MW05多管发酵法检测粪大肠菌群原始记录

大肠菌群测定原始记录
时间：检验地点：本厂化验室
检测样品名称：来源：
生理盐水的配制：8.5g氯化钠加1000ml蒸馏水溶解待用。
1.取225ml生理盐水于标签为1:10的300ml锥形瓶中，
取9ml生理盐水于标签为1:100的50ml锥形瓶中。
2.LST溶液的配制：取LST7.1g加水100ml（双料），溶解至透明，
取1:100的稀释样1ml于标有0.01g的3只试Байду номын сангаас中，
5．培养：放入36℃的培养箱中培养48h。时间起始：
24h产气管数：
48h产气管数：
6．BGLB溶液复发酵试验：配制BGLB溶液，称取BGLB4g溶液100ml水中，均分倒入对应产气标号的标有标示并放有聚气管的试管中，放入灭菌锅灭菌15min。用接种针粘一环产气管液于标有对应的以灭菌的BGLB溶液的试管中，于36℃的培养箱中培养48h。
倒入10ml于3只标有1g的并放有聚气管的试管中;剩余溶液加一倍水配成单料倒入标有0.01g，0.001ml的6只试管中，每只10ml,并放有聚气管(试管要求180×18mm)。
放入灭菌锅灭菌15min.
以上1；2；同时一起灭菌，灭菌起始时间(喷气开始计时)：
压力表指针回零后打开放气阀，开盖取出，冷至常温。
培养起始时间：
48h产气管数：
7.检索MPN表结论：
备注：
3.样品稀释：于225ml灭菌的生理盐水中加入样品25g，混匀，配成1:10的稀释样；
从1:10的稀释样中取1ml到入标有1:100的9ml灭菌的生理盐水中混匀，配成1:100稀释样;
4.初发酵试验：取1:10的稀释样10ml于标有1g的3只试管中，
取1:10的稀释样1ml于标有0.1g的3只试管中，

2、检验水源水时，如污染较严重，应加大稀释度，可接种1，0.1，0.01ml甚至0.1，0.01，0.001ml，每个稀释度接种5管，每个水样共15管。接种1ml以下水样时必须作10倍递增稀释后，取lml接种，每递增稀释一次，换用1支lml灭菌刻度吸管。
3、将接种管置36±l°C培养箱内，培养24h±2h，如所有乳糖蛋白胨培养管都不产气产酸，则可报告为总大肠菌群阴性，如有产酸产气者，则按下列步骤进行。
二、分离培养：
经培养24h后，将产酸产气的发酵管，分别接种于伊红美蓝平板上，36±1°C恒温培养8h-24h，观察形态，挑取数个可疑菌落进行涂片、革兰氏染色、镜检。
三、证实试验：
挑取可疑管接种乳糖蛋白胨培养液中，置于36±1°C愠温箱中培养24h ±2h，有产酸产气者，即证实有总大肠菌群存在。
培养基
19
20
操作人：复核人：
培养温度
培养时间
二倍浓缩乳糖蛋白胨培养液
36±1°C
24h±2h
乳糖蛋白胨培养液
36±1°C
24h±2h
EMB
36±1°C
24h±2h
观察结果
序号
样品编号
乳糖发酵
复发酵
结果报告(MPN/100mL)
10ml
1ml
0.1ml
10ml
1ml
0.1ml
1
2
3
4
5
6
7
8
9பைடு நூலகம்
10
11
12
13
14
15
16
17
18
总大肠菌群检验数据原始记录
委托书编号：委托单位：
检测项目：总大肠菌群检测依据：GB/T 5750.12-2006 2.1多管发酵法

检测分析方法验证报告报告编号:xxxxxxxx方法名称：xxxxxxxxx验证人员：xxx xxx审核人员：xxx验证日期：xxxx年xx月xx日xxxxxx有限公司水质粪大肠菌群的测定多管发酵法一、方法依据本方法依据《水质粪大肠菌群的测定多管发酵法》（HJ 347.2-2018）用多管发酵法测定水中粪大肠菌群，适用于地表水、地下水、生活污水以及工业废水的粪大肠菌群测定。

