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WesternBlot（个人版）

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WesternBlot（个人版）

Western Blot 实验方法

一蛋白提取

1、切取组织，置于已经用记号笔标记好的EP管底，称重（mg）插入冰盒中，注意不同样品间所用剪刀、刀片、镊子等要擦拭干净。

2、配置裂解液：980ulRiPA+10ul10%PMSF+10ul蛋白酶抑制剂混匀机混匀。

3、每EP管中加裂解液(10ul/1mg)，超声（time --pulse--AMPL- -start--O）5s停5s循环1min ,振幅25%（AMPL参数）,再裂解30min 。

4、于40C冷冻离心机中预冷15min，1200r/min.将裂解后的组织液离心15min，取上清即为所提蛋白，至于一个试管内，用酶标仪测浓度，再高温变性，再上样，多余的试剂置-80℃保存。

5、用玻璃小烧杯配制定量用的试剂：（2mlH2O+500ul考马斯亮蓝）+36ulH2O+4ul 样品，另加一个标准品BSA(10ul/ml)对照组，一个空白对照组。

6、(4倍)上样缓冲液稀释成（1倍），即:30ul上清液+10ul(4倍)上样缓冲液（红色的，购买的），震荡混合+离心，高温振荡机中变性，950C，5min，注意使离心液全部流于底部，准备跑电泳。

7、测595nm吸光度，打开盖预热30min，每次都将空白校正0，读取标准品对照组，样品组的吸光度，尽快。比色皿水洗+酒精洗。

8、建Excel：

（一）Cx=Ax/A标。C标（C标=10ug/ml ,由30ul稀释至40ul,

A标已经知道的）

（二）一般上样量为：30ug, 故: 30ug上样量/(0.75Cx)=V上样（ml）由（一）（二），得：V上样=A标/Ax .4

二配胶

1、提前配板：洗板，吹干，对齐，夹紧（向下压），配分离胶（两块板10ml），灌胶，压水，观察是否漏液，出现分界面，配浓缩胶（两块板4ml），若温度太低不易凝，可将分离胶中10%APS,TEMED同时加倍促凝.将配胶用烧杯洗净干燥，配胶：

10％分离胶5％浓缩胶

10ml(两快板) 15ml(三快板) 4ml (l两块板) 6ml(三块板) H2O

4.0ml 5.9ml 2.7ml 4.1 ml 30％丙稀酰胺 3.3ml 5ml 670ul 1.0

Tris-HCL 2.5ml（1.5M，Ph8.8）3.8ml 0.50ml（1.0M，Ph6.8）0.75ml 10％SDS 100μl 150ul 40μl60ul

10％APS（聚合剂，现配，灌胶前加入）100μl 150ul 40μl60ul

TEMED（加速剂，灌胶前加入）4μl 6ul 4μl6ul

2、根据板子数计算所需胶的体积数，根据比例配制胶液，为铺胶平整下层胶铺好后立即UP水封，待胶干后倒去上层UP水并用滤纸吸干，按比例配制浓缩胶（积压胶），最后上梳子（注意孔数、厚度与玻璃板搭配）；补液。

3、制好胶的玻璃板，仔细观察可以看到一条水平的折线，如若不用，浸泡在电泳液里。

三上样及电泳

1、电泳液的配制：up水（1000ml）,tris(3.03g),甘氨酸（18.8g）,SDS （1.0g）.

2、将两块配好胶的玻璃板薄面相对，夹好（注意对齐，防止漏液），中间倒入电泳液（注意拿错电泳架，分为：有电机的和无电极的），一般两块板的电泳液加到下面的线下面，四块板就加到上面线的刻度下。

3、若电泳液不渗漏，即可拔去梳子（注意两边同时用力，平整拔出）。

4、按上样量点样，每块板子第一孔为Mark（上样量为8-10ul），后面为样品，不用样品间换枪头。

5、将点好样的胶板放入电泳槽，槽内加适量电泳液，注意正负极连接.

