第14章、蛋白质纯化策略

Developing an efficient protein purification schemeDeveloping an efficient protein purification schemeIntroductionThree phase strategyCombining techniquesPurity requirementsCharacteristics of the target protein andcontaminantsExamplesSummary and shortcutsProtein Purification -Aims Sufficient purity and quantity Maintained biological activity Good economyYields from Multistep Protein PurificationsNumber of stepsYield (%)95% / step 90% / step 85% / step 80% / step 75% / step02040608010012345678Input for Purification Protocol DevelopmentThree phase strategyPurification protocolRequired purity and quantityPhysical-chemical properties of target and main contaminantsSource material informationSeparation techniqueknowledgeScouting runs and optimizationEconomy and resourcesProtein Purification Analytical tools•A rapid and reliable assay for the target protein•Purity determination(e.g. SDS-PAGE)•Total protein determination(e.g. colorimetric method)Three Phase StrategyPurityStepCaptureIntermediate purificationPolishingIsolate product,concentrate, stabilizeRemove bulk impuritiesAchieve final purity.Remove trace impurities, structural variants,aggregates etc.Capture ResolutionSpeedRecovery CapacityInitial purification of the target molecule from crude or clarified source materialConcentration and stabilization (e.g. removal of proteases)Intermediate PurificationResolutionSpeedRecovery CapacityRemoval of bulk impuritiesPolishing ResolutionSpeedRecovery CapacityFinal removal of trace contaminants, e.g. structural variants of the target proteinThree Phase Strategy -Ranking of Chromatography TechniquesTechnique Capture Intermediate Polishing GFIEXHICACRPC ConsiderationsLimited sample volume Limited flow rate range Protein ligand is sensitive to harsh cleaning conditions Use of organic solvents, loss of biological activityLinking Chromatography Techniques into a Purification Protocol -General RulesCombine techniques with complementary selectivities (e.g. IEX, HIC and GF).Minimize sample handling between purification steps (e.g. concentration, buffer exchange).Technique End conditions Start conditionsSmall sample volume GF Diluted sampleBuffer change (if required)Low ionic strength IEX High ionic strength orpH changeHigh ionic strength HIC Low ionic strength Specific binding conditions AC Specific elution conditions1. IEX HIC GF2. ACGFRPCIEX3. HICGFACGF 4. (NH 4)2SO 4HICIEXGFHICGFIEX5. GFGF(desalting)ACGFPurity RequirementsContaminants which degrade or inactivate the target protein (e.g.proteases), need to be reduced to “non-detectable”levels.Contaminants which interfere with subsequent analyses need to be reduced to “non-detectable”levels.It is better to “over-purify”than to “under-purify”.•Therapy•In vivo studies •Crystallization for x-raystudies•N-terminal sequencingof an unknown protein•Most physical-chemicalcharacterization methods•Antigen for monoclonalantibody productionExtremely high High Moderate Purity Requirements -Brief GuidelinesTowards the Optimal Purification Protocol -Towards the Optimal Purification Protocol -Accounting for Target Protein Properties (1)Target protein property Purification parameter affected Stability windowz pHz Ionic strengthz Co-factorsz Detergent concentration z Organic solventsz Other (light, oxygen etc.)IEX conditions (also AC and RPC)HIC conditionsselection of buffers, pH, salts, additives buffer additivesRPC conditionsvariousTowards the Optimal Purification Protocol -Towards the Optimal Purification Protocol -Accounting for Target Protein Properties (2)Physical-chemical properties •Charge properties (isoelectric point)•Molecular weight •Post-translational modifications•Biospecific affinityTarget protein property Purification parameter affectedselection of IEX conditions selection of