本方法的检出限为，12管法为3CFU/L；15管法为20MPN/L。

二、方法原理将待测样品加入含乳糖蛋白胨培养基的试管中，37℃初发酵富集培养，大肠菌群在培养基中生长繁殖分解乳糖产酸产气，产酸能够使溴甲酚紫指示剂由紫色变为黄色，产气则由倒管指示。

将初发酵中产酸产气的试管进行复发酵接种，44.5℃复发酵培养，复发酵培养基中的胆盐三号能够抑制革兰氏阳性菌生长，最后产气的细菌确定为粪大肠菌群。

通过查MPN表，得出粪大肠菌群浓度值。

样品采集时可加入硫代硫酸钠溶液消除活性氯对样品的干扰，或加入乙二胺四乙酸二钠溶液消除重金属离子对样品的干扰。

参加验证的人员情况登记表使用仪器情况登记表使用试剂及溶剂登记表三、分析步骤3.1样品稀释及接种3.1.1 15管法3.1.1.1本次15管法选用的待检样品为xx水源水，其接种量分别为10mL、1mL、0.1mL、,在5支装有已灭菌的5mL三倍乳糖蛋白胨培养基的试管中，按无菌操作要求各加入样品10mL，在5支装有已灭菌的10mL单倍乳糖蛋白胨培养基的试管中，按无菌操作要求各加入样品1mL，在5支装有已灭菌的10mL单倍乳糖蛋白胨培养基的试管中，按无菌操作要求各加入1：10稀释样品1mL。

在做10倍梯度稀释时，按无菌操作吸取10mL充分混匀的待稀释样品，加入到盛有90mL 无菌水的三角瓶中。

3.1.1.2阳性试验：挑取一粒大肠埃希氏菌（ATCC 25922）磁珠置于BHI液体培养液中，24h培养，使之菌悬液浓度在109CFU/mL，用无菌生理盐水按照10倍系列稀释法，稀释至10-7至10-8。

发酵试验
阳性管数
报出值 MPN/ml
LST肉汤管初 BGLG肉汤管复
发酵试验
发酵试验
阳性管数
报出值 MPN/ml
LST肉汤管初 BGLG肉汤管复
发酵试验
发酵试验
阳性管数
报出值 MPN/ml
审核：
年月
日
编号： 样品名称：
检验依据：GB/T4789.3-2016 培养开始时间： 年 月 培养结束时间： 年 月
稀பைடு நூலகம்度
1
稀释度
项目 管号
1 2 3 1 2 3 1 2 3
项目 管号
2
稀释度
3
稀释度
4
稀释度
1 2 3 1 2 3 1 2 3
项目 管号
1 2 3 1 2 3 1 2 3
项目 管号
1 2 3 1 2 3 1 2 3
项目 管号
1
2
3
5
1
2
3
1
2
3
检验员：
大肠菌群检测原始记录
批次：
日时
日时
LST肉汤管初 BGLG肉汤管复
发酵试验
发酵试验
恒温时间： h 恒温温度：36℃±1℃
阳性管数
报出值 MPN/ml
LST肉汤管初 BGLG肉汤管复
发酵试验
发酵试验
阳性管数
报出值 MPN/ml
LST肉汤管初 BGLG肉汤管复
发酵试验

