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课题：4.1.1蛋白质的分离与纯化方法生物成分的分离与测定技术导学案一、学习目标：二、知道蛋白质的分离常用的细胞破碎的方法，蛋白质抽提方法，掌握蛋白质的分离与纯化方法。
二、知识构成：1．蛋白质的分离常用的细胞破碎的方法有：根据蛋白质的不同特性，分别可选择哪些抽提方法？、、蛋白质的纯化主要是根据之间以及之间在、、、等方面存在的差异进行的。
常用的方法包括、、等。
2．用电泳分离纯化蛋白质时，泳动速度主要取决于，即。
此外，、等因素对泳动速度也有影响。
3．血清蛋白醋酸纤维薄膜电泳的实验的基本步骤包括：、、、、、、、、、。
4．浸泡醋酸纤维薄膜前，用笔做记号是在(填“光泽面”或“非光泽面”)；点样是在(填“光泽面”或“非光泽面”)；平悬薄膜时，(填“光泽面”或“非光泽面”)朝上。
5．经电泳后，可以在薄膜上看到条色带，它们分别是、、、、。
'6．植物芳香油的提取方法有和等。
三、学法和自检：本节内容主要通过看书、分析蛋白质的提取、分离、纯化的不同方法。
动手试一试：[1]盐析法分离蛋白质的原理是( )A．破坏蛋白质的一级结构B．破坏蛋白质的二级结构C．破坏蛋白质水化膜而改变溶解度D．使蛋白质发生变性沉淀[2]利用透析法将蛋白质和其他小分子物质分离的原理是( )A. 利用蛋白质分子不能透过半透膜的特性B．利用蛋白质分子的水溶性C．利用蛋白质分子的胶体性D．利用蛋白质分子所带电荷[3]．下列关于血清蛋白醋酸纤维薄膜电泳实验的说法不正确的是( )A．实验所用的巴比妥缓冲液的pH为8．6 B．点样是在薄膜的光泽面上进行的C．实验后可以得到五条色带D．整个实验最关键的步骤是点样[4]．有一混合蛋白质溶液，各种蛋白质的pH分别为4．5、5．2、6．6、7．2，电泳时欲使其中三种泳向正极，则缓冲液的pH应该是( ) A．2．0 B．5．0 C．6．0 D．7．0四、、学习小结和课外作业：1、学习小结：2、上本作业：列举蛋白质粗提取时次报的破碎、蛋白质的抽提、纯化方法。
对蛋白质分离纯化的方法
蛋白质分离纯化的方法有很多种，常用的方法如下：
1. 溶液的分离：利用差速离心、过滤或超滤等方法，将悬浮液或溶液中的蛋白质与其他组分分离开。
2. 色谱层析：将蛋白质溶液经过色谱柱，利用分子大小、电荷、亲疏水性等物理性质作用于柱内填充物，实现蛋白质的分离纯化。
3. 电泳：利用蛋白质在电场中的电荷性质以及大小和形状的差异，在凝胶电泳或毛细管电泳中进行分离纯化。
4. 凝胶过滤：利用凝胶的孔隙结构，根据蛋白质的分子大小将蛋白质分离开。
5. 亲和层析：利用蛋白质与亲和配体之间的特异性相互作用实现分离纯化。
6. 离子交换层析：利用蛋白质与离子交换树脂之间的电荷相互作用实现分离纯化。
7. 逆流电泳：利用蛋白质在电场中的电荷性质和溶液中的流动，通过逆流电泳系统实现蛋白质的分离纯化。
8. 蛋白质沉淀：利用加入盐、酸、有机溶剂等物质改变蛋白质的溶解度，使其沉淀下来。
以上是常用的蛋白质分离纯化方法，不同方法适用于不同的蛋白质特性和实验目的。
需要根据具体情况选择合适的方法进行操作。
蛋白质分离纯化的一般程序可分为以下几个步骤:(一)材料的预处理及细胞破碎分离提纯某一种蛋白质时,首先要把蛋白质从组织或细胞中释放出来并保持原来的天然状态,不丧失活性。
所以要采用适当的方法将组织和细胞破碎。
常用的破碎组织细胞的方法有: 1. 机械破碎法这种方法是利用机械力的剪切作用,使细胞破碎。
常用设备有,高速组织捣碎机、匀浆器、研钵等。
2. 渗透破碎法这种方法是在低渗条件使细胞溶胀而破碎。
3. 反复冻融法生物组织经冻结后,细胞内液结冰膨胀而使细胞胀破。
这种方法简单方便,但要注意那些对温度变化敏感的蛋白质不宜采用此法。
4. 超声波法使用超声波震荡器使细胞膜上所受张力不均而使细胞破碎。
5. 酶法如用溶菌酶破坏微生物细胞等。
(二) 蛋白质的抽提通常选择适当的缓冲液溶剂把蛋白质提取出来。
抽提所用缓冲液的pH、离子强度、组成成分等条件的选择应根据欲制备的蛋白质的性质而定。
如膜蛋白的抽提,抽提缓冲液中一般要加入表面活性剂(十二烷基磺酸钠、tritonX-100等),使膜结构破坏,利于蛋白质与膜分离。
在抽提过程中,应注意温度,避免剧烈搅拌等,以防止蛋白质的变性。
(三)蛋白质粗制品的获得选用适当的方法将所要的蛋白质与其它杂蛋白分离开来。
比较方便的有效方法是根据蛋白质溶解度的差异进行的分离。
常用的有下列几种方法:1. 等电点沉淀法不同蛋白质的等电点不同,可用等电点沉淀法使它们相互分离。
2. 盐析法不同蛋白质盐析所需要的盐饱和度不同,所以可通过调节盐浓度将目的蛋白沉淀析出。
被盐析沉淀下来的蛋白质仍保持其天然性质,并能再度溶解而不变性。
3. 有机溶剂沉淀法中性有机溶剂如乙醇、丙酮,它们的介电常数比水低。
能使大多数球状蛋白质在水溶液中的溶解度降低,进而从溶液中沉淀出来,因此可用来沉淀蛋白质。
此外,有机溶剂会破坏蛋白质表面的水化层,促使蛋白质分子变得不稳定而析出。
由于有机溶剂会使蛋白质变性,使用该法时,要注意在低温下操作,选择合适的有机溶剂浓度。
蛋白质分离纯化设计1. 简介蛋白质分离纯化是一项重要的实验技术，在生物医药、食品科学、农业等领域有着广泛的应用。
通过对蛋白质进行分离纯化，可以获得单一纯度的蛋白质用于后续研究及应用。
本文将详细介绍蛋白质分离纯化的设计方法和常用技术，包括样品准备、分离方法选择、纯化步骤设计等。
同时，我们还将讨论常见的挑战和解决方案，以及如何评估分离纯化效果。
2. 样品准备在进行蛋白质分离纯化前，首先需要准备好样品。
样品的选择和准备对于后续分离纯化过程非常重要。
2.1 选择合适的样品样品可以来自细胞、组织、体液、培养基等。