GF mediumselection of group specific AC medium selection of ligand for ACTarget Protein Stability Window Determination of a suitable ammonium sulfateconcentration and pH screening range for HICTarget Protein PropertiesSelection of ion exchange conditions5 6 7 8pHm o l e c u l e s c h a r g e+-Electrophoretic titration curve of chicken breast muscleusing zymogram detection for creatine kinaseTarget proteinContaminantsG Protein Receptor Kinase PurificationTechniquePptHICAIEXCIEXACPurificationfactorComment720240818647•All buffers containprotease inhibitors•All purifications done at +4o C•Removal step, maincontaminant is bound•Elution buffer is used asstarting buffer for next column•10 µg homogenous proteinobtainedA. Tobin et al. (1996)J. Biol. Chem. 271, 3907-3916 Porcine cerebellahomogenateRESOURCE QAmmonium sulfateprecipitationButyl SepharoseFast FlowRESOURCE sHiTrap HeparinRec α-Mannosidase Purification from PichiaTechniquePurification factorComment•83 µg homogenous protein obtainedY.-F. Liao et al. (1996)J. Biol. Chem. 271, 28348-28358•Capture with step gradient;730 mg of total protein applied63622719UFGF AIEX HIC Phenyl Sepharose HPQ Sepharose FFSuperdex 200 pgUltrafiltrationDNA Binding Protein PurificationTechniqueDNA-1 Sepharose CIEXAC AC AC CIEXPurification factorComment584943•General AC step for DNA binding proteins•Removal step, non-specific DNA binding activity removed •Main purification step •Final polishing, 20 µg protein obtainedJ. Berthelsen et al. (1996) J. Biol. Chem. 271, 3822-383092447•Rapid captureHeLa cell nuclearextracts SP Sepharose HighPerformance Heparin SepharoseFast Flow DNA-2 SepharoseMono S•Final polishing and purity check , 20 µg obtainedMembrane Protein PurificationTechniqueAC AIEX CIEX AC CIEXPurification factorComment341442•Negative step; contaminant removed•Detergent exchange, volume reduction before AC •Main purification stepT. White et al. (1995)J. Biol. Chem. 270, 24156-241656242•Step gradient, rapid concentrating capture stepPlacenta extract in 1.5% Triton X-100Blue Sepharose DEAE Sephacel SP Sepharose FF Muc2 SepharoseMono STowards a General Protein PurificationProtocolA rapid method for obtaining milligram quantities of different recombinant proteins, for initial characterization studiesSemi-automated in ÄKTAexplorer, with pre-made method templates and BufferPrepIon exchangeSTREAMLINE SP or DEAEHydrophobic interactionSP or Q Sepharose FFPhenyl Sepharose FF (high sub)Gel filtrationSuperdex75 prep gradeTowards a General Protein PurificationProtocol -Results with E. coli r-Proteins Ion exchangeSTREAMLINE SP or DEAEHydrophobic interactionSP or Q Sepharose FFPhenyl Sepharose FF (high sub)Gel filtrationSuperdex75 prep gradeProtein Expression Capture step(purified to homogeneity)Annexin V Extracellular STREAMLINE DEAEα-Amylase Intracellular STREAMLINE DEAEanti-gp120 Fab Periplasmic SP Sepharose Fast FlowShortcuts -Rapid Establishment of Milligram Scale Purification ProtocolsIf a biospecific ligand is available:use AC as the main purification step.If the purification is not intended to be scaled up:use high performance media (e.g. MonoBeads) throughout.For “one-of-a-kind” purification of a protein e.g. for sequencing before gene isolation:sacrifice yield for purity by making narrow cuts.If nothing is known about target protein and contaminants properties:try the IEX HIC GF combination.Establish a fast and reliable assay for the target protein.A Systematic Approach to PurificationDevelopment -SummaryDevelop assay methodsSet the aims (purity and quantity)Characterize the target proteinUse different separation principlesUse few stepsLimit sample handling between purification stepsStart with high selectivity -increase efficiencyRemove proteases quicklyReduce volume in early stepKeep it simple!。

