Western Blot实验详解
一、实验材料
Western Blot相关试剂：
2×Sample Buffer：1ml Glycerol（甘油）;0。5ml Beta mercaptoethanol（β-巯基乙醇）; 3ml
10%SDS; 1。25ml 4×Upper buffer; 4。25ml dH2O; Add bromophenol blue （溴酚蓝）to color。
4×Upper buffer：60。6g Trizma Base(氨基丁三醇); 20ml 20%SDS; Add dH2O to 1000ml; 用盐酸调pH 至6。8。
10×电泳缓冲液（pH 8。3）：在1L大烧杯中加入800ml去离子水，称取Tris 30。2g、甘氨酸188g，混匀，加入100ml 10%SDS(10g)，定容至1L。（注：SDS在68℃水浴中溶解）。工作液：1×电泳缓冲液 去离子水稀释 室温保存。
1。5M Tris-HCl(pH8。8)：Tris 181。7g去离子水溶解，用浓盐酸调至pH8。8，定容至1L 室温保存。
1M Tris-HCl(pH6。8)：Tris 121。1g去离子水溶解，用浓盐酸调至pH7。5，定容至1L 室温保存。
10×TS(洗膜液)：在800ml去离子水，加入Nacl 90g， 1M Tris-HCl(pH7。5) 100ml，去离子水定容至1L。工作液：1×TS 室温保存。
1M Tris-HCl(pH7。5)：Tris 121。1g去离子水溶解，用浓盐酸调至pH7。5，定容至1L 室温保存。
10%SDS：称取十二烷基磺酸钠（SDS）10g，加入约80ml去离子水，68℃加热溶解。用10%HCl调pH至7。2，定容至100ml。
1×Transfer Buffer： 在1L大烧杯中加入800ml去离子水，加入3。03g Trisgrams，14。43g甘氨酸，最后加入200ml甲醇。4℃保存。
Western Blot详解
(原理、分类、试剂、步骤及问题解答)
Time：2009-07-15 PM 21:46 Author:bioer Hits: 369 times -
Western免疫印迹（Western Blot）是将蛋白质转移到膜上，然后利用抗体进行检测。对已知表达蛋白，可用相应抗体作为一抗进行检测，对新基因的表达产物，可通过融合部分的抗体检测。
本文主要通过以下几个方面来详细地介绍一下Western Blot技术：[由于Western
Blot问题解答涉及方面较广，一篇文章已无法将其全部囊括，之后更有Western Blot详解(原理、分类、试剂、步骤及问题解答)之补充篇，欢迎大家继续补充]
一、原理
与Southern或Northern杂交方法类似，但Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。
二、分类
western显色的方法主要有以下几种：
i. 放射自显影 ii. 底物化学发光ECL iii. 底物荧光ECF
iv. 底物DAB呈色
现常用的有底物化学发光ECL和底物DAB呈色，体同水平和实验条件的是用第一种方法，目前发表文章通常是用底物化学发光ECL。只要买现成的试剂盒就行，操作也比较简单，原理如下（二抗用HRP标记）：反应底物为过氧化物+鲁米诺，如遇到HRP，即发光，可使胶片曝光，就可洗出条带。
Western Blot 原理和操作方法（全）
工作原理
蛋白质的电泳分离是重要的生物化学分离纯化技术之一,电泳是指带电粒子在电场作用下,向着与其电荷相反的电极移动的现象.根据所采用的支持物不同,有琼脂糖凝胶电泳,淀粉凝胶电泳,聚丙烯酰胺凝胶电泳等.其中,聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)由于无电渗作用,样品用量少(1-100μg),分辨率高,可检出10-9-10-12mol的样品,凝胶机械强度大,重复性好以及可以通过调节单体浓度或单体与交联剂的比例而得到孔径不同的凝胶等优点而受到广泛的应用.
SDS-PAGE是最常用的定性分析蛋白质的电泳方式,特别是用于蛋白质纯度检测和测定蛋白质分子量.
PAGE能有效的分离蛋白质,主要依据其分子量和电荷的差异,而SDS-PAGE(SDS变性不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳)的分离原理则仅根据蛋白质的分子量的差异,因为SDS-PAGE的样品处理液是在要跑电泳的样品中假如含有SDS和巯基乙醇(2-ME)或二巯基赤藓醇(DTT),其可以断开半胱氨酸残基之间的二硫键,破坏蛋白质的四级结构,SDS是一种阴离子表面活性剂即去污剂,它可以断开分子内和分子间的氢键,破坏蛋白质分子的二级及三级结构,并与蛋白质的疏水部分相结合,破坏其折叠结构,电泳样品假如样品缓冲液后,要在沸水中煮3-5分钟使SDS与蛋白质充分结合形成SDS-蛋白质复合物,SDS-蛋白质复合物在强还原剂巯基乙醇存在时,蛋白质分子内的二硫键被打开而不被氧化,蛋白质也完全变性和解聚,并形成榛状结构,稳定的存在于均一的溶液中,SDS与蛋白质结合后使SDS-蛋白质复合物上带有大量的负电荷,平均每两个氨基酸残基结合一个SDS分子,这时各种蛋白质分子本身的电荷完全被SDS掩盖,远远超过其原来所带的电荷,从而使蛋白质原来所带的电荷可以忽略不计,消除了不同分子之间原有的电荷差别,其电泳迁移率主要取决于亚基分子质量的大小,这样分离出的谱带也为蛋白质的亚基.
westernblot原理及步骤
免疫印迹（Western Blot）是将蛋白质转移到膜上，然后利用抗体进行检测。对已知表达蛋白，可用相应抗体作为一抗进行检测，对新基因的表达产物，可通过融合部分的抗体检测。Western Blot是检测单一细胞蛋白表达量最好的方法；若要对表达蛋白进行细胞定位，confocal应是首选的方法，若要进行蛋白相互作用的关系，应考虑免疫共沉淀技术。
一、Western Blot的原理
Western Blot与Southern或Northern杂交方法类似，但Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。
二、操作步骤
（一）蛋白质样品获得：
1.所需试剂：
(1)蛋白酶抑制剂mix：
hjjhh储存浓度 5ml mix中的加入量 终浓度
*PMSF（溶于乙醇） 100mM 25ul 50uM
*Trypsin Inhibitor 1mg/ml 250ul 50ug/ml
*EGTA（pH8.0） 0.5M 80ul 8mM
*EDTA（pH8.0） 0.5M 10ul 1mM
Aprotinin 1mg/ml 25ul 5ug/ml
Pepstatin（溶于乙醇） 0.2mg/ml 50ul 10ug/ml
Leupeptin 5mg/ml 100ul 0.1mg/ml
Benzamidine 100mM 250ul 5mM
