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高考生物一轮复习讲义—基因工程的基本工具和基本操作程序（新人教版）课标要求1.阐明DNA重组技术的实现需要利用限制性内切核酸酶、DNA连接酶和载体三种基本工具。
2.阐明基因工程的基本操作程序主要包括目的基因的筛选与获取、基因表达载体的构建、将目的基因导入受体细胞和目的基因的检测与鉴定等步骤。
3.按照实验操作步骤，进行DNA的粗提取与鉴定实验。
4.利用聚合酶链式反应(PCR)扩增DNA片段并完成电泳鉴定，或运用软件进行虚拟PCR实验。
考点一重组DNA技术的基本工具1．基因工程的概念别名重组DNA技术操作环境生物体外操作对象基因操作水平DNA分子水平结果创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品2.基因工程的诞生和发展(1)肺炎链球菌转化实验不仅证明DNA是遗传物质，还证明了DNA可在同种生物不同个体之间转移。
(2)DNA双螺旋结构的提出和半保留复制的证明。
(3)中心法则的确立。
(4)遗传密码的破译。
(5)基因转移载体和限制酶、DNA连接酶和逆转录酶的发现为DNA的切割、连接以及功能基因的获得创造了条件。
(6)DNA体外重组的实现。
(7)重组DNA表达实验的成功。
(8)DNA测序和合成技术的发明。
(9)PCR技术的发明。
(10)基因组编辑技术可以实现对特定基因的定点插入、敲除或替换。
3．重组DNA技术的基本工具(1)限制性内切核酸酶(也称“限制酶”)(2)DNA连接酶(3)载体(1)源于选择性必修3 P71“旁栏思考”：①原核生物中存在限制酶的意义是什么？提示原核生物中限制酶的作用是切割外源DNA以保证自身安全，防止外来病原物的危害。
②限制酶来源于原核生物，为什么不能切割自己的DNA分子？提示原核生物DNA分子中不存在该酶的识别序列或识别序列已经被修饰。
(2)源于选择性必修3 P72“旁栏思考”：DNA连接酶和DNA聚合酶不是(填“是”或“不是”)一回事。
原因是①DNA连接酶连接的是两个DNA片段，而DNA聚合酶是把单个的脱氧核苷酸连接到已有的DNA片段上。
第三章基因工程第一节重组DNA技术的基本工具基因工程：指按照人们的愿望，通过转基因等技术，赋予生物新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物制品。
从技术操作层面看，由于基因工程是在DNA分子水平上进行设计和施工的，因此又叫重组DNA技术。
一、分子手术刀—限制性内切核酸酶1.全称和简称全称：_限制性内切核酸酶_简称：__限制酶_2.来源：主要是从_原核生物__中分离纯化出来的3.作用：①能够识别_双链_DNA分子的某种_特定核苷酸序列。
①使_每一条_链中_特定部位_的_磷酸二酯键__断开。
4.作用部位：_磷酸二酯键__5.识别序列：大多数限制酶的识别序列由_6_个核苷酸组成，也有少数限制酶的识别序列由_4_个、_8_个或__其他数量_的核苷酸组成。
6.切割结果：DNA分子经限制酶切割产生的DNA片段末端通常有两种形式__黏性末端_和__平末端__。
（1）EcoR①限制酶切割EcoR①识别序列为GAATTCEcoR①切割部位为GA之间的磷酸二酯键（2）Sma①限制酶切割Sma①识别序列为CCCGGGSma①切割部位为CG之间的磷酸二酯键二、分子缝合针—DNA连接酶1.功能：将__两个DNA片段连接起来_，恢复被限制酶切开的_磷酸二酯键__。
2.种类E·coli DNA连接酶T4DNA连接酶来源大肠杆菌T4噬菌体特点只缝合黏性末端缝合黏性末端平末端作用恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键3名称作用部位作用底物作用结果限制酶磷酸二酯键DNA将DNA切成两个片段DNA连接酶磷酸二酯键DNA片段将两个DNA片段连接为一个DNA分子DNA聚合酶或热稳定DNA聚合酶磷酸二酯键脱氧核苷酸将单个脱氧核苷酸依次连接到单链末端DNA(水解)酶磷酸二酯键DNA将DNA片段水解为单个脱氧核苷酸解旋酶碱基对之间的氢键DNA将双链DNA分子局部解旋为单链，形成两条长链RNA聚合酶磷酸二酯键核糖核苷酸将单个核糖核苷酸依次连接到单链末端三、分子运输车——载体1.作用：携带外源DNA片段进入受体细胞。
