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β—葡萄糖苷酶及其应用β—葡萄糖苷酶（β-glucosidase）是一种重要的酶类，在生物化学、生物技术、医学和工业中都有广泛的应用。
β—葡萄糖苷酶作用于葡萄糖苷键，能够水解葡萄糖苷化合物，将其转化为葡萄糖和相应的醛或酮。
本文将介绍β—葡萄糖苷酶的性质、结构、应用以及其在生物工程领域的潜力。
β—葡萄糖苷酶是一种水解酶，广泛存在于植物、微生物和动物中。
在微生物中，β—葡萄糖苷酶在纤维素降解、半乳糖代谢以及多糖分解等生理过程中起着重要作用。
在植物中，β—葡萄糖苷酶参与了植物生长发育、种子萌发和植物抵抗逆境的过程。
在动物中，β—葡萄糖苷酶则参与了碳水化合物的代谢和营养吸收。
由于β—葡萄糖苷酶在生物体内起着重要作用，因此其在医药和食品工业中具有重要的应用价值。
β—葡萄糖苷酶通常被用于食品加工工业中，用于水解植物中的葡萄糖苷化合物，例如大豆异黄酮和花青素。
通过β—葡萄糖苷酶的作用，可以将这些化合物水解成为葡萄糖和其他生物活性物质，从而提高其生物利用率。
β—葡萄糖苷酶还被广泛用于啤酒、葡萄酒和果汁等酿造行业，帮助降解残留的酚类化合物，改善产品的口感和质量。
在医药领域，β—葡萄糖苷酶也具有重要的应用价值。
近年来，β—葡萄糖苷酶在抗癌药物的研发和生产中得到了广泛的应用。
一些天然产生的抗癌化合物以葡萄糖苷化合物的形式存在，通过β—葡萄糖苷酶的水解作用，可以将其转化为活性的抗癌物质，从而提高药物的疗效。
β—葡萄糖苷酶还被用于合成具有生物活性的化合物，为药物研发提供了有效的手段。
在生物工程领域，β—葡萄糖苷酶的潜力尤为巨大。
由于其具有水解葡萄糖苷化合物的特性，β—葡萄糖苷酶可以用于生物燃料的生产。
利用β—葡萄糖苷酶将植物细胞壁中的纤维素水解为葡萄糖，然后利用发酵工艺将葡萄糖转化为生物燃料，可以提高生物燃料的产量和质量，从而减缓对传统石化燃料的依赖。
β—葡萄糖苷酶还可以用于生物质降解和生物制药等领域，为生物工程技术的发展提供了强大的支持。
2.2实验方法2.2.1α-葡萄糖苷酶抑制活性的测定方法2.2.1.1 反应溶液的制备（1）配制底物PNPG溶液：精确称取0.3766gPNPG，加适量0.1mol/L磷酸缓冲液（pH为6.8）溶解，再用容量瓶准确定容到50mL，配制成25mmol/L的母液。
将母液分别稀释成0.1、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0mmol/L7个不同梯度的标准品溶液，备用。
（2）配制α-葡萄糖苷酶的酶溶液：将冻干酶粉（酶活力为14u/mg）用0.01mol/L磷酸缓冲液（pH为6.8）溶解，配制成2u/mL的母液。
再将酶液分别稀释，配制成0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、1.0u/mL的酶溶液，备用。
（3）配制DNJ标准溶液（抑制剂）：精确称取0.0010g DNJ 标准品，用容量瓶准确定容到10mL，配制成1000μg/mL DNJ标准母液。
将母液分别稀释成、1、5、10、20、40、60μg/mL六个不同梯度的标准品溶液，备用。
（6）0.2mol/L的Na2CO3：称取2.16g Na2CO3于烧杯中，加入适量蒸馏水溶解，并定容到100mL，4℃下保存，备用。
2.2.1.2 PNP标准曲线的绘制精确称取0.0278g对硝基酚（PNP），加0.01mol/L磷酸缓冲液（pH为6.8）溶解，再用容量瓶定容至10mL，即得20mmol/L母液。
用蒸馏水将其母液稀释成浓度分别为1、5、10、20、40、40、80和100μmol/L的标准溶液。
取100μl上述标准液，各加入150μL 0.2mol/L 的Na2CO3，混匀 1 min ，再于405 nm处测定其吸光度，得标准曲线方程：y=128.13x+0.3579 (R2 =0.9998)，其中y 为浓度，x为吸光值。
2.2.1.3 α-葡萄糖苷酶抑制活性的测定测定方法参照Masao Hattori等试验条件，并做调整。
实验分为空白组、对照组、样品空白组和样品组，各反应物按表中剂量在96孔板中进行加样，每组3个平行。