6、打开开关，调整电压(80V)、电流（250mA）时间(30min)，开始电泳,结束后，调节电压（110V）、时间（60min）。 四转膜

1、转膜液的配制：up水（800ml）,tris(3.03g),甘氨酸（14.4g）于40C置于冰箱，用时加甲醇200ml（20%）搅拌混匀。（记得用的时候要加啊）

2、按海绵大小剪滤纸（上下共8张）、NC膜，放在电泳槽内，使之与转膜液充分浸泡.

3、将转膜夹打开，透明面（正极）朝下，上面依次放置：海绵、滤纸（4张）、NC膜、胶带、滤纸(4张)、海绵（胶带与膜之间不要有气泡），然后将黑色面压下，夹好,注意NC膜一直要保持湿润。

4、电泳完毕后，将玻璃板拆卸下来，薄板和厚板分离（小心避免撬碎玻璃板）；将带有胶的板子下方衬白色滤纸，读出Mark标记，用绿色小平板撬开玻璃板，将浓缩胶去除，将分离胶切去左上角以标记正反面，将胶放入平皿，平衡30min；根据标记切胶（切割时注意水平），选取含有目的蛋白的胶条（ASIC蛋白分子量72，为兔抗。Actin作内参考43，为鼠抗），切好的蛋白胶条放在转膜液里浸泡一下以减小表面张力，铺胶带时，注意条带的左右顺序，用圆珠笔标记。

5、放入4℃冰箱，连接电极，黑对黑，红对红，打开电源，调整电压（300V）、时间（1.5h），开始转膜。(总蛋白：100-130,40-55)

六封闭

1、配制TBST缓冲液:UP水（996ml）,NacL(8.5g),Tris(6.057g),用盐酸调Ph 值至7.5-7.6（4管0.9mlHcl）,最后加Tween20(500ml)，注意 Tween20粘稠，将枪头去尖嘴后吸取。

2、配制封闭液：一般配制的是BSA(5%):40mlTBST+2.0gBSA,

置于塑料器皿或半个牛奶盒中，于摇床摇匀1.0小时。

3、一抗孵育：

（1）1%的BSA配制：称取0.04gBSA加到装有4mlTBST溶液的4ml小管中。（2）配制一抗缓冲液配制1%的脱脂奶粉与TBST液中（W/V）,按1:200稀释ASICI 抗体。(本实验室：1%的BSA：一抗=4ml:1ul，一般每条带2ml).(具体见抗体说明书) （2）用压塑机做塑料袋（先封住相邻两边，每边封两道防漏，尽量撑展），将膜取出移入塑料袋中，标记，正面向上。然后再封住一边，加入一抗缓冲液5ml，排气泡，封最后一边；放在4℃冰箱的摇床上摇动（正面朝上，尽量用最快速度），过夜（一般大于18小时）。

（3）剪开塑料袋，将膜取出放入皿中用一定量的TBST洗膜，10min×3次,一抗回收，放入冰箱。

4、二抗孵育：

（1）1%的BSA配制：称取0.04gBSA加到装有4mlBTST溶液的4ml小管中。（4）二抗缓冲液的配制：配制1%的脱脂奶粉与TBST液中（W/V）,稀释HRP标记的二抗（GLU用兔抗:1:3000，β-actin用鼠抗：1:3000）(本实验室：1%的BSA：二抗=4ml:1ul，一般每条带2ml).(具体见抗体说明书)

（2）用压塑机做塑料袋（先封住相邻两边，每边封两道防漏，尽量撑展），将膜取出移入塑料袋中，标记，正面向上。然后再封住一边，加入二抗缓冲液5ml，排气泡，封最后一边；放在摇床上摇动1.0小时（正面朝上，尽量用最快速度）。（3）剪开塑料袋，将膜取出放入皿中用一定量的TBST洗膜，10min×3次。