蛋白质纯化词条已锁定摘要目录1蛋白质纯化2内容提要2.1亲和纯化样品的前…2.2亲和纯化步骤目录1蛋白质纯化2内容提要2.1亲和纯化样品的前…2.2亲和纯化步骤收起蛋白质纯化蛋白质的分离纯化在生物化学研究应用中使用广泛，是一项重要的操作技术。

一个典型的真核细胞可以包含数以千计的不同蛋白质，一些含量十分丰富，一些仅含有几个拷贝。

为了研究某一个蛋白质，必须首先将该蛋白质从其他蛋白质和非蛋白质分子中纯化出来。

用于分离蛋白质的最重要特性有大小、电荷、疏水性和对其他分子的亲和性。

通常采用多种方法的组合来实现蛋白质的完全纯化。

其蛋白质分离纯化主要方法包括：（1）根据分子大小不同的分离方法：透析和超过滤（利用蛋白质分子不能通过半透膜）；密度梯度离心（蛋白质在介质中离心时质量和密度较大的颗粒沉降较快）；凝胶过滤(一种柱层析)（2）利用溶解度差别分离：等电点沉淀法）由于蛋白质分子在等电点时净电荷为零，减少了分子间静电斥力，因而容易聚集沉淀，此时溶解度最小)；盐溶与盐析(利用一定浓度盐溶液增大或减小蛋白质的溶解度)（3）根据电荷不同的分离方法，主要包括电泳和离子交换层析分离；（4）蛋白质的选择吸附分离（利用颗粒吸附力的强弱不同达到分离目的）（5）根据配体特性的分离——亲和层析（利用蛋白质分子与另一种称为配体的分子能够特异而非共价地结合这一生物性质）内容提要一、亲和纯化样品的前处理1. 菌液体积-起始目的蛋白量2. 细菌裂解获得可溶蛋白· BugBuster Master Mix 蛋白抽提方法·机械破碎（如超声等）Ni-NTA 树脂纯化二、亲和纯化步骤1. Ni-NTA树脂的兼容性2. 天然条件纯化·柱层析· FPLC·批次小量纯化3. 变性条件的纯化·柱层析· FPLC 纯化·批次小量纯化4. 树脂再生5. 常见问题与改善建议一、亲和纯化样品的前处理1. 菌液体积-起始目的蛋白量纯化条件的优化需考虑多个因素，包括His·Tag 融合蛋白表达水平和上样量。

第十四章蛋白质生物合成一、填空题1．蛋白质的生物合成是以____作为模版，_____作为运输氨基酸的工具，____作为合成的场所。

2．细胞内多肽链合成的方向是从端到端，而阅读mRNA的方向是从_____到___端。

3．核糖体上能够结合tRNA的部位有部位、部位和部位。

4．ORF是指，已知发现最小的PRF只编码个氨基酸。

5．蛋白质的生物合成通常以作为起始密码子，有时也以作为起始密码子，是以和以及作为终止密码子.6．SD序列是指原核细胞mRNA的5′端富含碱基的序列，它可以和16SrRNA的3′端的序列互补配对，而帮助起始密码子的识别.7．含硒半胱氨酸的密码子是。

8．原核生物蛋白质合成的起始因子（IF)有种，延伸因子(EF）有种，终止释放因子(RF）有种；而真核生物细胞质蛋白质合成的延伸因子通常有种，真菌有种，终止释放因子有种。

