蛋白纯化策略和工艺

recovery （%）
Purification factor
回收率&纯化因子
纯化工具
手动纯化: ·重力纯化 ·磁珠纯化 ·离心纯化
优点: ·简单易掌握 ·经济
自动纯化: ·预装柱配合层析设备
优点: ·自动化——解放人力更高效 ·洗脱手段多样化——结果更优 ·高重复性，结果可追溯
总结
·纯化目的&目的产物特性
明确纯 化目的
了解纯 化产物 的特性
CIPP纯 化策略
建立有 效分析 方法
确立最 终的纯 化方案
明确纯化目的
Mass spectrometry
Antigen for immunization
Functional studies
Amount
pg
ng
ug
Structural studies
mg
Therapeutic protein
g kg
Purity
Moderate ＞ 80%
High ＞ 95% -99%
Very high ＞ 99%
Activity
Often not necessary
Homogeneity Often not necessary
rigid requirements rigid requirements
了解目的产物的特性
不同pH条件下，目的蛋白与DEAE柱的结合情况
优化条件
不同洗脱方式对蛋白纯化结果的影响
有效的分析方法
纯化追踪表
Purification step
Volume （ml）
Protein Conc. （mg/ml）
Amount total
Protein（mg）
Total activity （U）
Specific activity （U/mg）
蛋白纯化策略和工艺
吕虎 2017.8.18
五大层析原理
内容: ·简介 ·蛋白纯化策略 ·如何建立纯化方案 ·纯化工具 ·总结
简介
早期的蛋白纯化 1789-1940s
今天的蛋白纯化
层析纯化 1950s-1980s
决定因素
层析技术
蛋白纯化策略
蛋白纯化策略
CIPP
KEEP SIMPLE
关键因子
·CIPP纯化策略 √Capture、Intermediate Purification and Polishing √综合运用多种层析技术 √互相衔接 √保持简单
·纯化工具
思考： 如果要得到一个去GST标签的蛋白，该如何设计纯化实验？
如何选择层析柱？ 如何搭配层析设备？ 中试放大？
ห้องสมุดไป่ตู้
Thank you for your listening!
目的产物的特性: ·分子量 ·等电点 ·可溶性 ·稳定性 ·…
起始条件: ·样品量 ·pH ·离子强度 ·成分 ·关键杂质 ·…
CIPP纯化策略
筛选层析技术 筛选填料 优化条件
筛选层析技术：标签蛋白
筛选层析技术:非标签蛋白
筛选填料
筛选填料
筛选填料
不同HIC填料分离同种蛋白质的分离结果
优化条件
Phase 1：Capture
分辨率
Phase 2：Intermediate Purification
速度
载量
回收率 Phase 3：Polishing
层析技术的推荐
交替运用互补技术，合理衔接
减少样品处理，尽量简单化
综合考虑起始和结束条件的衔接
设计合理的纯化路线
互相衔接，减少中间处理
建立纯化方案