在选择样品时，需要考虑到蛋白质的种类、表达水平、目标纯化程度以及后续实验需要。
2.2 样品预处理样品在分离纯化前需要进行预处理，以去除可能干扰纯化过程的杂质。
常用的预处理方法包括细胞破碎、离心、除去非蛋白质成分等。
预处理方法的选择应根据样品类型和后续纯化方法进行优化。
3. 分离方法选择根据蛋白质分离的原理和样品特性，我们可以选择合适的分离方法。
常见的分离方法包括离子交换层析、凝胶过滤、透析、亲和层析等。
3.1 离子交换层析离子交换层析是一种基于蛋白质带电性质的分离方法。
可以根据蛋白质的以阴离子或阳离子带电来选择合适的离子交换树脂，实现不同蛋白质的分离纯化。
3.2 凝胶过滤凝胶过滤是一种基于蛋白质大小的分离方法。
通过选择适当的孔径大小的凝胶，可以分离不同分子大小的蛋白质。
3.3 透析透析是一种基于蛋白质分子量和溶液成分的分离方法。
通过选择适当的膜材料和透析缓冲溶液，可以实现蛋白质与小分子化合物的分离。
3.4 亲和层析亲和层析是一种基于蛋白质与配体之间的特异性结合来分离纯化的方法。
选择合适的亲和配体，可以选择性地结合目标蛋白质，从而实现其分离纯化。
4. 纯化步骤设计在选择合适的分离方法后，需要设计纯化步骤来实现目标蛋白质的分离和纯化。
纯化步骤的设计应根据分离方法的特点和目标蛋白质的性质进行优化。
4.1 样品加载将预处理的样品通过适当的装载方式加载到分离纯化柱中，如使用注射器将样品缓慢注入。
蛋白质分离纯化的技术前言蛋白质是生物体内非常重要的大分子有机物质，具有各种生物学功能，如结构支持、催化反应、传递信息、运输物质及免疫防御。
而蛋白质的研究和应用，早已成为生命科学的热门领域。
然而，大多数生物体中的蛋白质都混杂着众多的其他大分子物质，为了研究或应用某种特定蛋白质，就需要将它从其它物质中分离纯化出来。
今天我们就要来讲一讲蛋白质分离纯化的技术。
一、蛋白质分离的基本原理蛋白质分离的基本原理是利用不同的性质来分离具有不同特性的蛋白质。
蛋白质的各种性质包括分子大小、分子形状、电荷、亲疏水性、氨基酸序列等。
根据这些不同的性质，分别选择不同的分离纯化方法，可以实现不同程度的分离纯化效果。
二、蛋白质分离纯化技术的分类根据分离方式的不同，蛋白质分离纯化技术可以分为以下几类：1. 分子筛层析：分子筛层析是根据蛋白质的分子大小、形状来进行分离，其原理是在一定的缓冲液中，将特定孔径大小的陶瓷或聚合物微球填充进层析柱，根据蛋白质的分子大小，从层析柱中流出不同的蛋白质。
这种方法可以使蛋白质得到较好的分离纯化，但需要考虑蛋白质的保护。
2. 表面等电聚焦（IEF）：表面等电聚焦是根据蛋白质的等电点来进行分离，其原理是在聚丙烯酰胺凝胶电泳板上加上一组垂直于电泳方向的电场，在酸性一端放置一种酸性缓冲液，碱性一端放置一种碱性缓冲液，中间分别加入样品，蛋白质会在等电点处停留，使得不同等电点的蛋白质得到了分离和收获。
这种方法可以进行多品种、高分辨率的蛋白质分离。
3. 亲和层析：亲和层析是根据蛋白质与其他化合物的特异性相互作用进行分离，其原理是特定的化合物置于层析柱中，当特定的蛋白质与化合物结合时，蛋白质就可以纯化出来。
如在层析柱中放入钙离子，就可以纯化出骨钙蛋白，并且可以通过控制钙离子浓度来实现蛋白质的分离。
4. 透析：透析是将样品分子分离于透析膜之内或之外的方法。
通常将混合物放置于透析袋内，在培养基、缓冲液等适当环境中，透析袋内的小分子会从透析膜渗透出去，而较大的蛋白质则被留在透析袋内。
蛋白质的分离纯化一，蛋白质（包括酶）的提取大部份蛋白质都可溶于水、稀盐、稀酸或碱溶液，少数与脂类结合的蛋白质那么溶于乙醇、丙酮、丁醇等有机溶剂中，因些，可采纳不同溶剂提取分离和纯化蛋白质及酶。
（一）水溶液提取法稀盐和缓冲系统的水溶液对蛋白质稳定性好、溶解度大、是提取蛋白质最常用的溶剂，通常用量是原材料体积的1-5倍，提取时需要均匀的搅拌，以利于蛋白质的溶解。
提取的温度要视有效成份性质而定。
一方面，多数蛋白质的溶解度随着温度的升高而增大，因此，温度高利于溶解，缩短提取时间。
但另一方面，温度升高会使蛋白质变性失活，因此，基于这一点考虑提取蛋白质和酶时一般采用低温（5度以下）操作。
为了避免蛋白质提以过程中的降解，可加入蛋白水解酶抑制剂（如二异丙基氟磷酸，碘乙酸等）。
下面着重讨论提取液的pH值和盐浓度的选择。
1、pH值蛋白质，酶是具有等电点的两性电解质，提取液的pH值应选择在偏离等电点两侧的pH 范围内。
用稀酸或稀碱提取时，应防止过酸或过碱而引起蛋白质可解离基团发生变化，从而导致蛋白质构象的不可逆变化，一般来说，碱性蛋白质用偏酸性的提取液提取，而酸性蛋白质用偏碱性的提取液。
2、盐浓度稀浓度可促进蛋白质的溶，称为盐溶作用。
同时稀盐溶液因盐离子与蛋白质部分结合，具有保护蛋白质不易变性的优点，因此在提取液中加入少量NaCl等中性盐，一般以摩尔。
升浓度为宜。
缓冲液常采用磷酸盐和碳酸盐等渗盐溶液。
（二）有机溶剂提取法一些和脂质结合比较牢固或分子中非极性侧链较多的蛋白质和酶，不溶于水、稀盐溶液、稀酸或稀碱中，可用乙醇、丙酮和丁醇等有机溶剂，它们具的必然的亲水性，还有较强的亲脂性、是理想的提脂蛋白的提取液。
但必需在低温下操作。
丁醇提取法对提取一些与脂质结合紧密的蛋白质和酶专门优越，一是因为丁醇亲脂性强，专门是溶解磷脂的能力强；二是丁醇兼具亲水性，在溶解度范围内（度为10%，40度为%）可不能引发酶的变性失活。
另外，丁醇提取法的pH及温度选择范围较广，也适用于动植物及微生物材料。