β-葡萄糖苷酶产生菌的筛选及产酶条件优化
陈显玲;苏龙
【期刊名称】《中国饲料》
【年(卷),期】2024()9
【摘要】本研究从实验室构建的微生物菌库中筛选获得1株β-葡萄糖苷酶产生菌株HHL,结合ITS序列分析方法鉴定其为米曲霉(Aspergillus oryzae)。
以β-葡萄糖苷酶酶活为考察指标,通过单因素试验及正交试验对其产酶条件进行优化。
结果显示:菌株HHL最优产酶条件为以改良察氏培养基为培养基,pH 6.0,接种量8%,培养温度35℃,培养时间144 h。
此条件下,产β-葡萄糖苷酶酶活为48.74 U/mL。
【总页数】5页(P60-64)
【作者】陈显玲;苏龙
【作者单位】广西科技师范学院食品与生化工程学院
【正文语种】中文
【中图分类】S816.7
【相关文献】
1.转半乳糖基β-半乳糖苷酶产生菌筛选鉴定、产酶条件优化及酶法制备乳果糖
2.产α-葡萄糖苷酶抑制剂乳酸菌的筛选及发酵条件优化
3.β-葡萄糖苷酶产生菌的筛选及其所产纤维素酶酶系组成分析
4.产β-葡萄糖苷酶菌株的筛选及产酶条件优化
5.一株产β-葡萄糖苷酶甘草内生菌的筛选、全基因组分析及产酶优化
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β-葡萄糖苷酶活性测定（新鲜土样）比色法的原理：以对硝基苯-β-D-吡喃葡糖苷为基质，水解产生对硝基酚，比色测定（硝基酚比色法）。
1.配置溶液：（1）改进的通用缓冲溶液（MUB）贮备液：12.1g 三羟甲基氨基甲烷（C4H11NO3 即 Tris）、11.6g 马来酸（C4H4O4）、14g 柠檬酸（C6H8O7）和 6.3g 硼酸（H3 BO3）溶于 500ml 1mol.L-1 NaOH 溶液中，用去离子水稀释至 1L，于 4℃下贮存。
（2） pH 值 6.0 的 MUB 缓冲溶液：在继续搅拌下，在 200ml MUB 贮备液中分别滴加 0.1 mol.L-1 HcL 或 0.1mol.L-1 NaOH 至溶液 pH 值为 6.0，去离子水稀释定容至 1L（3） 4-Nitrophenyl-beta-D-glucopyranoside 对硝基酚-β-D-吡喃葡糖苷（PNPG）溶液[C12H15NO8 =25mmol.mol-1]：0.377g PNPG 溶于 40ml MUB 溶液（pH 为 6.0）中，用相同 pH 值的缓冲液稀释至 50ml，于 4℃下贮存。
301.25（4） Cacl2溶液（0.5mol.L-1）：取无水Cacl2 55.49g 加入1L 的容量瓶中配置（5） Tris缓冲液[c（C4H11NO3）=0.1mol.L-1，pH 值 12.0]：12.2 g 三羟甲基氨基甲烷（Tris）溶于 800ml 去离子水，用 0.5mol.L-1 NaOH 调节 pH 至 12.0，去离子水稀释至 1L（6）标准对硝基苯酚溶液：溶解 0.500g 对硝基酚于 400ml 双去离子水中，定容到500mL，保存于 4 度，用时再稀释 10 倍。
稀释后为100ug.ml-1。
（一般需 1000ppm）2.试验过程(1)取 1g 新鲜土样(<2mm)于 100ml 三角瓶中，加 0.25ml 甲苯, 通风橱 10min 后，4ml pH 为6.0 的 MUB 溶液和 1mm PNPG 溶液，盖上瓶盖，充分混匀，在 37℃培养 1h。
土壤β-葡萄糖苷酶微板法土壤β-葡萄糖苷酶（soil β-glucosidase）是一种重要的土壤酶类，它在土壤有机碳循环和营养元素循环中扮演着重要角色。
本文将介绍土壤β-葡萄糖苷酶的微板法测定方法及其在土壤生态学研究中的应用。
β-葡萄糖苷酶是一类能水解葡萄糖苷键的酶，可将β-D-葡萄糖苷水解成葡萄糖和对应的配基。
它在生物体内广泛存在，包括植物、动物和微生物。
在土壤中，β-葡萄糖苷酶主要由微生物产生，参与碳、氮和磷等元素的循环过程。
微板法是目前常用的测定土壤β-葡萄糖苷酶活性的方法之一。
它通过利用培养基中的显色剂，如对氨基苯酚和氯化铵，与酶反应产生颜色变化，从而测定酶的活性。
这种方法具有操作简便、灵敏度高、准确度好等优点，被广泛应用于土壤生态学研究中。