9．密码子的第二个核苷酸如果是嘧啶核苷酸，那么该密码子所决定氨基酸通常是。

10．原核生物蛋白质合成中第一个被掺入的氨基酸是。

11．真核生物细胞质蛋白质合成对起始密码子的识别主要是通过机制进行。

12．无细胞翻译系统翻译出来的多肽链通常比在完整的细胞中翻译的产物要长,这是因为。

13．蛋白质的半寿期通常与端的氨基酸性质有关。

14．tmRNA是指。

15．同工受体tRNA是指。

16．疯牛病的致病因子是一种.17．已发现体内大多数蛋白质正确的构象的形成需要的帮助，某些蛋白质的折叠还需要的催化酶是和。

18．SRP是指，它是一种由和组成的超分子体系，它的功能是。

19．蛋白质定位于溶酶体的信号是。

20．分子伴侣通常具有酶的活性。

21．某些蛋白质基因的编码链上并无终止密码子，但可以通过Pre—mRNA的和两种后加工方式引入终止密码子。

22．蛋白质内含子通常具有_____酶的活性。

23．已有充分的证据表明大肠杆菌的转肽酶由其核糖体的____承担。

24．决定蛋白质进入过氧化物酶体的信号肽是____。

蛋白质纯化策略并举例蛋白质纯化是研究蛋白质特性和功能的重要步骤之一、纯化蛋白质的目的是将目标蛋白从混合物中分离出来，并去除其他干扰物质，以便进一步研究和利用。

蛋白质纯化的策略可以根据蛋白质的性质和混合物的组成选择不同的方法。

下面将介绍几种常用的蛋白质纯化策略。

1.借助溶液性进行纯化一种常见的方法是根据蛋白质在不同溶液条件下的溶解性来纯化蛋白质。

例如，如果目标蛋白质在酸性条件下溶解，在中性或碱性条件下不溶解，可以通过调整溶液的pH值来实现纯化。

另一个例子是，一些蛋白质在高盐浓度条件下溶解，在低盐浓度条件下沉淀，可以通过逐渐降低盐浓度来实现纯化。

2.借助分子大小进行纯化一些蛋白质具有与其他成分相比较明显的不同分子大小。

利用这种特性，可以选择适当的分离方式进行纯化。

一种常用的方法是通过凝胶过滤层析（gel filtration chromatography）纯化蛋白质。

该方法利用分子大小的差异，使大分子物质通过凝胶较快，小分子物质则需要在凝胶中较长时间停留，从而实现纯化目标蛋白质。

3.借助电荷进行纯化一些蛋白质具有特定的电荷性质，可以根据其在不同条件下的电荷状态选择适当的分离方式。

例如，离子交换层析（ion exchange chromatography）可以通过调整缓冲液的 pH 值，利用蛋白质与离子交换树脂之间的相互作用，实现目标蛋白质的纯化。

还有一种常见的技术是等电聚焦（isoelectric focusing），该方法是利用蛋白质在不同 pH 值下的等电点移动来实现纯化。

4.借助亲和性进行纯化5.借助活性进行纯化一些蛋白质具有特定的酶活性、配体结合性等活性，可以通过专一酶活性或配体结合性来进行纯化。

例如，利用蛋白质的酶活性，可以通过亲和层析和酶反应来实现目标蛋白质的纯化。

还可以根据蛋白质与配体结合的特异性，利用亲和层析等方法实现纯化。

以上是常见的几种蛋白质纯化策略及其举例。

需要注意的是，每种策略都有其适用范围和局限性，因此在纯化蛋白质时需要根据具体情况选择合适的策略，并结合多种方法进行组合使用，以达到最佳的纯化效果。

试述蛋白质分离纯化的主要步骤及方法下载温馨提示：该文档是我店铺精心编制而成，希望大家下载以后，能够帮助大家解决实际的问题。

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分离纯化蛋白质的四种关键性方法分离蛋白质的方法有许多种,应根据原材料和生产条件来选择具体的分离纯化方法。

例如:李凤英等[5]用盐溶法提取葡萄籽的蛋白质。

李喜红等[6]用酶法从脱脂米糠中提取蛋白质。

郭荣荣等[7]碱法与酶法与酶法提取大米蛋白工艺及功能特性比较研究得出结论是碱法提取的大米蛋白持水性、吸油性和起泡性优于酶法提取的大米蛋白,而酶法提取的大米蛋白的溶解性、乳化稳定性和泡沫稳定性优于碱法提取的大米蛋白。