第1节重组DNA技术的基本工具课堂互动探究案课程标准1.基因工程是一种重组DNA技术。
2．概述基因工程是在微生物学、生物化学和分子生物学等学科基础上发展起来的。
3．阐明DNA重组技术的实现须要利用限制性内切核酸酶、DNA连接酶和载体三种基本工具。
素养达成1.了解基因工程的概念、诞生及发展。
(生命观念、社会责任)2．驾驭限制酶及DNA连接酶的作用。
(科学思维)3．理解载体需具备的条件。
(科学思维)设疑激趣在亚洲和非洲的贫困地区，人们由于无法获得足够的肉类和蔬菜，导致维生素A严峻缺乏，据世界卫生组织估计，全世界有1.2亿～2.5亿人缺乏维生素A，每年约有100多万儿童因缺乏维生素A失去生命。
胡萝卜素可在人体内转变成维生素A，因此，科学家利用基因工程技术，将有关酶的基因转入水稻中，并诱导它们在水稻细胞中表达，使水稻体内能够合成β胡萝卜素。
假如人每天食用的大米含β胡萝卜素，就能满意人体对维生素A的需求。
人们是怎样将胡萝卜体内的基因转移到水稻体内的呢？这个过程中须要哪些技术和操作工具呢？夯基提能·分层突破——互动·探究·智涂学习主题一基因工程的工具酶活动1 阅读下列材料，思索并回答下列问题：1．DNA分子中磷酸与脱氧核糖是如何连接的？该化学键的名称是什么？2．限制酶的作用特点是什么？所识别的序列有何特点？作用后的结果有哪两种形式？3．DNA连接酶的作用是什么？活动2 下图中的图1和图2分别表示的是Eco RⅠ限制酶和SmaⅠ限制酶产生两种不同末端的示意图。
请据图回答：1．请说出Eco RⅠ限制酶和SmaⅠ限制酶识别的碱基序列及切割的位点。
2．Eco RⅠ限制酶和SmaⅠ限制酶切割产生的DNA末端分别是什么形式？3．以上实例说明限制酶有何特性？该特性的含义是什么？4．DNA连接酶、限制酶和DNA聚合酶都作用于哪种化学键，分别对这种化学键有何影响？活动3 回答下列问题：1．为什么限制酶主要从原核生物中分别纯化而来？推想它在原核生物中的作用是什么？它会不会切割自己的DNA分子？2．限制性内切核酸酶和DNA连接酶的作用是否都体现了酶的专一性？[易错警示](1)限制酶不切割自身DNA的缘由是该生物中不存在该酶的识别序列或识别序列已被修饰。
基因工程的概念基因工程是指按照人们的愿望，进行严格的设计，通过体外DNA重组和转基因技术，赋予生物以新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。
基因工程是在DNA分子水平上进行设计和施工的，又叫做DNA重组技术。
基因工程的原理及技术原理：基因重组技术基因工程的基本工具1.“分子手术刀”——限制性核酸内切酶(限制酶)(1)来源：主要是从原核生物中分离纯化出来的。
(2)功能：能够识别双链DNA分子的某种特定的核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开，因此具有专一性。
(3)结果：经限制酶切割产生的DNA片段末端通常有两种形式：黏性末端和平末端.2.“分子缝合针”——DNA连接酶(1)两种DNA连接酶(E•coliDNA连接酶和T4DNA连接酶)的比较：①.相同点：都缝合磷酸二酯键。
②.区别：E•coliDNA连接酶来源于T4噬菌体，只能将双链DNA片段互补的黏性末端之间的磷酸二酯键连接起来;而T4DNA连接酶能缝合两种末端，但连接平末端的之间的效率较低。
(2)与DNA聚合酶作用的异同:DNA聚合酶只能将单个核苷酸加到已有的核苷酸片段的末端，形成磷酸二酯键。
DNA连接酶是连接两个DNA片段的末端，形成磷酸二酯键。
3.“分子运输车”——载体(1)载体具备的条件：①能在受体细胞中复制并稳定保存。
②具有一至多个限制酶切点，供外源DNA片段插入。
③具有标记基因，供重组DNA的鉴定和选择。