微板法的步骤如下：1. 样品制备：收集土壤样品后，将其通过筛网过滤，去除大颗粒杂质。
然后将土壤样品加入适量的缓冲液中，使土壤与缓冲液充分混合。
2. 培养基制备：制备含有显色剂的培养基。
常用的培养基配方为：对氨基苯酚、氯化铵和磷酸盐缓冲液。
3. 混合反应：将土壤样品和培养基混合，使其充分接触。
然后将混合物均匀地分配到微孔板的孔中。
4. 孵育：将装有混合物的微孔板放入恒温培养箱中，以适当温度孵育一定时间。
常用的孵育温度为30摄氏度，孵育时间为24小时。
5. 颜色测定：孵育结束后，使用光谱分光光度计测定微孔板中孔的吸光度。
根据吸光度的变化，可以推算出土壤样品中β-葡萄糖苷酶的活性。
土壤β-葡萄糖苷酶的活性可以反映土壤中有机质的分解能力和微生物的活跃程度。
在土壤生态学研究中，通过测定土壤β-葡萄糖苷酶活性，可以评估土壤的健康状况、有机质分解速率和养分循环能力。
此外，β-葡萄糖苷酶活性还与土壤的物理化学性质、植被类型和管理方式等因素密切相关，因此可以用于土壤质量评价、土壤肥力改良和生态系统管理等方面。
土壤β-葡萄糖苷酶微板法是一种常用的测定土壤酶活性的方法，其操作简便、准确度高，在土壤生态学研究中具有重要应用价值。
化工能源化 工 设 计 通 讯Chemical EnergyChemical Engineering Design Communications·144·第47卷第2期2021年2月β-葡萄糖苷酶也称为β-D-葡萄糖苷葡萄糖水解酶，其可以水解释放出β-D-葡萄糖及相关配基。
1837年研究人员在苦杏仁中发现了β-葡萄糖苷酶，随后研究调查得出β-葡萄糖苷酶在植物和昆虫及细菌体内广泛存在，β-葡萄糖苷酶参与了生物体内的糖代谢过程，对维持生物正常的生理功能有重要作用。
β-葡萄糖苷酶参与EMP 糖酵解的途径属于参与双歧杆菌糖代谢的有关酶系。
哺乳动物和人体内的乳糖酶/根皮苷（LPH ）水解酶也包含着芳基-β-葡萄糖苷酶，乳糖酶/根皮苷由于涉及成人型乳糖酶缺乏病得到广泛实验研究，同时β-葡萄糖苷酶可以使得水果和蔬菜及茶叶中的风味前体物质水解为有浓郁天然风味的香气物质，可以协助纤维素酶降解纤维素[1]。
1 β-葡萄糖苷酶简介β-葡萄糖苷酶分布比较广泛，普遍存在于植物的种子和微生物中，动物中也存在着大量的β-葡萄糖苷酶，根据酶对底物水解所具有的专一性特点，β-葡萄糖苷酶主要有芳香基-β-葡萄糖苷酶和烃基-β-葡萄糖苷酶及多底物特异性β-葡萄糖苷酶三种类型。
根据酶的结构和催化结构域的氨基酸序列等特点对其分类时，糖苷水解酶的GH1和GH3家族中所包含着的β-葡萄糖苷酶最多[2]。
β-葡萄糖苷酶是纤维素酶当中不可缺少的重要方面，随着时代的进步发展，像目前我国的医疗、食品乃至其他行业领域内，都有β-葡萄糖苷酶的应用身影。
最为关键的是，在我国经济等方面迅速发展的基础上，所带来了环境污染问题，鉴于严重的环境能源危机下，社会各界人士对β-葡萄糖苷酶提出了极高的关注程度。
通过实际调查发现，在对β-葡萄糖苷酶实施水解过程中，还存在的很大的困难就是纤维素彻底降解为单糖。
站在基因工程与蛋白质工程视角下进行分析，已经获取到了良好的β-葡萄糖苷酶。
安徽农业大学学报,1998,25(3):304-309Journal of A nhui A gricultural U niversity黑曲霉Β-葡萄糖苷酶的活力测定和酶学性质Ξ李 平 宛晓春丁霄霖 陶文沂(安徽农业大学轻工学院,合肥230036)(无锡轻工大学)摘 要 以P-N PG为底物,通过底物浓度、反应温度、反应时间、反应pH的考察,确定了黑曲霉Β-葡萄糖苷酶酶活的最佳测定条件;并对该酶的pH稳定性、热稳定性、米氏常数等进行了研究。
关键词 黑曲霉 Β-葡萄糖苷酶 测定条件 性质分类号 T S20113Β-葡萄糖苷酶能将水果、蔬菜、茶叶等中的风味前体物质Β-糖苷[1]水解为具有浓郁天然风味的香气物质,以改良因加工、贮藏等因素造成对食品感官性状——风味的影响;同时还能协助纤维素酶将纤维素水解为葡萄糖[2],具有重要的理论和实用价值。
Β-葡萄糖苷酶的测定方法很多,概括起来主要有电化法、荧光法、分光光度法等。
