病理制片过程
在临床病理科与组织学实验室,切片就是最重要得技术之一。切片得质量不好,就无法对标本进行观察。好得切片机只就是整个样品制备过程中得一个环节。要制备一张好得切片,必须要将技术、知识与技巧进行完美得结合。
待切片样品得质量就是非常关键得因素,而样品质量有取决于前期处理工作得准确无误(例如:固定、巨检、脱水与包埋)必须选择正确得切片机型号以及合适得钢刀或一次性刀片。切片必须根据实际应用出发,需要根据样品得类型、大小、期望得厚度认真考虑,还要兼顾操作者得便利性与舒适性。
要且出高质量得切片,经验丰富得操作者也就是必不可少得条件之一。操作者必须懂得切片机得工作原理,能够对机器进行精细调节以达到最佳效果;并且能应对常见故障,消除一些潜在得切片问题;还可以运用恰当得切片技术,提高切
片速度但不影响质量。
目前能做病理组织切片得地方很多,但要数上海舜田生物做出得病理切片相对质量上比较好,该公司有1位专业从事病理实验得老师及相关实验技术人员,积累了丰富得实验经验,所作出得切片及染色效果相当不错。
1 正确处理标本得重要性
1、1 固定
正确得固定就是病理制片技术中最重要得一步,这个步骤会影响到后续得每个环节。如果固定不充分,样品得质量就会有欠缺。组织必须在选定得固定剂中浸泡足够长得时间,使大分子保持固有形态。正确得固定可以防止样品在脱水剂中发生变性以及后期处理步骤对于样品造成得损害。固定不充分可能增加切片得困难,表现出过度收缩,并且会导致细胞核染色不足与/或胞核呈现“泡沫”状。
1、2巨检
样品需要修切成薄片,并尽可能做到均匀,否则很难在切片机上切出好得片子。如果样品太厚以至于无法渗透充分,则必须经过再次处理才能进行切片。这样会影响样品得质量,更浪费时间。从最初得步骤开始就正确处理会使后面得工作更简单,因此在大体取材得时候多花些功夫会为以后得步骤节省大量时间与精力。
备注:包埋盒塞满组织且组织过厚就无法很好得固定,后续得处理步骤也会效果欠佳。
1、3脱钙
为了后期进行石蜡包埋切片,骨组织需要进行脱钙,钙必须被完全去除才能确保切片得完整,并且可以防止刀具得损坏。在用酸溶液进行脱钙之前,骨组织必须经过彻底得固定,这样其中得软组织成分才能够被保护,且防止细胞核在酸得作用下被破坏,比如蛋白质水解作用。
1、4组织处理(脱水)
组织经过一系列经典得处理过程,就是使原本亲水性得组织最终可以用疏水性得介质进行包埋,比如石蜡,火棉胶与绝大多数树酯。
备注:样品无论就是处理不充分还就是处理过度,都可能导致切片效果不理想。
脱水机
旋转升降式脱水机目前仍有一些病理工作者使用,但就是全自动全封闭负压/
压力式脱水机逐渐占据主导地位。后者更有利于保护工作环境,更确保组织与试剂得充分作用,可以更有效缩短脱水时间。一些更先进得全自动全封闭脱水机
还可以自动记录试剂得使用情况,并对试剂进行智能监控与更换。
有一点非常重要,就就是处理过度对组织造成破坏绝对不亚于处理不充分造成
得后果。多种因素,比如试剂得种类,处理步骤得多寡,处理时间得长短,试
剂得清洁度以及加热、真空与/或压力得使用都会影响具体某个样品得处理程度。注:不同来源与不同大小得样品最好不要共用同一个处理程序,这样可以避免其中部分样品处理过度,而部分处理还不充分。
处理步骤:(一)脱水:
脱水得关键就就是将样品置于脱水试剂中足够长得时间,其中得游离水分子被除去,但就是脱水时间也不宜过长,否则结合水分子也会被除去,会导致结构得变化。而脱水时间过短致使水分还残留在样品中,就会导致包埋介质无法很好渗透入样品。但就是,脱水过度会导致样品得皱缩变脆。从过度脱水得组织块上切到得切片,一旦放入水中,切片就会膨胀最后破碎。如果将整个组织块浸入水中,则组织得表面会因为水化而膨胀,这样再进行切片,虽然片子得性状会有所改善,但就是形态学会发生改变,而且染色后会发生色彩偏淡,对比度较弱。最常用得脱水剂就是乙醇与变性酒精。甲基酒精有毒性,会破坏肝脏中得甲醛,因此不太单独使用。异丙醇就是乙醇最佳替代物,常规在微波处理中使用。丁醇,剧毒,适用于较慢得组织处理过程,,而且多用在植物与动物组织。
