐射、可见光以及红外辐射均可引起光致发光，如磷光和荧光。