王桃云等[8]就是运用这种方法配合使用加热法提取葎草叶蛋白。

陈申如等[9]用酸法提取了鲢鱼鱼肉蛋白质,提取的蛋白质无腥味,色泽洁白,蛋白质产率高,可达90%左右。

以下介绍四种分离纯化蛋白质的方法。

1区带离心法区带离心法是分离蛋白质的有效而且常用的方法。

该法的第一步是在离心管中形成一个密度梯度(常用蔗糖梯度),然后将待分离的蛋白质混合液放在密度梯度顶端。

超速离心时,蛋白质即通过密度梯度移动,并根据其沉降系数而被分开,最后各种蛋自质在离心管内被分离成各户独立的区带,可以在管底刺一小孔逐滴放出,分部收集。

2 层析法最常用的层析法是凝胶过滤和离子交换柱层析。

2.1 凝胶过滤(GFC)[10-12]凝胶过滤也叫凝胶色谱和分子筛层析,是利用凝胶的网状结构根据分子的大小和形状进行分离的方法。

凝胶过滤是一种快速而简便的分离分析技术,可用于蛋白质的脱盐、分离、提纯、分析等等。

柱中的填充料是水合程度高而不溶的碳水化合物高聚物,最常用的是葡聚糖凝胶〔其他有聚丙烯酞胺凝胶和琼脂糖凝胶等)。

仙聚糖凝胶是具有不同交联度的网状结构物,不同型号的葡聚糖凝胶其“网眼”大小不同,可以用来分离纯化不同分子大小的物质。

当蛋白质混合物通过层析柱时,比“网眼”大的蛋自质分子不能进入凝胶颗粒内部,不能沿着颗粒间隙流动,流程短,流速快,最先流出柱外;比“网眼”小的分子则进入凝胶颗粒内部,沿着孔道移动,从一个颗粒流出,又进入另一颗粒,所以下移速度慢,随后被洗脱下来。

蛋白表达及纯化策略一.目录：含组氨酸标签的蛋白诱导表达及纯化GST-融合蛋白的纯白化策略DEAE纯化蛋白策略分子筛纯化蛋白策略二.试剂：所用试剂均购自上海生工三.资料来源：汪德强老师四.撰写：罗淼牛司强含组氨酸标签的蛋白的诱导表达及纯化一.用IPTG诱导启动子在大肠杆菌中表达克隆化基因所需特殊试剂：1M IPTG1.将目的基因与IPTG诱导表达载体连接，构成重组质粒并转化相应的表达用的大肠杆菌。

将转化体铺于含相应抗生素的LB平板，37℃培养过夜。

通过酶切序列分析等筛选带有插入片段的转化体。

2.分别挑取对照菌和重组菌1个菌落，接种于1ml含有相应抗生素的LB培养液中，37℃通气培养过夜。

3.取100微升过夜培养物接种于5ml含有相应抗生素的LB培养液中（各10份），适当的温度（20－37℃）震荡培养4小时，至对数中期（A550＝0.1-1.0）。

4.对照菌和重组菌各取1ml未经诱导的培养物于离心管中，剩余培养物中加入IPTG至终浓度分别为0.5，1.0，1.5，2.5，3.0，3.5，4.0，4.5，5.0mM相同的温度继续通气培养。

5.在诱导的1，2，3，4，5个小时取1ml样品于Ep管中。

细菌的生长速率严重影响外源蛋白的表达，因此必须对接种菌量，诱导前细菌生长时间和诱导后细菌密度进行控制。

生长过度或过速会加重细菌合成系统的负担，导致包涵体的形成。

生长温度可能是影响大肠杆菌高度表达目的蛋白的最重要因素。

低温培养能在一定程度上抑制包涵体的形成。

IPTG的浓度对表达水平的影响也非常大。

所以通过试验确定最佳的培养条件是很必要的。

6.将所有样本室温最高速度离心1分钟，弃上清，沉淀重悬于100微升1×SDS蛋白上样缓冲液中，100℃加热5分钟，室温最高速度离心1分钟，取15微升样品上样于SDS聚丙烯酰胺凝胶，用SDS－PAGE观察表达产物条带，从而确定优化的培养条件。

二.大量表达靶蛋白1.取保存的重组大肠杆菌菌液150微升接种于30毫升含相应抗生素的LB培养液中，在100毫升锥形瓶中，300rpm，37℃通气过夜培养。

蛋白质纯化方法及问题解答蛋白质纯化一．可溶性蛋白的纯化1. 盐析硫酸铵沉淀法可用于从大量粗制剂中浓缩和部分纯化蛋白质。

用此方法可以将主要的免疫球从样品中分离，是免疫球蛋白分离的常用方法。

高浓度的盐离子在蛋白质溶液中可与蛋白质竞争水分子，从而破坏蛋白质表面的水化膜，降低其溶解度，使之从溶液中沉淀出来。

各种蛋白质的溶解度不同，因而可利用不同浓度的盐溶液来沉淀不同的蛋白质。

这种方法称之为盐析。

盐浓度通常用饱和度来表示。

硫酸铵因其溶解度大，温度系数小和不易使蛋白质变性而应用最广。

硫酸铵分级沉淀的方法其实很简单，一般就是用浓度从低到高的硫酸铵去沉淀蛋白，可以直接在液体里加固体的硫酸铵就可以，到一定的浓度离心沉淀，上清继续加硫酸铵，再离心，上清再加硫酸铵，然后用电泳检测或者活性检测沉淀的效果。