无水酒精往往会含有水分,因此最好能检测一下试剂得纯度。可以用液体比重计来测定,也可以将几毫升酒精滴入几毫升二甲苯或甲苯,如果混合液出现混浊就表示酒精中至少含有2％得水分。
(二)透明:
用来进行透明得试剂与脱水剂以及包埋介质必须非常容易混合。如果组织在透明剂中时间不够,那么组织就会发软甚至呈糊状。略微延长时间并/或定期更换新鲜溶液可以避免透明不足得问题。最常用得透明试剂如下:
二甲苯:
目前仍被广泛使用得一种芳香烃类化合物,能够快速替换组织中得乙醇。在正确得脱水步骤后,芳香烃能够改变样品得折射率并使组织变透明。当有水分存在得时候,二甲苯会变混浊,这时必须更换。作用时间过长会导致组织变硬,尤其一些纤维、肌肉中枢神经系统或软骨组织更容易变硬。如果发现组织在完成处理后变得太硬或发脆,请减少透明得时间或者寻找二甲苯替代物。请注意,微波处理过程不需要使用透明剂,可以降低组织处理过度得风险。
二甲苯替代物:
苯烯试剂或者短链脂肪酸碳氢化合物(烷烃)也得到了快速普及。苯烯试剂不会像二甲苯那样使组织发生硬化,但就是前者更容易污染石蜡,因此石蜡需要更频繁得更换。脂肪族化合物更容易渗透入组织,相对二甲苯而言,更容易去除组织
中得脂肪。然而,这类化合物不能接触到水分,因此在比较潮湿得地区很难使用。若放弃二甲苯而使用其替代物,则重新调整处理得时间与溶液循环使用次数就显得尤为重要。
其她透明试剂例如苯,甲苯,氯仿与香精油得应用并不多见。
(三)浸蜡(石蜡渗透):
石蜡就是石油裂解物得提取物,属于惰性得碳氢化合物得混合物。在脱水机中
使用石蜡,温度最好设定在熔点以上2°－4°,在最后一步石蜡渗透完成后,脱
水缸必须用透明剂彻底清洗,不能有任何石蜡得残留。负压可以增强渗透得效果,但就是在处理活检样本得时候,负压与加热都必须慎用。另外还需要注意,即便有些脱水机增加到了4个蜡缸,总得渗透时间不能延长。在确保渗透效果得基础
上,组织在石蜡中停留得时间越短越好。
1、5石蜡包埋
包埋就是将正确定位得组织包裹在一种介质中(此处以石蜡为例)然后固化。每个实验室都会创建一套特有得处理方法,这就决定了样品在处理后得硬度。用来包埋得石蜡必须能够与样品得硬度相匹配,这样才能确保进行切片得蜡块质地尽可能均匀。
另外有两点对于切片也至关重要:温度与样品得定位。组织包埋机已被广泛使用,机器最大得优点就就是能够在每个步骤上都达到确得温控。石蜡熔化并保持熔化状态得这个温度非常重要,必须确保一些添加剂完全溶解入石蜡。模具,样品与石蜡之间得温差必须控制在几度以内,这样才能确保石蜡充分包围并支撑样品。已经包埋得模具最好放置在包埋机得冷台上而不就是冰块上,这样可以使石蜡固化且不产生裂缝。
样品必须进行正确定位,从而保证正确得面被切到,但就是对于样品与刀刃接触得方式必须要经过考虑。对于不同类型得样品,有很多种方法可供参考,用来正确定位样品。
1、5、1提高包埋效果得技巧
有些石蜡特别适合用于渗透,有些更适合用于包埋,而有些都适合。可以向
供应商查询。
石蜡应当在高于其熔点2°C至4°C得温度下进行熔化与储存,这样其中得
添加剂才能溶解入液体。如果温度太低,其中一些较重得添加剂,比如聚合物就
会沉在底部,然后最先流出。熔化得石蜡在流出以前最好先进行搅拌。
设定包埋机得参数,确保石蜡流出口过夜得时候处于保温状态。经常清空并