蛋白质分离纯化How to detect, analyze and prepare?Different purposes, different protocols Detective/analytical level: nanogram(ng) or picogram(pg)Preparative level: milligram (mg)Protein detection/analysis:1, Hybridization: Western blot2, Immunological Techniques: Elisa & Co-IP3, electrophoresisSDS PAGE, 2-D gel, CE, IEF4, chromatography: HPLC, FPLC,5, Spectrometry: DLS, NMR, Mass-Spect, LC-MS 6, X-ray crystallography…Western blot: Protein-proteinThis method is dependent on the use of a high-quality antibody directed against a desired protein.Southern blot: DNA-DNA (Edward Southern. Detection of specific sequences among DNA fragments separated by gel electrophoresis.J Mol Biol. 1975 Nov 5;98(3):503-17)Northern blot: DNA-RNASDS-PAGE (sodium dodecyl(lauryl) sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis)has a number of uses, which include:•Establishing protein size•Protein identification•Determining sample purity•Identifying disulfide bonds•Quantifying proteins•Blotting applicationsN-terminal protein sequencing by Edman chemistry 1.Samples can be supplied in solution or as membrane blots with more than 90% purities(μg level)2.If the sample is not pure enough, it might be separated with SDS-PAGE or 2-D gel electrophoresis and then electrotransfered to ProBlottTM PVDF membrane3.The length limit of the sequence obtained depends on the sample amount, the protein properties etc, ranging from 30 to 70 residues.pI: IEF (Isoelectric focusing)Focusing separation of species in an inhomogeneous medium (pH-gradient) according to their isoelectric points (pI).Molecular weight:SDS PAGE (polyacrylamide gel electrophoresis) HPLC (high pressure liquid chromatography)MS (Mass spectrometry)Protein concentration detection:BSA methodCo-efficientYeast ORF Ygr271c-apMDANTLNVSFEEILKGKKLDEDSIGLTLSP DKDHEDGSQVSPTQDRKELDQVVGEDEK DDFFENo W or Y, extinction coefficient is 0Absorption spectra of the aromatic amino acids in the near-ultraviolet regionFrom D. Wetlaufer, Adv. Protein Chem. (1962) 17:303-390.©1962 Academic PressUV detectionWhat is chromatography (色谱)?it is a broad range of physical methods used to separate and/or to analyze complex mixtures. The components to be separated are distributed between two phases: a stationary phase (固定相) bed and a mobile phase (流动相)which percolates (filters) through the stationary bed.How Does It Work?A mixture of various components enters a chromatography process, and the different components are flushed through the system at different rates.These differential rates of migration as the mixture moves over adsorptive materials provide