七化学发光检测

1、取出化学发光试剂盒（4℃避光保存），在开启之前平衡至室温。黑白瓶各取2ml，共4ml（要求的体积是膜面积×0.125ml），吹打混匀。垫保鲜膜，将膜正面朝上置于保鲜膜上，加2ml混合的检测试剂于膜上，饭盒盖盖住，室温孵育5min；吸掉发光液，放入化学发光仪（Omega 16ic）内检测：化学发光曝光10－15min。

2、将Western Blot产物进行条带灰度分析，用Gel-Pro

Analyzer专业分析软件读取IOD值。以目的蛋白的IOD值/内参的IOD值半定量蛋白的水平。结果进行方差分析，以P<0.05为具有统计学意义。

Western Blot实验

成功完成Western Blot检测，必须满足4个条件：（1）凝胶洗脱：转移期间蛋白质必须从凝胶中洗脱出来，如果蛋白质还截留在凝胶中，将无法在膜上进行分析（2）吸附到膜上：在转移过程中蛋白质必须吸附到膜上，如果蛋白不吸附，将无法在膜上进行分析（3）处理期间仍截留在膜上：在转移后的处理过程中蛋白质必须保持吸附在印迹膜上（4）处理过程中可接近：被吸附的蛋白质必须能够与检测试剂接触，如果蛋白质被掩盖则无法检测成功进行WB检测，则设置合适正确的对照是必不可少的，只要正确设置了这些对照，即可快速和准确的找到WB的问题所在，并保证实验结果的准确性和特异性！一般需要设置的对照如下：

阳性对照：明确表达检测蛋白的组织或细胞，用于检测抗体的工作效率

阴性对照：明确不表达检测蛋白组织或细胞，用于检测抗体的特异性

二抗对照：不加一抗，用于检测二抗的特异性

内参对照：检测标本的质量和二抗系统

空白对照：不加一抗和二抗；用于检测膜的性质和封闭的效果

WB检测基本过程

1、获取细胞或组织裂解物

1)根据检测蛋白的位置选择合适的裂解buffer：

蛋白位置推荐buffer

全细胞NP-40 or RIPA

胞浆（可溶性蛋白）Tris-HCl

胞浆（骨架结合蛋白）Tris-Triton

膜蛋白NP-40 or RIPA

核蛋白RIPA or 核蛋白提取试剂盒

线粒体蛋白RIPA or 线粒体分离试剂盒

亦可购买商业化的蛋白提取试剂盒来保证标本制备的质量

2)选择合适的蛋白酶抑制剂，避免蛋白降解，从而保证检测的准确性！

2、蛋白定量

常用的蛋白定量方法：Bradford assay, Lowry assay 或BCA assay。定量后，可根据情况将标本保存在-20°C /-80°C备用，进行免疫沉淀（IP）或者直接进行电泳分离蛋白

3、电泳分离蛋白质

根据待测蛋白状态确定电泳条件：

待测蛋白状态凝胶条件上样buffer 电泳buffer Reduced -

Denatured 还原，变性含β-巯基乙醇或DTT，含SDS 含SDS

Reduced - Native 还原，不变性含β-巯基乙醇或DTT，不含SDS 不含SDS Oxidized - Denatured 不还原，变性不含β-巯基乙醇或DTT，含SDS 含SDS Oxidized - Native 不还原，不变性不含β-巯基乙醇或DTT，不含

不含SDS

SDS

根据待测蛋白分子量大小确定凝胶浓度

蛋白分子量（kDa）凝胶浓度（％）

4-40 20

12-45 15

10-70 12.5

15-100 10

25-200 8

4、转膜

根据不同的检测目的和待测蛋白的特性,选择合适的膜类型。常用的转移膜类型有:PVDF膜、硝酸纤维素膜（NC膜）和尼龙膜，其中PVDF和NC膜的使用频率最高。各种膜的技术参数及比较如下：

PVDF膜NC膜尼龙膜

灵敏度和分辨率高高高

背景低低较高

蛋白结合能力100-200ug/cm2（适用于SDS存在

时与蛋白结合）

80-100ug/cm2 >400ug/cm2

机械强度强干的膜易脆软而结实

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(完整版)WesternBlot(免疫印迹法)实验方法步骤

