原核蛋白表达与纯化

tac启动子需要大肠杆菌自身的RNA聚合酶即可：BL21
T7启动子需要能够提供T7 RNA聚合酶的细胞：DE3溶源菌
抗性
细胞不能与载体带有相同的抗性： pET-28a + OrigamiB(DE3) No！ pET-21b + OrigamiB(DE3) Yes！
BL21(DE3)pLysS / BL21(DE3)pLysE
Lane 3：BL21(DE3)
1
2
3
蛋白不可溶
• 成因：蛋白质正确折叠，形成有活性、有功能的天然构象的程度。 • 定位：可溶蛋白 包涵体 • 特点：可溶蛋白 包涵体 胞质，细胞周质，胞外（培养基） 胞质，细胞周质 天然构象，正ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ折叠，具有生物活性 高浓度，高纯度，无活性，具免疫原性，不易水解
增加可溶表达
GE tac (Pharmacia) NEB tac
pMal
Amp
MBP· Tag
pET
Merck (Novagen) Transgen
T7 T7lac T7lac
Amp Kan Amp
His· Tag
pEASY
His· Tag
表达菌株
考虑因素 细胞特性
蛋白稳定性
启动子
蛋白酶缺陷型——B型菌株，缺失lon、ompT蛋白酶 多种常用表达菌株均为此类，如BL21、Origami、Rosetta等
下篇 蛋白纯化
• 纯化策略选择 • 亲和层析与离子交换层析 • 层析方法的组合与顺序 • 包涵体纯化与复性
纯化策略选择 根据蛋白自身特点选择纯化方案 常用实验流程
蛋白自身特点 • 可溶/包涵体
• 融合标签
• 表面净电荷 • 分子量 • 其它特点
可溶/包涵体
可溶蛋白
•
•
无需变性步骤
适用于亲和层析、离子交换层析、凝胶过滤层析等方法
表达策略 可溶表达 包涵体 融合标签 天然蛋白
……
……
选择表达载体
系统名称 公司 pGEX 启动子 抗性 Amp 常用标签 GST· Tag 特点 可溶性表达，纯化难以控制，谷 胱甘肽 一步洗脱，得到的蛋白纯 度较低,通常需要去掉GST· Tag 可溶性表达，纯化难以控制，麦 芽糖一步洗脱，得到的蛋白纯度 较低,通常需要去掉MBP· Tag 种类丰富。标签小，无需切割， 一般来说，对蛋白活性无影响。 纯化及其方便。 同pET系统
Guarante L, Roberts TM, Ptashne M. A technique for expression eukaryotic genes in bacteria. Science, 1980, 209: 1428~1430
• 启动子Plac + 操纵基因lacO + 结构基因 • lacI负调控： 阻遏物lacI与操纵基因lacO结合，抑制表达 IPTG：半乳糖苷类似物，结合阻遏物lacI使其失活，启动诱导表达 • cAMP-CAP正调控 cAMP结合并激活CAP，起始转录，实现正调控 葡萄糖抑制腺苷酸环化酶，ATP不能转化为cAMP，无cAMP-CAP，无转录
适合启动子
tac、trc…… (pGEX、pMal) T7/T7lac (pET，pEASY) T7/T7lac (pET，pEASY) T7/T7lac (pET，pEASY) T7/T7lac (pET，pEASY)
特性
适用于非T7启动子的表达系统 适用于T7、T7lac的表达系统，适用于非毒基因 的表达 质粒pLysS含有表达T7溶菌酶的基因，可结合 T7 RNA聚合酶，降低本底表达水平。适用于严 谨调控毒基因的表达 补充6种稀有密码子对应的tRNA，提高外源基 因，特别是真核基因在原核系统中的表达水平 具有thioredoxin reductase/glutathione reductase 双突变，有助于形成更多的二硫键，增加蛋白 的可溶性。
严谨调控
稀有密码子
溶解性
Rosetta系列
Origami系列
稀有密码子 不同生物使用密码子存在偏爱性。某种或某几种tRNA的缺乏，会导致外源目的基 因的mRNA 无法正常在E. coli 里表达，是为“稀有”密码子。
表达条件
• 乳糖操纵子与诱导物
