含组氨酸标签的蛋白的诱导表达及纯化
一.用IPTG诱导启动子在大肠杆菌中表达克隆化基因
所需特殊试剂：1M IPTG
1.将目的基因与IPTG诱导表达载体连接，构成重组质粒并转化相应的
表达用的大肠杆菌。将转化体铺于含相应抗生素的LB平板，37℃培
养过夜。通过酶切序列分析等筛选带有插入片段的转化体。
2.分别挑取对照菌和重组菌1个菌落，接种于1ml含有相应抗生素的LB
培养液中，37℃通气培养过夜。
3.取100微升过夜培养物接种于5ml含有相应抗生素的LB培养液中（各
10份），适当的温度（20－37℃）震荡培养4小时，至对数中期（A550
＝0.1-1.0）。
4.对照菌和重组菌各取1ml未经诱导的培养物于离心管中，剩余培养物
中加入IPTG至终浓度分别为0.5，1.0，1.5，2.5，3.0，3.5，4.0，4.5，
5.0mM相同的温度继续通气培养。
5.在诱导的1，2，3，4，5个小时取1ml样品于Ep管中。
细菌的生长速率严重影响外源蛋白的表达，因此必须对接种菌量，诱
导前细菌生长时间和诱导后细菌密度进行控制。生长过度或过速会加
重细菌合成系统的负担，导致包涵体的形成。生长温度可能是影响大
肠杆菌高度表达目的蛋白的最重要因素。低温培养能在一定程度上抑
制包涵体的形成。IPTG的浓度对表达水平的影响也非常大。所以通过
试验确定最佳的培养条件是很必要的。
6.将所有样本室温最高速度离心1分钟，弃上清，沉淀重悬于100微升
1×SDS蛋白上样缓冲液中，100℃加热5分钟，室温最高速度离心1
分钟，取15微升样品上样于SDS聚丙烯酰胺凝胶，用SDS－PAGE
观察表达产物条带，从而确定优化的培养条件。
二.大量表达靶蛋白
1.取保存的重组大肠杆菌菌液150微升接种于30毫升含相应抗生素的
LB培养液中，在100毫升锥形瓶中，300rpm，37℃通气过夜培养。
2.取16毫升过夜培养物接种于800ml含相应抗生素的LB培养液，在2L
的锥形瓶中用预实验所确定的最佳诱导温度，300rpm，通气培养4小
时，至对数生长中期。
3.以预实验确定的最佳IPTG浓度，最佳时间和最佳温度诱导表达靶蛋
白。
4.收集菌液，4℃，5000g（5500rpm）离心15分钟收集沉淀，－70℃保
存。
三.细菌破碎和蛋白质溶解
所需特殊试剂：
非变性裂解液：50mM NaH2PO4 ,300 mM Nacl ,10 mM咪唑，pH8.0
超声破碎液：50mM NaH2PO4 ,300 mM Nacl , pH8.0
1.每200ml菌液离心所得沉淀以10ml非变性裂解液充分重悬，同时加
入蛋白酶抑制剂PMSF至终浓度1mM。
2.超声破碎细菌，功率选择在稍低于溶液产生泡沫的水平。工作时间5
秒，间隙时间5秒，总时间20分钟（破碎时间一般不宜超过10分钟，
菌量不超过1g）。整个超声过程中探头离烧杯底部1厘米为佳，烧杯
置于冰浴中。
3.超声破碎后，取1滴菌液于载玻片上，烤干后用结晶紫染色观察超声
破碎是否完全，大肠杆菌是否被破碎成球状或球杆状。破碎不完全可
适当延长超声破碎时间。
4.将细菌破碎液以10000rpm，30分钟，4℃离心，收集上清。用等同于
上清体积的超声破碎液重悬沉淀。
5.分别取10微升上清和沉淀重悬液用于SDS-PAGE检测，以确定是包
涵体表达还是上清表达。其余置于－70℃保存。
四. Ni-NTA亲和纯化带组氨酸标签蛋白的纯化策略
（一）若为上清表达
所需特殊试剂：
非变性裂解液：50mM NaH2PO4 ,300 mM Nacl ,10 mM咪唑，pH8.0
Wash buffer: 50mM NaH2PO4 , 300 mM Nacl ,20 mM咪唑，pH8.0
Elution buffer: 50mM NaH2PO4 ,300 mM Nacl ,250mM咪唑，pH8.0
1.离心后上清蛋白与Ni-NTA混匀，冰水浴中于脱色摆床上轻摇1小时，
使之充分混匀结合。为了完全去除杂质，离心两次或离心后用0.4微米
微孔滤膜过滤。
2.将混合物转移至层析柱中，让液体自然流出，速度可稍慢（5－6秒/滴），
收集流出液体。可以取样进行SDS-PAGE，看蛋白挂柱情况。
3.用Wash buffer 洗涤层析柱，洗涤量约为胶体积的50－100倍，以便充
分洗去杂蛋白。为了洗的更彻底，可以把胶混悬后再让液体流出，中间
可以重复数次。因为胶板结之后，洗涤效果可能会差些。
4.用Elution buffer 洗柱，用1.5mLEP管收集洗脱液，直至A280<0.1。
5.测定收集的洗涤液和洗脱液的A280，选择A280变化明显的管取样进行
SDS-PAGE，分析组氨酸标签蛋白的分布。根据A280和电泳图选择合并
A280相近的管，弃掉没有目的蛋白的管。目的蛋白的脱盐处理可以用透
析，也可以超滤，还可以过分子筛。如果需要更大的蛋白浓度，可以使
用超滤的办法。收集的蛋白-20℃保存。
说明：只经过Ni-NTA纯化，所得蛋白一般不纯，往往混有杂蛋白。这时可以考虑进一步的纯化措施，比如DEAE,分子筛，疏水层析等。（二）若为包涵体表达
所需特殊试剂：
细胞裂解液：50mM Tris-Hcl ,100 mM Nacl ,0.5%Triton X-100, pH 8.0
变性裂解液：10mM NaH2PO4 ,10mM Tris-Hcl，8M尿素，pH8.0
复性液：100mM NaH2PO4，10mM Tris-Hcl，2 mM还原型谷光甘肽，
0.2 mM氧化型谷光甘肽
Wash buffer: 100mM NaH2PO4，10mM Tris-Hcl，pH6.3
Elution buffer: 100mM NaH2PO4，10mM Tris-Hcl，pH4.5