电化法由Gu ilbau lt和K ram er[3]设计,以扁桃苷为底物,根据所产生的氢化物,用与自发(内)电解池相联结的一对银—铂电极来测定其葡萄糖苷酶活性;Rob in son[4]使用4-甲基伞形酮的Β-D葡萄糖苷作为底物,经Β-葡萄糖苷酶作用,专一地分解为具有强烈荧光的4-甲基伞形酮,此荧光法灵敏度高且快速;分光光度法[5]可用水杨苷为底物,将水杨苷裂解为水杨醇和Β-D葡萄糖,然后对所产生的葡萄糖进行比色测定;也可用熊果苷(Β-D-葡萄苷-对苯二酚)作为底物,对产生的葡萄糖可用碘量法加以测定;另外还可用对-硝基苯基-Β-D-葡糖苷(P-N PG)为底物,对产生的对—硝基苯进行比色测定。
本试验采用P-N PG为底物的比色测定法,该法简单、快速、灵敏度高[6],且所需仪器常见。
1 材料与方法111 材料菌种:黑曲霉,来源于无锡轻工大学。
培养基:斜面保藏培养基,PDA;发酵培养基,麸皮3%,(N H4)2SO4012%,另加适量无机盐溶液。
第26卷第2期2007年3月 食品与生物技术学报Journal of Food Science and Biotechnology V o l.26 N o.2M ar. 2007 文章编号:1673-1689(2007)02-0107-08 收稿日期:2006-12-29.作者简介:李华(1959-),男,重庆梁平人,教授,博导,主要从事分子生物学及葡萄与葡萄酒方面研究.Email :putj@β-葡萄糖苷酶活性测定方法的研究进展李华, 高丽(西北农林科技大学葡萄酒学院,陕西杨凌712100)摘 要:介绍了葡萄和葡萄酒中β-葡萄糖苷酶的研究概况,理化性质、酶活测定方法,以及不同来源的酶活检测的研究概况,并且经过分析提出以对硝基苯基β-D -葡萄糖苷(pN PG )为底物检测葡萄浆果中的β-葡萄糖苷酶酶活的关键影响因素:粗酶液的制备、酶最适反应温度、最佳反应时间、缓冲液类型和pH 及最佳吸收波长。
关键词:葡萄;β-葡萄糖苷酶;活性中图分类号:Q 55文献标识码:AResearch Advance on Methods of determining β-Glucosidase ActivityLi Hua , GAO Li(Colleg e of Enolo gy ,N o rthwest Univ ersity of A g riculture &Fo restry ,Yangling 712100,China )Abstract :Aro ma is one o f the impor tant factors that determining the character and quality o f w ine.β-g lucosidase is a kind of key enzy me w hich releasing aroma precurso rs.In this manuscript ,the prog re sses of the chemical pro perties ,determination methods ,and the source o f β-g lucosidase w ere review ed.On the o ther hand ,the key facto rs that involv e in the β-gluco sidasedetermination method w ith p -Nitrophenyl -β-D -gluco py ranoside as substrate as follow :tem perature ,reactio n tim e ,buffe r type ,pH and abso rb w avelength.Key words :g rape ;β-glucosidase ;activities 典型的葡萄酒风味主要源于葡萄中的挥发性化合物,然而葡萄浆果中存在着游离态和结合态两大类呈香物质。
葡萄糖苷酶（NAG）测定的标准操作程序【应用范围】体外检测血清和尿液中NAG活性浓度。
【适用仪器】Olympus AU-2700全自动生化分析仪。
【程序改变】严格遵循仪器、试剂说明书及校准品使用说明。