水质粪大肠菌群的测定℃温度下能发展并发酵乳糖产酸产气的大肠菌群称为粪大肠菌群.用进步造就温度的办法,造成晦气于来自天然情形的大肠菌群发展的前提,使造就出来的菌重要为来自粪便中的大肠菌群,从而更精确地反应出水质受粪便污染的情形.粪大肠菌群的测定可以用多管发酵法和滤膜法.第一篇多管发酵法1. 实用规模本尺度实用于地表水.地下水及废水中粪大肠菌群的测定.2. 道理多管发酵法是以最可能数（most probable number）简称MPN来暗示实验成果的.现实上它是依据统计学理论,估量水体中的大肠杆菌密度和卫生质量的一种办法.假如从理论上斟酌,并且进行大量的反复检定,可以发明这种估量有大于现实数字的偏向.不过只要每一稀释度试管反复数量增长,这种差别便会削减,对于细菌含量的估量值,大部分取决于那些既显示阳性又显示阴性的稀释度.是以在实验设计上,水样磨练所请求反复的数量,要依据所请求数据的精确度而定.3. 造就基和试剂本尺度所用试剂除尚有注明外,均为相符国度尺度的剖析纯化学试剂;实验用水为新制备的去离子水.3.1单倍乳糖蛋白胨造就液：成分：蛋白胨 10g牛肉浸膏 3g乳糖 5g氯化钠 5g1.6%溴甲酚紫乙醇溶液 1mL蒸馏水 1000mL制法：将蛋白胨.牛肉浸膏.乳糖.氯化钠加热消融于1000mL 蒸馏水中,调节pH为7.2～7.4,再参加 1.6%溴甲酚紫乙醇溶液1mL,充分混匀,分装于含有倒置的小玻璃管的试管中,于高压蒸汽灭菌器中,在115℃灭菌20min,贮存于暗处备用.3.2 三倍乳糖蛋白胨造就液：按上述配方比例三倍（除蒸馏水外）,配成三倍浓缩的乳糖蛋白胨造就液,制法同上.3.3 EC造就液：成分：胰胨 20g乳糖 5g胆盐三号 1.5g磷酸氢二钾（K2HPO4） 4g磷酸二氢钾（KH2PO4） 1.5g氯化钠 5g蒸馏水 1000mL制法：将上述成分加热消融,然后分装于含有玻璃倒管的试管中.置高压蒸汽灭菌器中,115℃灭菌20min.灭菌后pH应为6.9.3.4 造就基的存放在密封瓶中的脱水造就基成品要存放在大气湿度低.温度低于30℃的暗处,存放时应防止阳光直接照耀,并且要防止杂菌侵入和液体蒸发.当造就液色彩变更,或体积变更显著时放弃不必. 4. 步调4.1 水样接种量将水样充分混匀后,依据水样污染的程度肯定水样接种量.每个样品至罕用三个不合的水样量接种.统一接种水样量要有五管.相对未受污染的水样接种量为10mL.1mL.0.1mL.受污染水样接种量依据污染程度接种1mL.0.1mL.0.01mL或0.1mL.0.01mL.0.001mL等.应用的水样量可参考下表1.表1 接种用水量参考表＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿接种量(mL）水样种类检测办法 100 50 10 1 0.1 10-210-310-4 10-5井水多管发酵法×××河水.塘水多管发酵法×××湖水.塘水多管发酵法×××城市原污水多管发酵法×××＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿如接种体积为10mL,则试管内应装有三倍浓度乳糖蛋白胨造就液5mL;如接种量为1mL或少于 1mL,则可接种于通俗浓度的乳糖蛋白胨造就液10mL中.4.2 初发酵实验将水样分离接种到盛有乳糖蛋白胨造就液的发酵管中.在37℃±℃下造就24h±2h.产酸和产气的发酵管标明实验阳性.如在倒管内产气不显著,可轻拍试管,有吝啬泡升起的为阳性.4.3 复发酵实验℃±℃温度下造就24h±2h（水浴箱的水面应高于试管中造就基液面）.接种后所有发酵管必须在30min内放进水浴中.造就后立刻不雅察,发酵管产气则证实为粪大肠菌群阳性.5．成果的盘算依据不合接种量的发酵管所消失阳性成果的数量,从表2或表3中查得每升水样中的粪大肠菌群.接种水样为100mL2份.10mL10份.总量300mL时,查表2可得每升水样中的粪大肠菌群;接种5份10mL水样.5份1mL水样.5份0.1mL水样时,查表3求得MPN指数,MPN值再乘10,即为1L水样中的粪大肠菌群.。

粪大肠菌群的测定（多管发酵法）一、检测限二、试剂(均为分析纯)1、配制单倍乳糖蛋白胨培养液（1份量）(因有固体培养基，以下配置方法仅做参考)单倍乳糖蛋白胨培养液成分：蛋白胨10g、牛肉浸膏3g、乳糖5g、氯化钠5g、1.6%溴甲酚紫乙醇溶液1mL、碳酸钠10.6g。

1.6%溴甲酚紫乙醇溶液（1mL）：称取溴甲酚紫1.6g倒入小烧杯，用少量95%乙醇溶解，移至100mL容量瓶，用95%乙醇多次洗小烧杯，洗液移入容量瓶，最后用95%乙醇定容至100mL，摇匀备用。