(2)最常用的载体是质粒：它是一种裸露的、结构简单的、独立于细菌染色体之外，并具有自我复制能力的双链环状DNA分子。
(3)其它载体：噬菌体的衍生物、动植物病毒基因工程的基本操作程序第一步：目的基因的获取1.目的基因是指：编码蛋白质的结构基因。
2.原核基因采取直接分离获得，真核基因是人工合成。
人工合成目的基因的常用方法有反转录法和化学合成法。
3.PCR技术扩增目的基因(1)原理：DNA双链复制(2)过程：①加热至90～95℃DNA解链;②冷却到55～60℃，引物结合到互补DNA链;③加热至70～75℃，热稳定DNA聚合酶从引物起始互补链的合成第二步：基因表达载体的构建1.目的：使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传至下一代，使目的基因能够表达和发挥作用。
第2节基因工程的基本操作程序课标内容要求核心素养对接阐明基因工程的基本操作程序主要包括目的基因的筛选与获取、基因表达载体的构建、将目的基因导入受体细胞和目的基因的检测与鉴定。
1.科学思维：结合生产实例，举例说出基因工程的基本操作程序。
2．科学探究：针对人类生产和生活的某一需求，尝试提出初步的基因工程构想，完成初步设计。
一、目的基因的筛选与获取1．目的基因(1)概念：用于改变受体细胞性状或获得预期表达产物等的基因。
(2)实例：培养转基因抗虫棉用到的目的基因是Bt抗虫蛋白基因。
2．筛选合适的目的基因(1)较为有效的方法：从相关的已知结构和功能清晰的基因中进行筛选。
(2)实例：在培育转基因抗虫棉之前，科学家不仅掌握了Bt基因的序列信息，也对Bt基因的表达产物——Bt抗虫蛋白有了较为深入的了解。
(3)认识基因结构和功能的技术方法：DNA测序技术、遗传序列数据库、序列比对工具。
3．利用PCR获取和扩增目的基因(1)PCR的含义：PCR是聚合酶链式反应的缩写，它是一项根据DNA半保留复制的原理，在体外提供参与DNA复制的各种组分与反应条件，对目的基因的核苷酸序列进行大量复制的技术。
(2)条件：DNA模板、分别与两条模板链结合的2种引物、四种脱氧核苷酸、耐高温的DNA聚合酶。
(3)过程：①变性：温度上升到90 ℃以上，目的基因DNA受热变性后解为单链。
②复性：温度下降到50 ℃左右时，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合。
③延伸：温度上升到72 ℃左右时，溶液中四种脱氧核苷酸在耐高温的DNA 聚合酶的作用下加到引物的3′端合成子链。
④重复循环多次。
(4)结果：每次循环后目的基因的量增加一倍，即成指数形式扩增(约为2n)。
二、基因表达载体的构建1．构建基因表达载体的目的(1)使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代。
(2)使目的基因能够表达和发挥作用。
2．基因表达载体的组成[填图]3．基因表达载体的构建首先用一定的限制酶切割载体，使它出现一个切口，然后用同种限制酶或能产生相同末端的限制酶切割目的基因的DNA片段，再利用DNA连接酶将目的基因片段拼接到载体的切口处。
基因工程的基本工具与操作程序课标要求核心考点五年考情核心素养对接1.阐明DNA重组技术的实现需要利用限制性内切核酸酶、DNA连接酶和载体三种基本工具；2.阐明基因工程的基本操作程序主要包括目的基因的获取、基因表达载体的构建、目的基因导入受体细胞和目的基因及其表达产物的检测鉴定等步骤；3.DNA的提取和鉴定；4.利用聚合酶链式反应（PCR）扩增DNA片段并完成电泳鉴定，或运用软件进行虚拟PCR实验基因工程的基本工具2023：重庆T12、湖北T4和T22（4）、新课标T6；2022：湖北T24（3）；2021：湖北T7、全国乙T38 1.科学思维——建立模型：基因工程的操作流程。
分析与综合：理解基因工程的工具；PCR的原理，推断PCR反应所需的条件；根据基因表达的过程，推断目的基因检测与鉴定的方式。