separation. Repeated sorption/desorption acts that take place during the movement of the sample over the stationary bed determine the rates. The smaller the affinity a molecule has for the stationary phase, the shorter the time spent in a column.Liquid Chromatography1.reverse phase,2.high performance and3.size exclusionProtein surface propertiesReverse phase chromatography (RPC)Based on the hydrophobic interactions between solute (溶质) molecules and immobilized, matrix-bound ligands.RPC has found favour in a wide variety of preparative applications including micropurification of protein fragments for sequencing and process-scale purification of recombinant protein products.RPC also offers the benefit of exceptional flexibility in separation conditions so that either molecules of interest can be bound while contaminants pass through, or contaminants can be bound while the molecule of interest passes through.Reversed phase chromatography (RPC)Binding of the protein in a polar mobile phaseElution by changing the composition of the mobile phase to becomemore non-polarHydrophobic interaction chromatography (HIC)is a technique for the purification and separation of biomolecules based on differences in their surface hydrophobicity.Many biomolecules, generally considered to be hydrophilic, also have sufficient numbers of hydrophobic groups allowing interaction with hydrophobic ligands coupled to the chromatographic matrix.HIC vs RPC–Less substituted matrix –Less hydrophobic ligands–Weaker binding–Elution with water/dilute buffers–Native protein–Adsorption chromatography–Low pressure chromatography –More substituted matrix –More hydrophobic ligands–Stronger binding–Elution with non-polar solvents–Denatured protein–Partition chromatography–High performance liquid chromatography (HPLC)HIC RPCHigh performance liquid chromatography (HPLC)the process is conducted at a high velocity and pressure drop. The column is shorter and has a small diameter, but it is equivalent to possessing a large number of equilibrium stages.Size exclusion chromatography, also known as gel permeation or filtration chromatography (分子筛)does not involve any adsorption and is extremely fast (FPLC).The packing is a porous gel, and is capable of separating large molecules from smaller ones.The larger molecules elute first since they cannot penetrate the pores. This method is common in protein separation and purification.Ion Exchange Chromatography(离子交换层析)Ion exchange