（滤纸、100mL小烧杯2只、100mL容量瓶1只、95%乙醇、玻璃棒、药匙、天平、滴管、溴甲酚紫）碳酸钠（10.6g）：称取10.6g碳酸钠溶于蒸馏水，并定容到100mL。

（100mL容量瓶1个、100mL小烧杯2只、碳酸钠）将单倍乳糖蛋白胨培养液成分蛋白胨10g、牛肉浸膏3g、乳糖5g、氯化钠5g加热溶解于1000mL蒸馏水中，调节pH为7.2~7.4（用10%碳酸钠调节），再加入1.6%溴甲酚紫乙醇溶液1mL，充分混匀，分装于含有倒置的小玻璃管的试管(10mL左右)中，于高压蒸汽灭菌器中，在115℃灭菌20min，贮存于暗处备用（冰箱中可存放3个月）。

(>1L锥形瓶1只、1mL移液管1根、pH计、电炉、倒置的小玻璃管的试管60套（小试管(12x150mm ）+小套管（杜氏小管）（约6mm × 36mm )）、高压蒸汽灭菌器、试管架（10只入）、纱布和棉花)2、三倍配制单倍乳糖蛋白胨培养液：制法同上，除蒸馏水外，其余配方比例三倍。

3、EC培养液（1份量）将EC培养液所需成分胰胨20g、乳糖5g、胆盐三号1.5g、磷酸氢二钾（K2HPO4）4g、磷酸二氢钾（KH2PO4）1.5g、氯化钠5g，加热溶解于1L烧杯中，然后分装于含有玻璃倒管的试管中。

用10%Na2CO3调节pH以防止培养基灭菌后pH上升0.2左右（确定值需要前期在实验室寻找规律）。

粪⼤肠杆菌群测定⽅法⽔质粪⼤肠菌群的测定粪⼤肠菌群是总⼤肠菌群中的⼀部分，主要来⾃粪便。

在44.5℃温度下能⽣长并发酵乳糖产酸产⽓的⼤肠菌群称为粪⼤肠菌群。

⽤提⾼培养温度的⽅法，造成不利于来⾃⾃然环境的⼤肠菌群⽣长的条件，使培养出来的菌主要为来⾃粪便中的⼤肠菌群，从⽽更准确地反映出⽔质受粪便污染的情况。

粪⼤肠菌群的测定可以⽤多管发酵法和滤膜法。

第⼀篇多管发酵法1. 适⽤范围本标准适⽤于地表⽔、地下⽔及废⽔中粪⼤肠菌群的测定。

2. 原理多管发酵法是以最可能数（most probable number）简称MPN来表⽰试验结果的。

实际上它是根据统计学理论，估计⽔体中的⼤肠杆菌密度和卫⽣质量的⼀种⽅法。

如果从理论上考虑，并且进⾏⼤量的重复检定，可以发现这种估计有⼤于实际数字的倾向。

不过只要每⼀稀释度试管重复数⽬增加，这种差异便会减少，对于细菌含量的估计值，⼤部分取决于那些既显⽰阳性⼜显⽰阴性的稀释度。

因此在实验设计上，⽔样检验所要求重复的数⽬，要根据所要求数据的准确度⽽定。

3. 培养基和试剂本标准所⽤试剂除另有注明外，均为符合国家标准的分析纯化学试剂；实验⽤⽔为新制备的去离⼦⽔。

3.1单倍乳糖蛋⽩胨培养液：成分：蛋⽩胨10g⽜⾁浸膏3g乳糖5g氯化钠5g1.6%溴甲酚紫⼄醇溶液1mL蒸馏⽔1000mL制法：将蛋⽩胨、⽜⾁浸膏、乳糖、氯化钠加热溶解于1000mL蒸馏⽔中，调节pH 为7.2～7.4，再加⼊1.6%溴甲酚紫⼄醇溶液1mL，充分混匀，分装于含有倒置的⼩玻璃管的试管中，于⾼压蒸汽灭菌器中，在115℃灭菌20min，贮存于暗处备⽤。