2.科学探究——通过DNA的粗提取与鉴定及DNA片段的扩增与鉴定的实际操作，培养科学探究能力基因工程的基本操作程序2023：辽宁T8和T25、江苏T22、天津T17、山东T25、湖南T19（2）、全国乙T38、浙江1月T24（5）；2022：江苏T24、全国乙T38、辽宁T12和T24Ⅰ、天津T15；2021：山东T25、辽宁T24、广东T22、湖北T16、全国甲T38、天津T16、江苏T23、福建T21、浙江6月T29（二）（2）；2020：浙江7月T24和T29（二）（1）（2）、浙江1月T29（二）（2）；2019：江苏T33、全国ⅠT38、天津T9DNA的粗提取与鉴定及DNA片段的扩增与鉴定2023：江苏T9D、广东T11；2022：山东T13；2021：山东T13；2020：海南T10；2019：江苏T10命题分析预测1.基因工程是高考的重点，常以科研或生产实践为情境，考查基因工程的基本工具及基本操作程序，也常与核酸的结构、遗传的物质基础、细胞工程、胚胎工程等知识相结合进行综合考查，多以非选择题形式呈现，但也可以选择题的形式呈现。
基因工程的基本工具与聚合酶链式反应(PCR)技术(建议用时：40分钟)题组一基因工程及其诞生和发展1．科学家经过多年的努力，创立了一种新兴生物技术——基因工程。
实施该工程的最终目的是( )A．定向提取生物体的DNA分子B．定向地对DNA分子进行人工“剪切”C．在生物体外对DNA分子进行改造D．定向地改造生物的遗传性状D[该题的关键词是“最终目的”，A、B、C三项都是基因工程的技术手段，这些手段的目的是定向改造生物的遗传性状，故选D项。
]2．下列关于基因工程的发展历程的说法错误的是( )A．质粒是一种具有自我复制能力的环状DNA分子B．美国科学家伯格领导的研究小组完成世界上首次DNA分子体外重组C．科恩和博耶证明真核生物的基因可以在原核生物中表达D．基因工程的建立和发展是生物学进步的结果，与其他学科无关D[基因工程是在遗传学、微生物学、生物化学和分子生物学等众多学科长足进步的基础上发展而来的。
]题组二基因工程的基本工具3．下列有关限制性内切核酸酶的叙述，正确的是( )A．用限制性内切核酸酶切割一个DNA分子中部，获得一个目的基因时，被水解的磷酸二酯键有2个B．限制性内切核酸酶识别序列越短，则该序列在DNA中出现的概率就越大C．—CATG↓—和—G↓GATCC—序列被限制酶切出的黏性末端可用DNA连接酶连接D．只有用相同的限制性内切核酸酶处理含目的基因的片段和质粒，才能形成重组质粒B[用限制性内切核酸酶切割一个DNA分子中部，获得一个目的基因时，需要切割目的基因的两侧，因此要断裂4个磷酸二酯键，即被水解的磷酸二酯键有4个，A错误；限制性内切核酸酶识别序列越短，则该序列在DNA中出现的概率就越大，B正确；—CATG↓—和—G↓GATCC—序列被限制酶切出的黏性末端不同，分别为CATG和GATC，不能用DNA连接酶连接，C错误；用不同的限制性内切核酸酶处理含目的基因的DNA片段和质粒，若产生的黏性末端相同，也能形成重组质粒，D错误。
第三章基因工程知识点梳理第一节重组DNA技术的基本工具1.实施基因工程的最终目的：定向改造生物的遗传性状2.DNA酶的作用：断开磷酸二酯键使DNA分子水解为它的基本单位脱氧核苷酸3.限制酶（限制性内切核酸酶）的作用：断开磷酸二酯键使DNA分子水解为DNA分子的片段4.DNA连接酶的作用：能连接两个具有碱基互补配对的DNA片段之间的磷酸二酯键5.DNA聚合酶的作用：能把游离的脱氧核苷酸连接在引物的3，端6.解旋酶的作用：断开DNA两条链之间的氢键7.基因工程的基本工具：（1）分子手术刀—限制性内切核酸酶简称限制酶功能：识别和断开DNA分子的特定核苷酸序列如：EcoR1识别的脱氧核苷酸序列：GAATTC，断开G,A之间的磷酸二之间,形成黏性末端Sma1EcoR1识别的脱氧核苷酸序列：CCCGGG，断开C,G之间的磷酸二之间,形成平末端（2）分子缝合针—DNA连接酶功能：将切下来的DNA片段拼接成新的DNA分子。
DNA连接酶有上千种，可以分为两类，一类是从大肠杆菌中分离得到的E.coliDNA连接酶，只能将具有互补黏性末端的DNA片段连接起来，不能连接具有平末端的DNA片段。