【方法学原理】NAG催化PNP－NAG水解，生成产物对硝基苯酚（PNP），经一定时间后终止反应，并使PNP显色，在规定波长下检测PNP引起的吸光度高值，推算样品中的NAG活性。
在尿NAG测定的同时，测定尿肌酐（Cr ）浓度，计算出NAG活性（U/L）与Cr浓度（mmol/L）的比值，借以消除尿液浓缩和稀释浓度对结果的影响。
【试剂】1.成份：低物液每升内含：对硝基苯－β－D氨基葡萄糖苷9.8克、18－冠5醚50ml、叠氮钠1克；缓冲液每升内含：PH4.6柠檬酸－柠檬酸三钠100mmol/L、叠氮钠1克；终止液每升内含：氢氧化钠4.0克。
2.校准品：Electrollyte CAL 1、Electrollyte CAL 2。
3. 质控品：Randox Assayed Multiseral Level 2 and Level 3。
【标本收集与准备】1.血清或血浆标本根据实验室标准采集程序采集标本，适用标本为血清或肝素抗凝血浆（肝素钠抗凝结果高0.5mmol/l），不可从正在静脉滴注手臂上采血，上机标本不能有凝块，样品采集后2天内离心标本，分离血清，血清或血浆标本室温保存4天，冷藏7天，冷冻保存6个月。
血清或血浆钠结果高于线性不建议稀释。
2.尿液标本定时或随机尿标本，不可加防腐剂，根据实验室标准采集程序采集标本，室温保存24小时，冷藏7天，冷冻保存6个月。
尿钠高于线性可用双蒸水对倍稀释。
【操作步骤】1.仪器测定参数设置Test Name:Sample: Volume L Dilutio LL Dilutio LLSec. ODMethod: First LLast LReaction Slope:Measuring Last LMeasuring LastLinearity ANo-Lag-Time:2.试剂准备：将准备好的试剂置仪器试剂盘中（8℃）。
本科毕业论文题目红佳酿酵母β-葡萄糖苷酶酶活测定条件优化学院食品科学与工程学院专业生物工程毕业届别2014届姓名贾滔指导教师王婧职称副教授甘肃农业大学教务处制二〇一四年六月目录摘要 (1)前言 (2)1 材料与方法 (2)1.1 试验材料 (2)1.1.1 供试菌株 (2)1.1.2 主要药品 (3)1.1.3 供试培养基 (3)1.2 试验方法 (3)1.2.1 菌株活化 (3)1.2.2 粗酶液的制备 (3)1.2.3 β-葡萄糖苷酶活力的测定 (4)1.2.3.1 标准曲线绘制 (4)1.2.3.3 酶活力计算 (4)1.2.4 酶活力测定条件的优化 (4)1.2.4.1 单因素试验 (4)(1) 反应时间的选择 (4)(2) 反应温度的选择 (4)(3) 缓冲液pH值的选择 (5)(4) 底物浓度的选择 (5)1.2.4.2 酶活力测定的正交试验 (5)1.2.5 数据处理统计 (5)2 结果与分析 (6)2.1 单因素试验结果分析 (6)2.1.1 反应时间对酶活力的影响 (6)2.1.2 反应温度对酶活力的影响 (6)2.1.3 底物浓度对酶活力的影响 (7)2.1.4 缓冲液pH对酶活力的影响 (7)2.2 正交试验 (7)2.2.1 数据处理统计 (8)3 讨论 (9)4 结论 (9)参考文献 (10)致谢 (11)红佳酿酵母β-葡萄糖苷酶的酶活测定条件优化贾滔（甘肃农业大学食品科学与工程学院生物工程班2010级）摘要：以红佳酿酵母菌株为出发菌株，对其β-葡萄糖苷酶的酶活性测定条件进行研究。
通过单因素试验研究了缓冲液pH值、反应时间、反应温度、底物浓度对β-葡萄糖苷酶活力的影响，并采用正交试验确定了最佳酶活测定条件。
结果表明：缓冲液pH值5.0；反应时间为10min;反应温度为50℃；底物浓度为40mmol/L，在此条件下红佳酿酵母β-葡萄糖苷酶粗酶液的酶活力最高，达到47.58±0.58U/mL。