3.2 三倍乳糖蛋⽩胨培养液：按上述配⽅⽐例三倍（除蒸馏⽔外），配成三倍浓缩的乳糖蛋⽩胨培养液，制法同上。

3.3 EC培养液：成分：胰胨20g乳糖5g胆盐三号 1.5g磷酸氢⼆钾（K2HPO4）4g磷酸⼆氢钾（KH2PO4）1.5g氯化钠5g蒸馏⽔1000mL制法：将上述成分加热溶解，然后分装于含有玻璃倒管的试管中。

粪大肠菌群的测定（多管发酵法）一、检测限二、试剂(均为分析纯)1、配制单倍乳糖蛋白胨培养液（1份量）(因有固体培养基，以下配置方法仅做参考)单倍乳糖蛋白胨培养液成分：蛋白胨10g、牛肉浸膏3g、乳糖5g、氯化钠5g、1.6%溴甲酚紫乙醇溶液1mL、碳酸钠10.6g。

1.6%溴甲酚紫乙醇溶液（1mL）：称取溴甲酚紫1.6g倒入小烧杯，用少量95%乙醇溶解，移至100mL容量瓶，用95%乙醇多次洗小烧杯，洗液移入容量瓶，最后用95%乙醇定容至100mL，摇匀备用。

（滤纸、100mL小烧杯2只、100mL容量瓶1只、95%乙醇、玻璃棒、药匙、天平、滴管、溴甲酚紫）碳酸钠（10.6g）：称取10.6g碳酸钠溶于蒸馏水，并定容到100mL。

（100mL容量瓶1个、100mL小烧杯2只、碳酸钠）将单倍乳糖蛋白胨培养液成分蛋白胨10g、牛肉浸膏3g、乳糖5g、氯化钠5g加热溶解于1000mL蒸馏水中，调节pH为7.2~7.4（用10%碳酸钠调节），再加入1.6%溴甲酚紫乙醇溶液1mL，充分混匀，分装于含有倒置的小玻璃管的试管(10mL左右)中，于高压蒸汽灭菌器中，在115℃灭菌20min，贮存于暗处备用（冰箱中可存放3个月）。

(>1L锥形瓶1只、1mL移液管1根、pH计、电炉、倒置的小玻璃管的试管60套（小试管(12x150mm ）+小套管（杜氏小管）（约6mm × 36mm )）、高压蒸汽灭菌器、试管架（10只入）、纱布和棉花)2、三倍配制单倍乳糖蛋白胨培养液：制法同上，除蒸馏水外，其余配方比例三倍。

3、EC培养液（1份量）将EC培养液所需成分胰胨20g、乳糖5g、胆盐三号1.5g、磷酸氢二钾（K2HPO4）4g、磷酸二氢钾（KH2PO4）1.5g、氯化钠5g，加热溶解于1L烧杯中，然后分装于含有玻璃倒管的试管中。

用10%Na2CO3调节pH以防止培养基灭菌后pH上升0.2左右（确定值需要前期在实验室寻找规律）。

（3）恒温水浴箱：46℃±1℃。
（4）天平：感量0.1g。
（5）无菌吸管：1mL（具0.01mL刻度）、10mL（具0.1mL刻度）或微量移液器及吸头。
（6）无菌锥形瓶：容量500mL。
（7）无菌培养皿：直径90mm。（8）来自H计或pH比色管或精密pH试纸。
1、操作步骤
（1）初发酵
选择适宜的三个连续稀释度的样品匀液。每个稀释度接种三管月桂基磺酸盐胰蛋白胨（LST）肉汤，每管接种1mL（如接种量需要超过1mL，则用双料LST肉汤）。36℃±1℃培养24h±2h，检查倒管内是否有气泡产生或轻摇试管时是否有密集连续的细小气泡从管底逸出，如未产气则继续培养至48h±2h。记录在24h和48h内产气的LST肉汤管数。未产气者为粪大肠菌群阴性；对产气者，则进行复发酵试验。
粪大肠菌群检查实验记录
品名
批号
物料编码
规格
来源
取样日期
代表量
检验日期
报告日期
检验编号
检验依据
1、粪大肠菌群检验记录
仪器设备名称：电热恒温培养箱仪器设备型号：DHP-500
生理盐水的配制：8.5g氯化钠加1000ml蒸馏水溶解待用（121℃灭菌30min）。
（1）恒温培养箱：36℃±1℃。
（2）冰箱：2℃～5℃。
（1）取225ml生理盐水于标签为1:10的300ml锥形瓶中，
取9ml生理盐水于标签为1:100的50ml锥形瓶中。
（2）LST溶液的配制：取LST7.1g加水100ml（双料），溶解至透明，
倒入10ml于3只标有1g的并放有聚气管的试管中;剩余溶液加一倍水配成单料倒入标有0.01g，0.001ml的6只试管中，每只10ml,并放有聚气管(试管要求180×18mm)。