• 常用表达条件的优化
乳糖操纵子与诱导物
• 1980年，Guarante L等构建了以乳糖操纵子为基础的大肠杆菌表达系统
• trc启动子：
• tac启动子：
trp+lac杂交启动子
trp+lacUV5杂交启动子； pGEX（Pharmacia）、pMal（NEB）
•T7/T7lac启动子：
pET（Novagen）、pEASY-E1/E2（Transgen）
T7启动子
T7lac启动子
融合标签
• 常用于蛋白检测与纯化。 • 有时也可增加蛋白可溶性、将蛋白运转至特定位置。
GE tac (Pharmacia) NEB tac
pMal
Amp
MBP· Tag
pET
Merck (Novagen) Transgen
T7 T7lac T7lac
Amp Kan Amp
His· Tag
pEASY
His· Tag
选择表达菌株
菌株
BL21 BL21(DE3) BL21(DE3)pLysS
pGEX pET
Lane 2：30℃ Lane 3：25℃
促进包涵体形成
• 目的 高浓度，高纯度 毒基因表达
免受蛋白酶水解（小蛋白，多肽）
• 手段 胞质表达 提升表达速率（诱导温度，IPTG浓度，etc） 特定的表达载体（pET-17xb，pET-31b(+)）
蛋白纯化障碍 • 表达——纯化是一个完整的、密切联系的过程，蛋 白纯化过程中，很多问题的根源来自上游表达 • 蛋白不结合，洗脱杂带多，包涵体不易溶解…… • 下篇详述
常用表达条件的优化
• 培养基组分
• 温度
• IPTG浓度 • OD值
• 培养体积与溶氧量
原核表达策略选择 根据实验目的选择表达策略 载体选择 感受态细胞选择 表达条件
根据实验目的选择表达策略 1. 明确实验目的
2. 选择表达载体
3. 选择表达菌株 4. 优化表达条件
实验目的 活性分析 制备抗原 高纯度 结构研究
常用表达载体系统
系统名称 公司 pGEX 启动子 抗性 Amp 常用标签 GST· Tag 特点 可溶性表达，纯化难以控制，谷 胱甘肽 一步洗脱，得到的蛋白纯 度较低,通常需要去掉GST· Tag 可溶性表达，纯化难以控制，麦 芽糖一步洗脱，得到的蛋白纯度 较低,通常需要去掉MBP· Tag 种类丰富。标签小，无需切割， 一般来说，对蛋白活性无影响。 纯化及其方便。 同pET系统
原核表达概述 原核表达原理概述 表达载体 表达菌株 表达条件
原核表达原理概述
目的基因
构建
转化
培养，诱导
表达载体
重组载体 表达菌株
“基因——载体——菌株——培养”
表达载体
• 启动子
• 融合标签
• 常用表达载体系统
常见启动子 • λpL启动子： • trp启动子： 热诱导启动子 化学诱导启动子
载体 pGEX pMal pET
pEASY
T7lac
无表达或表达量低
稀有密码子 • 影响： • 应对： 翻译终止，移码突变，氨基酸序列错误，表达量低或无表达 在宿主中补充稀有密码子的tRNA Rosetta系列菌株（Novagen公司）
目的蛋白
1：BL21(DE3)； 2：Rosetta(DE3) ； 3：BL21(DE3)pLysS M 1 2 3
无表达或表达量低
毒基因
• 影响：宿主中质粒不稳定、抑制生长或杀死宿主（溶菌）、表达量低或无 表达 • 应对：严谨调控启动子，抑制本底表达 选择特殊的载体（pETcoco） 选择特定的宿主菌（BL21(DE3)pLysS，BL21(DE3)pLysE ） 优化培养条件与诱导表达条件 包涵体表达
pET28a Lane 1：Rosetta(DE3) Lane 2：BL21(DE3)pLysS
N端融合：
易于构建。终止密码子来自载体/基因 表达量高 提前终止会干扰纯化 二级翻译起始不影响纯化
C端融合：
构建时注意避免移码 基因不能自带终止密码子 提前终止不影响纯化 二级翻译起始会干扰纯化
常用融合标签 • His· Tag pET系统
• GST· Tag
• MBP· Tag
pGEX系统
pMal系统
原理
促进正确折叠
手段
融合催化二硫键形成酶的标签 选择促二硫键形成的细胞（Origami系列菌株）
分泌表达