(完整版)WesternBlot(免疫印迹法)实验方法步骤

Western Blot(免疫印迹法)实验方法步骤

发布日期:2008-8-25 热门指数:4360

Western Blot(免疫印迹法)

主要包括以下4个基本步骤：

n 样品制备

n 电泳分离

n 蛋白的膜转移

n 免疫杂交与显色――蛋白检测

溶液和试剂

n 1X 磷酸盐缓冲液(PBS)

n Modified RIPA buffer

Tris-HCl: 50 mM, pH 7.4 ; NP-40: 1% ;Na-deoxycholate: 0.25% ;NaCl: 150 mM ;EDTA: 1 mM ;PMSF: 1 mM ;Aprotinin, leupeptin, pepstatin: 1 microgram/ml each ;Na3VO4: 1 mM ;NaF: 1 mM

n 1X SDS 样品缓冲液

62.5 mM Tris-HCl (pH 6.8 于 25°C), 2% w/v SDS, 10%甘油,50 mM DTT, 0.01% w/v溴酚蓝

n 转移缓冲液

25 mM Tris base, 0.2 M 甘氨酸, 20%甲醇 (pH 8.3)

n 10X Tris缓冲盐 (TBS)

准备1L 10X TBS: 24.2 g Tris base, 80 g NaCl;用1N HCl调pH为 7.6

n 脱脂奶粉或BSA

n 甲醇

n TBS/T缓冲液

1X TBS, 0.1% Tween-20

n 封闭缓冲液（TBS/T） 1X TBS, 0.1% Tween-20加5% w/v脱脂奶粉或BSA

n 一抗的稀释

1X TBS, 0.1% Tween-20 加 5% BSA (多抗)或 5%脱脂奶粉(单抗)

Note: 一般来说, BSA被推荐用于多克隆抗体，脱脂奶粉用于单克隆抗体，这样可得到较高的信噪比。抗体的稀释度参考抗体说明书或根据实验确定。

western blot实验流程(自己整理)

western blot实验流程(自己整理)

Western Blot实验步骤 1.制胶

2.细胞蛋白抽提步骤

1. 提前预冷离心机，溶解lysis buffer；

2. 将细胞沉淀置于冰上；1ml PBS重悬，4℃离心5min，（除去样中微量血清）；

3. 每107cells加裂解工作液100ul，轻轻重悬细胞沉淀；

4. 置冰上10min，其间振荡2-3次；

5. 13000rpm离心10min，4℃；

6. 将上清转到小离心管中；

7. 取出1ul，用于Bradford测定 3.蛋白定量

对照 样本1 样本2

200ul工作液+100ul H2O 200ul工作液+99ul

H2O+1ul蛋白裂解液 200ul工作液+99ul

H2O+1ul蛋白裂解液

200ul工作液+100ul H2O 200ul工作液+99ul

H2O+1ul蛋白裂解液 200ul工作液+99ul

H2O+1ul蛋白裂解液

测OD值

蛋白浓度（ug/ul）=（样本OD值的平均值-对照OD值平均值）*斜率 4.计算样品体积

10孔 15孔

Lysate 20ul 12ul lysis buffer

5X loading 5ul 3ul

total 25ul 15ul

总蛋白量 35ug 20ug

总体积 ≤30ul ≤20ul

5.蛋白变性

100℃，5min；提前预热。中间打开盖子1~2次。

6.上样电泳（100V，90min）

向电泳槽中加入电泳缓冲液，使两块玻璃内侧电泳液高于上样孔，外侧电泳槽内电泳

液浸没凝胶底部。玻璃板内侧液面高于外侧。然后开始上样，保证每孔总蛋白量在

30-50ug,总上样量小于 30ul,注意上样时间尽量短，避免样品扩散。 上样完毕，盖好电泳槽的盖子，注意正负极，并选择适当的电压进行电泳。通常在不

连续的系统中，上层浓缩胶的电泳电压(建议 70-80V)要低于分离胶电泳电压(建议90-

110V)，以达到更好的浓缩效果，使样品进入分离胶时被压缩在同一水平线上。电泳直

westernblot详细图解详细版.docx

westernblot详细图解详细版.docx

精选 Western免疫印迹（Western Blot）是将蛋白质转移到膜上，然后利用抗体进行检测的方法。对已知表达蛋白，可用相应抗体作为一抗进行检测，对新基因的表达产物，可通过融合部分的抗体检测。