微生物检验原始记录(大肠菌群)检验原始记录编号：报告类别：微生物共页项目：大肠菌群coliforms 检验地点：样品名称：样品编号：样品状态：符合检验要求；其他境条件：实验依据及步骤GB4789.3-2016样品稀释固体和半固体样品：称取25g样品置盛有225ml生理盐水或磷酸盐缓冲液的无菌均质容器内均质，或放入盛有225ml稀释液的无菌均质袋中拍击式均质器拍打，制成为1:10样品匀液。

依次进行10倍递增稀释。

液体样品：以无菌吸管吸取25ml样品置盛有225ml磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌锥形瓶（瓶内预置适当数量的无菌玻璃珠）中混匀，为1:10样品匀液。

样品匀液的ph应在6.5-7.5之间，必要时分别用1mol/lNaOH或1mol/lHcL调节。

取1mL1∶10稀释匀液沿管壁缓缓注入9ml磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌试管中（注意吸管或吸头尖端不要触及稀释液面），振摇试管或换用一支无菌吸管反复吹打，使其混合均匀，制成1:100样品匀液。

按上述操作顺序做10倍递增稀释液，每稀释一次，换用一支1mL灭菌吸量管。

从样品匀液制备到样品接种完毕，全过程不得超过15min。

初发酵试验（9管法）每个样品，选择3个适宜的连续稀释度的样品匀液（液体样品可以选择原液），每个稀释度接种3管月桂基硫酸盐胰蛋白胨（LST）肉汤（大肠菌群测定：如果超过1ml，则用双料LST肉汤）36℃±1℃培养24h±2h，观察倒管内是否有气泡产生。

产气者进行复发酵试验，未产气则继续培养至48±2h，产期进行复发酵试验。

未产气者为大肠菌群阴性。

复发酵试验（证实试验）用接种环从产气的LST肉汤管中分别取培养物1环，移种于煌绿糖胆盐肉汤（BGLB）管中，36℃±1℃培养48h±2h，，观察产气情况。

数据分析与结果一、菌落计数根据证实为大肠菌群的阳性管数，查MPN检索表，报告大肠菌群的最可能数。

微生物检验原始记录
检测项目：菌落总数大肠菌群
样品名称
样品编号
样品状态和特性
生产单位
型号规格
使用仪器设备及试验环境
生化培养箱;压力蒸汽消毒锅
菌落总数
GB4789.2-2010
操作过程：
培养基
100
10—1
10—2
10—3
10—4
空白
cfu/ml（g）
平板计数琼脂培养基
注解：为进行此项目测试；+:阳性—:阴性（不产气）
微生物检验原始记录
检测项目：菌落总数大肠菌群
样品名称样品编号样品状态和来自性生产单位型号规格
使用仪器设备及试验环境
生化培养箱;压力蒸汽消毒锅
菌落总数
GB4789.2-2010
操作过程：
1、配制200mL平板计数琼脂培养基于250mL三角烧瓶中，配制0.85%的生理盐水300mL,分别吸取9mL生理盐水置于2个试管中，将三角瓶、试管加塞棉塞，用报纸包好。
煌绿乳糖胆盐肉汤
月桂基硫酸盐胰蛋白胨肉汤
煌绿乳糖胆盐肉汤
月桂基硫酸盐胰蛋白胨肉汤
煌绿乳糖胆盐肉汤
MPN/ml（g）
注解：为进行此项目测试；+:阳性—:阴性（不产气）
主检：检验日期：年月日验讫日期：年月日
6、选择样品匀液10-1、10-2、10-3，分别吸取1ml加入无菌平皿内，分别吸取1mL稀释液（无菌生理盐水）加入平皿内做空白。
7、将15-20mL冷却至46℃的平板计数琼脂培养就倾注平板内，并转动平皿，使其混合均匀，待琼脂凝固后将平皿翻转。
8、将平皿于36±1℃的生化培养箱内培养48h±2h,计数。
培养基
100
10—1