融合表达 控制表达水平 “假”包涵体 （疏水区域，膜结合等）
细胞周质表达，胞外分泌
融合溶解性高的标签（GST，MBP） 诱导温度 IPTG浓度 特殊裂解缓冲液（去垢剂，盐，核酸酶„„）
1
2
1
2
3 Lane 1：37℃
葡萄糖： 温度： 抑制cAMP形成，进而抑制表达，严谨调控 无其他严谨调控手段（pLysS）且毒基因时，至关重要！ 影响表达速率、蛋白可溶性与活性
IPTG浓度：
影响表达速率、蛋白可溶性与活性 lac透性酶(lacY1)突变使IPTG均一渗透，获得浓度依赖 的诱导：Tuner，OrigamiB，Rosetta
The key of Prokaryotic protein expression and purification
北京全式金生物技术有限公司
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上篇 原核表达
• 原核表达概述
• 原核表达策略选择 • 表达结果验证
• 常见问题与实验例
全菌 上清 沉淀
全菌
上清
沉淀
可溶表达
包涵体
常见问题与实验例 无表达或表达量低
蛋白不可溶
蛋白纯化障碍
无表达或表达量低
• 载体-菌株搭配不当
•
摸索最佳的组合
启动子 tac tac T7/T7lac 菌株 BL21 BL21 BL21(DE3) BL21(DE3)pLysS Rosetta(DE3) OrigamiB(DE3) 同上
Lane 1: LB培养基，IPTG诱导 Lane 2: AM-PE自动诱导 Lane 3: LB培养基，对照
表达结果验证
表达定位
溶解性 胞内表达 可溶/包涵体 周质表达 多为可溶 胞外分泌 完全可溶 表面展示 融合膜蛋白/ 嵌合于膜上 信号肽 活性 不需要 有/无 需要 需要 需要 有 有 免疫原性 产量 有 有 有 有 纯化难度
包涵体
•
• •
需要洗涤、变性、复性（如有需要）等步骤
适用于某些亲和层析方法（6×His· Tag）、离子交换层析 不适用于某些亲和层析方法（GST· Tag、 MBP· Tag ）
1
2
3
4
pET28a,30 kDa 1：ArtMedia 2：LB 3：LB+0.2% Glucose 4：SOB
1
2
3
1
2
3
载体：pEASY-E1 蛋白：70 kDa 菌株：Transetta(DE3)
载体：pGEX-5X-3蛋白：70 kDa 蛋白：30kDa 菌株：BL21
Lane 1: LB培养基，对照 Lane 2: LB培养基，IPTG诱导 Lane 3: AM-PE自动诱导
菌体密度 Mg2+ 培养体积与通气 ……
其他因素：
ArtMediaTM Protein Expression（AM PE）
• 葡萄糖抑制cAMP形成，无cAMP-CAP，不能正调控乳糖操纵子，因而无法利 用乳糖，使得大肠杆菌优先利用葡萄糖 • AM PE中含有特定配比的葡萄糖与乳糖，利用该机理，使得葡萄糖耗尽开始 摄入乳糖时，控制细菌恰好生长到适合诱导的阶段（对数期），利用乳糖代谢， 启动自动诱导！ • 无需监控菌体生长，实现自动诱导 • 无需加入IPTG，对细菌生长无抑制 • 细胞密度高，蛋白产量高 • 应用于一切乳糖操纵子表达系统：pET、pGEX、pMal、pEASY……
最高 蛋白种类多，需裂解 ≤50% 菌体，复杂 较少 ≤4% 变化 较大 蛋白种类少，需渗透 压休克，相对容易 纯化简单。但机理不 详，成功先例少 适用于疫苗开发、抗 体制备，前景广阔。
表达定位
菌液 离心 菌体 悬菌，渗透压休克 菌体 悬菌，裂解，离心 沉淀 溶解，离心 沉淀 胞质不溶组分 胞质可溶组分 培养基组分 细胞总蛋白 细胞周质组分
Rosetta(DE3) Transetta(DE3) OrigamiB(DE3) TransB(DE3)
毒基因：基因表达产物——即目的蛋白，影响宿主生长（“毒性”） Page Down
BL21(DE3)pLysS、BL21(DE3)pLysE利用T7溶菌酶的严谨调控机制
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优化表达条件