关键词：红佳酿；β-葡萄糖苷酶；酶活;测定方法；优化To optimize the measurement conditions about enzyme activity ofvintage r ed β- glycosidaseJia Tao（Gansu Agricultural University Food science and engineering college Biologicalengineering class The class of 2010）Abstract: In order to research the measurement conditions about enzyme activity of β-glycosidase ，use vintage red strains for test strains．The effect of buffer pH value，reaction time，temperature and substrate concentration on enzyme activity of β- glycosidase was studied by the method of single factor experiment，and we determines the best conditions for the enzyme activity by applying the orthogonal test ．The results showed that enzyme activity of Red wine yeast β- glycosidase is the highest under the condition of buffer solution pH value was 5.0，reaction time was 10min，temperature was 50℃and substrate concentration was 40mmol/L．Reached 47.58 ±0.58U/mL。
Key words : Vintage red; β-glucosidase; Activity; Determination; Optimization前言β-葡萄糖苷酶（β-D-Glucosidase，EC3.2.1.21），全称β-D-葡萄糖苷葡萄糖水解酶，别名龙胆二糖酶、纤维二糖酶（cellobias，CB或β-G）和苦杏仁苷酶。
它属于纤维素酶类，是纤维素分解酶系中的重要组成成分，能够水解结合于末端非还原性的β-D-葡萄糖键，同时释放出β-D-葡萄糖和相应的配基。
1837年，Liebig 和Wohler 首次在苦杏仁中发现β-葡萄糖苷酶[1]，因此苦杏仁成为了β-葡萄糖的经典来源。
随着现代科学的不断进步，在很多地方都发现β-葡萄糖苷酶较普遍的来源是植物的种子和微生物。
β-葡萄糖苷酶主要用于纤维素的降解[2]、葡萄酒的增香[3]等。
β-葡萄糖苷酶可水解糖苷键合态风味前体物，是葡萄酒风味修饰的关键酶[4]。
葡萄酒中的β-葡萄糖苷酶来源于葡萄果实、商品酶制剂（多源于丝状真菌）、酵母（酿酒酵母和非酿酒酵母）和乳酸菌[5]，其中酵母来源β-葡萄糖苷酶在酿造过程中起着重要作用[6]。
因此建立葡萄浆果和葡萄酒中β-葡萄糖苷酶活性的快速准确的分析方法，对于增强葡萄酒中的香气和提高葡萄酒的质量意义重大。
β-葡萄糖苷酶的活性测定方法很多，常见反应底物有对硝基苯-β-D-葡萄糖苷(pNPG)、纤维二糖、水杨苷等。
由于酶与pNPG作用产生的对硝基苯可用分光光度法在400 nm处测定，方法简单、反应快速、反应活性大，所以大多数实验采用pNPG作为底物的分光光度法测定酶活性[7]。
但据文献中p-NPG法测酶活力时所用的反应时间、反应温度、反应pH和底物浓度等条件各不相同，因此不同来源β-葡萄糖苷酶酶学性质有较大差异，导致酶活力定义有所不同，使得各文献中菌株酶活力的大小难以比较[7]。
本试验采用国内目前葡萄酒产业普遍应用的商业酿酒酵母中胞外酶活较高的菌种之一红佳酿酵母菌（VR），对其所产的β-葡萄糖苷酶的测活条件进行优化。
通过单因素及正交试验优化酶活力测定条件，旨在为统一酵母来源β-葡萄糖苷酶活力测定方法，促进高产菌株筛选及其产酶条件的研究提供理论依据。
1 材料与方法1.1 试验材料1.1.1 供试菌株商品酵母：Vintage Red(VR)，意大利Enartis公司。
1.1.2 主要药品p-NPG(4-Nitrophenyl β-D-glucopyranoside，纯度＞98%)，美国Sigma公司；蛋白胨，酵母浸粉购自北京奥博星生物技术有限责任公司；对硝基苯酚（p-NP）购自天津市凯信化学工业有限公司；葡萄糖，无水磷酸氢二钠，柠檬酸，无水碳酸钠等均为国产分析纯。