与Southern或Northern杂交方法类似，但Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。

经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。

实验材料 蛋白质样品

试剂、试剂盒 丙烯酰胺 SDS Tris-HCl β-巯基乙醇

ddH2O 甘氨酸 Tris 甲醇 PBS NaCl KCl

Na2HPO4 KH2PO4 ddH2O 考马斯亮兰 乙酸 脱脂奶粉 硫酸镍胺 H2O2 DAB试剂盒

仪器、耗材 电泳仪 电泳槽 离心机 离心管 硝酸纤维素膜 匀浆器 剪刀 移液枪 刮棒

实验步骤 一、试剂准备

1. SDS-PAGE试剂：见聚丙烯酰胺凝胶电泳实验。

2. 匀浆缓冲液：1.0 M Tris-HCl(pH 6.8) 1.0

ml；10%SDS 6.0 ml；β-巯基乙醇 0.2 ml；ddH2O 2.8 ml。

3. 转膜缓冲液：甘氨酸 2.9 g；Tris 5.8 g；

精选 SDS 0.37 g；甲醇200 ml；加ddH2O定容至1000 ml。

4. 0.01 M PBS(pH7.4)：NaCl 8.0 g；KCl 0.2

g；Na2HPO4 1.44 g；KH2PO4 0.24 g；加ddH2O至1000 ml。

Western Blot步骤

Western Blot步骤

Western Blot步骤

1、清洗，安装玻璃板，配胶（若冬天做实验，首先开水浴锅，将有结晶的SDS放入水浴锅中）首先将10%AP配好（0.1gAP+1ml纯水）最后加AP。（每加一步均看管中液体总量与所加量是否一致）

试剂的配置如下表：

制胶成分 下层胶（两块*2） 上层胶（两块*2）

7.5% 10.5% 12.5% 15% 5%

单蒸水 8.0ml 6.6ml 5.4ml 4.0ml 4.6ml

Gel Buffer(上下不同） 4.0ml 4.0ml 4.0ml 4.0ml 2.0ml

Acrylamide/Bis 4.0ml 5.4ml 6.6ml 8.0ml 1.34ml

10%SDS 180ul 180ul 180ul 180ul 80ul

TEMED 12ul 12ul 12ul 12ul 16ul

10%AP(过硫酸铵，最后加！） 120ul 120ul 120ul 120ul 40ul

上层Gel Buffer 0.5M Tris-HCL,PH6.8

下层Gel Buffer 1.5M Tris-HCL,PH8.8

2、制胶（若冬天需要在板底部包一层保鲜膜），先加入第一枪后看看是否漏胶，若不漏胶则可继续加，下层胶加至绿线下约0.5cm处（保证正丁醇压胶后，胶能再与缺口同平），管中剩下一些胶，以掌握凝胶时间。加正丁醇，最后一枪正丁醇由左向右拖一下。（冬天放在水浴锅中凝胶）。凝胶后多放置一会儿，使胶稳定，将正丁醇冲洗干净，用滤纸将残余水吸干，不可碰到胶面，之后在通风处中风干一会儿，加上层压缩胶，要带水加胶，不可弄出气泡。加满后插入梳子，若为无牙的梳子，要向左顶头，保证只坏一个孔，梳子分1.0与1.5mm的（插完梳子后，再补上几枪胶，待胶凝固）。

3、电泳液配置（两块胶500ml,四块1000ml)

Tris-Base 1.51g

Tris-Base 3.03g