2. 亲和纯化2.1. Ni柱纯化2.1.1．Ni柱纯化操作流程1. 蛋白质上清与Ni柱填料在4℃下进行充分旋转混合(≥60 min)；也可以让上清液缓慢流经Ni柱（≥6 sec/drop）。

2. 上清与填料混合后，低速离心（≤ 500 x g），吸去大部分上清，然后将填料悬起，加入柱子中。

也可以直接上柱。

3. 上样后先用5-10 柱体积（CV）的lysis buffer冲洗不结合的杂蛋白，然后再用低浓度的咪唑洗去弱结合的杂蛋白。

在不知道清洗条件时可以进行咪唑浓度梯度洗脱（如10，20，30，40，50 mM），然后在纯度和得率之间选择最合适的咪唑浓度来进行清洗。

4. 清洗结束后，用高浓度咪唑（如200 mM）洗脱目的蛋白质。

5. 洗脱下来的目的蛋白质除电泳留样外，透析除去咪唑，并换成下一步所需的buffer。

6. 一般情况下his tag不需要切除。

当需要切除时：的蛋白质最少1）TEV：咪唑对其没有影响，可以在洗脱后直接酶切。

100 OD280的TEV切过夜，温度20或4℃（20℃的效率是4℃的三倍）。

可用1 OD2802) Thrombin：必须先除去咪唑才能进行酶切。

蛋白质纯化方案一、引言随着生物技术的发展，蛋白质纯化在生物医药领域扮演着重要的角色。

蛋白质纯化方案的设计和优化对于获得高纯度的蛋白质样品至关重要。

本文将介绍一种有效的蛋白质纯化方案。

二、背景在进行蛋白质纯化之前，我们需要了解目标蛋白质的特性。

这些特性包括分子量、溶解度、等电点等，以帮助我们选择适合的纯化方法。

三、材料和方法1. 细胞培养和裂解将表达目标蛋白质的细胞进行培养，然后使用合适的裂解方法将细胞壁破裂释放出蛋白质。

2. 前处理步骤a. 清除杂质：利用低速离心和滤过等方法将细胞碎片、核酸和其他杂质去除。

b. 浓缩样品：通过超滤或溶剂沉淀来浓缩目标蛋白质。

3. 色谱柱层析a. 亲和层析：使用具有亲和性层析介质的柱子，根据目标蛋白质与其配体之间的相互作用来纯化蛋白质。

b. 尺寸排阻层析：根据目标蛋白质的分子量，选择合适的层析介质，利用分子量的差异将杂质分离。

c. 离子交换层析：根据目标蛋白质的等电点选择适当的离子交换介质，通过离子交换作用实现蛋白质分离。

4. 后处理步骤a. 再生和洗脱：根据柱层析的原理和介质的特性，选择合适的缓冲液洗脱目标蛋白质。

b. 纯化评估：利用SDS-PAGE、质谱等技术评估纯化效果。

五、结果和讨论通过本文所描述的蛋白质纯化方案，我们成功地获得了高纯度的目标蛋白质。

其中，亲和层析、尺寸排阻层析和离子交换层析相结合的层析流程有效地去除了杂质，并且保留了目标蛋白质的活性。

六、结论本文所介绍的蛋白质纯化方案通过合理的层析和后处理步骤，能够高效地纯化目标蛋白质，并保持其活性。

该方案的优点在于其广泛的适用性和高度的可调性，可以根据目标蛋白质的特性进行相应的调整和优化。

七、致谢在此，感谢所有参与本研究的人员的辛勤工作和支持。

参考文献：[1] Smith A, Johnson B. Protein purification: Principles and practice[M]. Springer Science & Business Media, 2011.[2] Scopes R. Protein purification: principles and practice[M]. Springer Science & Business Media, 2002.。