多管发酵法测定水体中粪大肠菌群的方法验证及质量控制作者：邓泽鲁朝旭袁姁王馥云余世东来源：《科技风》2021年第10期摘要：粪大肠菌群作为指示水体粪便污染的菌群，在环境监测中是很重要的项目。

本文通过对空白实验、阴阳性对照、精密度、准确度等试验，对新方法进行了实验室验证，并对不确定度、注意事项和优缺点等方面进行了探讨，为多管发酵法测粪大肠菌群的准确性提供一定参考和技术保障，希望能够更好地服务于环境监测工作。

关键词：粪大肠菌群;多管发酵法;不确定度;方法验证中图分类号：X832粪大肠菌群在微生物项目中是总大肠菌群中的一部分，主要用来表明水质受粪便污染的程度。

粪大肠菌群是一类能使乳糖发酵、产酸产气的需氧及兼性厌氧的革兰氏阴性无芽孢杆菌，在44.5℃培养24～48h能发酵乳糖产酸产气。

水体粪大肠菌群含量的高低与周边经济发展、企业影响、人口等因素密切相关，水体超标会影响整个流域生态环境，对人体健康极为不利。

通过对粪大肠菌群的监测，可了解水体受生活污水污染的状况。

目前，WHO、ISO以及世界上绝大多数国家都以粪大肠菌作为水质粪便污染指标菌。

粪大肠菌群适用于河流、湖泊等地表水、企业污水及医院废水的监测，是综合评价城镇污水尤其是生活污水污染的一个必不可少的重要指标[1-3]。

国际上测粪大肠菌群的实验方法主要有，多管发酵法、酶底物法、纸片法、滤膜法等，近几年来，我国在粪大肠菌群的监测方面取得了很大进步，粪大肠菌群的相关环境标准也在不断的更新。

我国刚刚也出台和变更了多管发酵法的新标准，酶底物法、多管发酵法等[1-2]。

我国多用多管发酵法进行检测。

1 方法1.1 监测方法[2]根据水样的污染程度，选择样品的接种量。

将样品加入在含乳糖蛋白胨培养基的试管中（根据样品浓度采取不同的培养试管或者三角烧瓶），在37±0.5℃培养箱里进行初发酵实验，培养24小时。

对于产酸产气的试管进行复发酵验证实验，轻微振荡试管，用接种环接种到装有EC培养基的试管中，在44.5±0.5℃下进行复发酵培养24小时，最后得出产气的细菌为粪大肠菌群。

产品名称： 生产批号：
大肠菌群检验原始记录
规格：
生产数量：
样品状态：
完好
异常
检验日期：
检验环境： 温度： ℃
湿度：RH
%
检验依据：《食品安全国家标准 蜜饯CB14884-2016》
检验方法：GB4789.3-2016（第二法）
操作过程： （1）吸取1ml样液于VRBA平板36℃培养24小时后，是否有沉淀环的紫红色菌落生产； （2）从合适稀释度上挑取典型和可疑菌落数（个）； （3）BGLB肉汤证实试验阳性管数。
样品序号
1 2 3 4 5 空白对照 典型和可疑菌落
稀释倍数
10-1
10-2
无 有
1
2
3
4
典型和可疑菌落
证实试验
最终结果 结论判定 检验员：
10-3
空白对照 数量
5
6
结果计算 （Cห้องสมุดไป่ตู้G/g）
备注
CFU/ml
7
8
9
10
复核员：

检 验 原 始 记 录
编号：
报告类别：
微生物
共页
项目：
大肠菌群coliforms
检验地点：
样品名称：
样品编号：
样品状态：
符合检验要求； 其他
环境条件：
实验依据及步骤
GB4789.3-2016
样品稀释
固体和半固体样品：称取25g样品置盛有225ml生理盐水或磷酸盐缓冲液的无菌均质容器内均质，或放入盛有225ml稀释液的无菌均质袋中拍击式均质器拍打，制成为1:10样品匀液。依次进行10倍递增稀释。
M：微生物指标的最高安全限量值
2.例：n=5,c=2,m=1cfu/g,M=10cfu/g,即从一批产品中采集5个样品，
若5个样品的检测结果均小于或等于m值（≤1cfu/g），则这种情况是允许的；
若≤2个样品的结果（X）位于m值和M值之间（1cfu/g≤X≤10cfu/g），则这种情况也是允许的；
若有3个及以上样品的检验结果位于m和M之间，则这种情况是不允许的；
MPN检索表
(CFU/ml)
n=5 c=2 m=1
1
2
3
4
5
1
2
3
4
5
1
2
3
4
5
1
2
3
4
5
1
2
3
4
5
数据分析与结果
一、菌落计数
根据证实为大肠菌群的阳性管数，查MPN检索表，报告大肠菌群的最可能数。
二、缓冲液
1.磷酸盐缓冲液
磷酸二氢钾 34.0g 蒸馏水500ml （稀释液需要1000ml）
贮存液：将34.0g磷酸二氢钾溶于500ml蒸馏水中，用大约175ml的1mol/l氢氧化钠溶液调节ph至7.2，用蒸馏水稀释至1000ml后贮存冰箱。