1.1.3 供试培养基YPD液体培养基：葡萄糖20g/L，蛋白胨20g/L，酵母浸粉10g/L，超纯水，pH5.0；121℃灭菌20min。
产酶（发酵）培养基：酵母浸膏1.0%，蛋白胨2.0%，葡萄糖2.0%，NH4NO3 0.3%, KH2PO4 0.4%,121℃，灭菌20min, 在温度降为70℃左右加入0.1% 对硝基苯酚β-D葡萄糖苷( p-NPG)。
1.1.4 主要仪器与设备CP214电子天平(上海奥豪斯仪器有限公司)；HH-S型恒温水浴锅（金坛市恒丰仪器制造有限公司）；Genesis 10s紫外可见分光光度计(美国Thermo Scientific公司)；GZX-GF101-II电热恒温鼓风干燥箱(上海跃进医疗器械有限公司)；18100摩尔超纯水机(重庆摩尔水处理设备有限公司)；H2050R台式高速冷冻离心机(长沙湘仪离心机仪器有限公司)；NRY-200空气恒温摇床(上海南荣实验室设备有限公司)；SW-CJ-2FD洁净工作台(苏净集团苏州安泰空气技术有限公司)；SPX-150-II生化培养箱(上海跃进医疗器械有限公司）；1.2 试验方法1.2.1 菌株活化按推荐用量（0.2g/L）称取5℃保存的供试商品活性干酵母（红佳酿），接种至50倍体积的YPD液体培养基中，37℃活化20min。
1.2.2 粗酶液的制备活化后的菌株按10%接种量接种至装有50mL(250mL 三角瓶)的发酵培养基中，28℃，180r/min ，摇床培养48h ，将发酵液8000r/min 离心10min ，去除沉淀，收集上清液即为粗酶液。
试验重复3次。
1.2.3 β-葡萄糖苷酶活力的测定 1.2.3.1 标准曲线绘制称取对硝基苯酚139.0mg ，用蒸馏水定容至1000mL ，分别吸取该溶液1.0mL 、2.0mL 、3.0mL 、4.0mL 、5.0mL 、6.0mL 于100mL 容量瓶中，用1mol/L Na 2CO 3溶液定容后混匀。
以蒸馏水作为空白，于400nm 处测其吸光值。
以p-NP 溶液浓度（μg/mL ）为横坐标，吸光度（y ）为纵坐标绘制标准曲线方程，得线性回归方程、相关系数分别为：y=19.882x+0.0017，R2=0.9991，n=5。
1.2.3.2 β-葡萄糖苷酶活力性测定胞外酶：取100μL 上清液，加入200μL p-NPG （5mmol/L 溶于pH 值5.0柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲溶液中，P-C 缓冲液）混匀，50℃反应30min ，立即加入2mL 1mol/L Na 2CO 3终止反应并显色，于400nm 下测定吸光值[8]。
摩尔消光系数为：ε=18300M-1·cm-1[9]β-葡萄糖苷酶酶活力单位（U ）定义为：在pH5.0，50℃反应条件下， 1毫升酶液1分钟水解p-NPG 产生 p-NP 的量（nmol ）为一个酶活单位（U ）1.2.3.3 酶活力计算NVc U ⨯=1.0*t *酶活式中：U 为酶活力单位（U/mL ），c 为对硝基苯酚的浓度，V 为反应体系的体积，N 为原酶液稀释倍数，t 为反应时间，0.1为所取上清液或细胞液的体积。
1.2.4 酶活力测定条件的优化 1.2.4.1 单因素试验 (1) 反应时间的选择取 0.1mL 粗酶液与 0.2mL 5mmol/L p-NPG （pH 值5.0的柠檬酸-磷酸盐缓冲液配制）混匀，在50℃条件下10min 、 20min 、40min,、50min ，加入2mL 1mol/L Na 2CO 3终止反应并显色，于400nm 下测定吸光值计算其酶活力，试验重复三次，确定最佳反应时间。
(2) 反应温度的选择取0.1mL 粗酶液与0.2mL 5mmol/L p-NPG（pH值5.0的柠檬酸-磷酸盐缓冲液配制）混匀，分别在40℃、45℃、50℃、55℃、60℃条件下反应10min，加入2mL 1mol/L Na2CO3终止反应并显色，于400nm下测定吸光值计算其酶活力，试验重复三次，确定最佳酶促反应温度。