chromatography is commonly used in the purification of biological materials.There are two types of exchange:cation exchange (S)in which the stationary phase carries a negative charge, and anion exchange (Q)in which the stationary phase carries a positive charge.An increase in ionic strength is typically used to elute proteins from IEX media. However, it is possible to use a change in pH to displace bound material.Affinity Chromatography(亲和层析)involves the use of packing which has been chemically modified by attaching a compound with a specific affinity for the desired molecules, primarily biological compounds.The packing material used, called the affinity matrix, must be inert and easily modified. Agarose is the most common substance used, in spite of its cost. The ligands, or "affinity tails/tag", that are inserted into the matrix can be genetically engineered to possess a specific affinity.GKPIPNPLLGLDST V5MASMTGGQQMG T7EQKLISEEDL MycProtien Maltose Binding Protein (MBP)HHHHHH Poly-HisYPYDVPDYA HAProtein GSTEYMPME GLU-GLUProteinGFP (Green Fluorescent Protein)KRRWKKNFIAVSAANRFKKISSSGAL Calmodulin Binding ProteinEpitope TagSequenceThe two strategies:1, fish out the target protein from the mix 2, remove the contaminants from the target proteinPurification by removing the target molecule from the contaminants.Affinity chromatography techniques are very specific for the target molecule or for a group of molecules with closely related biological properties. This makes them capable of "fishing out" the target molecule (or the group), leaving all contaminants behind.When applicable these techniques are to be preferred, since they drastically simplify the purification protocol.Purification by removing the contaminants from the target molecule.When a suitable affinity chromatography technique is not at hand, one has to rely on a sequence of general chromatography techniques to remove the contaminants.A typical purification protocol when nothing is known about the target protein employs the IEX-HIC-GF sequence of purification steps.蛋白质的理化性质及其分离策略的选择：1.分子大小2.形状3.溶解度4.电荷5.疏水性6.密度7.亲和能力8.可逆性缔合9.稳定性10.表面活性1.分子大小1.1 透析和超滤1.2 离心、密度梯度离心1.3 凝胶过滤2. 形状球状蛋白具有较小的有效半径(斯托克半径)膜过滤凝胶过滤3. 溶解度等电点沉淀盐溶(NaCl)和盐析(NH4)2 SO4有机溶剂(PEG, Ethanol)分级4. 电荷电泳(pI: 0.02 pH unit)离子交换5. 疏水性蛋白质表面的疏水氨基酸残基的数目和分布6. 密度一般1.3-1.4 g/ml含大量磷酸盐或脂质的蛋白质不同7. 亲和能力重组融合蛋白(GST-, His-tag et al.)配基(底物、抑制剂、辅因子、抗体)8. 可逆性缔合在不同条件下，蛋白质的聚合状态可能不同9. 稳定性热稳定性酶解稳定性10. 表面活性泡沫分离反胶团相转移聚合物-盐-水液-固萃取体系。