检测起止日期
检 测 依 据 □GB 4789.3-2010 第一法
□GB 4789.3-2010 第二法 □GB14934-94 次/秒 时间□1min□2min□3min mL □BGLB mL □VRBA □生化培养箱 36±1℃
检 测 仪 器 □电子天平 □拍击式无菌均质器 培 养 基
□LST（双料） mL □LST（单料）
大肠菌群计数原始记录
样 品 名 称 样 品 状 态 检 测 环 境 检 测 地 点
□常温 □冷藏 □ 第1页
样 品 编 号 样 品 数 量 接 样 日 期
月 250g 年 日～ 月 月 日 日
温度（T） ： □净化室 1
℃ ；相对湿度（RH） ：
□净化室 2 □BSL-2
检验 结果
样品中大肠菌群计数结果为：
纸片颜色及结果 均匀紫色 未检出 黄色背景上红点或红晕 检出
。
餐 饮 具
检测者： 日 期：
可以结果确证（发酵法） 异常颜色反应 需确证 未检出 检 出
复核者： 日 期：
审核者： 日 期：
mL □测试纸片
固体和半固体样品：无菌称取 25g，放入盛有 225ml□生理盐水/□磷酸盐缓冲液的无菌均质袋内，进 行均质处理。 液体样品：吸取 25ml 样品置盛有 225ml□生理盐水/□磷酸盐缓冲液的无菌丝口试剂瓶（含适量无菌 玻璃珠）中，混匀。 样 品 制 备 液体样品：直接吸混匀后的原液检验。 冷冻样品：45℃， min 解冻。 调节 pH。 餐饮具 检样量
10
1
0.1
0.01
0.001
0.0001
第 一 法
初发酵
阳性管数目 （24h） 阳性管数目 （48h） 阳性管数目

乳糖蛋白胨 发酵实验
乳糖胆盐 发酵实验
EMB 平板典型 菌落生长
革兰氏 染色镜检
乳糖蛋白胨 发酵实验
44℃，24h
37℃，18～24h
----
44℃，24h 44℃，24h
37℃，18～24h
----
44℃，24h
复核：
mL×5
样品接种量 mL×5
mL×5
MPN 值
报告值
(MPN/100mL) (MPN/L)
37℃，18～24h
----
44℃，24h
复核：
mL×5
样品接种量 mL×5
mL×5
MPN 值
报告值
(MPN/100mL) (MPN/L)
日期：
年月日
革兰氏 染色镜检 乳糖蛋白胨 发酵实验 乳糖胆盐 发酵实验 EMB 平板典型 菌落生长
革兰氏 染色镜检 乳糖蛋白胨 发酵实验
44℃，24h
37℃，18～24h
----
44℃，24h
44℃，24h
37℃，18～24h
----
44℃，24h
44℃，24h
37℃，18～24h
----
44℃，24h
44℃，24h
日期：
年月日
- -J219
样品编号
分析：
有限公司
年 月 日颁布
医疗机构污水 粪大肠菌群的测定原始记录（续表）
第 页共 页
分析步骤
培养条件
乳糖胆盐 发酵实验 EMB 平板典型 菌落生长
革兰氏 染色镜检 乳糖蛋白胨 发酵实验 乳糖胆盐 发酵实验 EMB 平板典型 菌落生长
革兰氏 染色镜检 乳糖蛋白胨 发酵实验 乳糖胆盐 发酵实验 EMB 平板典型 菌落生长