T4DNA 连接酶既可以缝合黏性末端又可以缝合平末端，但连接平末端的效率相对较低。
（3）分子运输车—基因进入受体细胞的载体外源基因怎样送入细胞? 通常是利用质粒作为载体，将基因送入细胞。
8.质粒是一种裸露的、结构简单、独立于真核细胞细胞核或原核细胞拟核DNA之外，并具有自我复制能力的环状双链DNA分子。
在基因工程中使用的载体除了质粒还有噬菌体，动植物病毒等。
9.成为载体的条件：（1）能在细胞中进行自我复制或整合到受体DNA上随受体DNA同步复制（2）有特殊的标记基因便于重组DNA分子的筛选。
（3）有一个或多个限制酶切割位点，供外源DNA片段（基因）插入其中（4）对受体细胞无害10.DNA的粗提取与鉴定（1）选择富含DNA的生物组织使细胞内容物溶出。
第一节基因工程及其技术第1课时基因工程的基本工具与聚合酶链式反应(PCR)技术课标内容要求核心素养对接1.概述基因工程是在遗传学、微生物学、生物化学和分子生物学等学科基础上发展而来的。
2.阐明DNA重组技术的实现需要利用限制性内切核酸酶、DNA连接酶和载体三种基本工具。
生命观念：掌握基因工程的基本工具的种类及作用,并能说出它们在基因工程中的应用。
科学思维：掌握PCR技术的过程与原理,并能正确比较PCR技术与体内DNA复制的异同。
社会责任：通过了解基因工程的发展历程,认同新技术的发展是一代又一代科学家前赴后继努力的结果,并会给人类发展带来巨大的经济效益和社会效益。
一、基因工程是在多学科基础上发展而来的1957年：科恩伯格等首次发现DNA聚合酶。
↓1967年：罗思和海林斯基等发现运转工具质粒,同年,科学家发现DNA连接酶。
↓1970年：特明和巴尔的摩各自在RNA病毒中发现逆转录酶。
史密斯等人分离到限制性内切核酸酶。
↓1972年科学家伯格领导的研究小组完成了世界上首次DNA分子体外重组。
↓1973年科学家科恩领导的研究小组利用大肠杆菌质粒进行了另一个体外重组DNA分子实验。
↓接着,科恩和美国博耶证明真核生物的基因可以在原核生物中进行表达。
↓1976年,科学家用质粒为载体,将生长激素释放抑制因子基因转入大肠杆菌,1977年首次生产出治疗肢端肥大症、巨人症的生长激素释放抑制因子。
↓1977年桑格测定了一种噬菌体的基因组序列,这是人类首次对完整基因组的核苷酸顺序进行测定。
二、基因工程的基本工具1．基因工程(1)概念：又称为DNA重组技术,是指在体外通过人工“剪切”和“拼接”等方法,将外源目的基因与载体DNA进行组合形成重组DNA,然后导入受体细胞,并使其在受体细胞中表达,产生人类需要的基因产物的技术。
(2)原理：基因重组。
(3)操作水平：基因(分子)水平。
2．“分子剪刀”——限制性内切核酸酶(限制酶)(1)作用：识别DNA分子上特定的脱氧核苷酸序列,并使每条链中特定部位的两个脱氧核苷酸之间的磷酸二酯键断开。
(2)特点：特异性(专一性)很强。
(3)切割方式①错位切：在DNA分子两条链的不同部位进行切割,切割后形成的两个DNA分子片段的末端均留下一段游离的单链,称为黏性末端。
②平切：在DNA分子两条链上相同的部位进行切割,切割后形成平末端。
3．“分子黏合剂”——DNA连接酶(1)作用：连接两个DNA片段之间的磷酸二酯键。
(2)类型①E.coli DNA连接酶：分离自大肠杆菌,可以连接黏性末端的DNA分子。
②T4 DNA连接酶：分离自T4噬菌体,可以连接黏性末端或平末端的DNA分子。
4．“分子搬运工”——载体(1)作用：将外源基因导入受体细胞,并使其在受体细胞中稳定遗传和表达。
(2)类型：质粒、λ噬菌体的衍生物、动物病毒等。
(3)组成：复制原点、适合的标记基因、多种限制酶的切割位点。
(4)改造：基因工程上用作载体的质粒一般都是经过人工改造过的。
三、聚合酶链式反应(PCR)技术1．PCR概念：目的DNA片段(目的基因)的体外扩增技术。
2．原理：类似于DNA的复制。
3．条件①模板DNA：DNA的两条链。
②引物对：使DNA聚合酶从引物的3′端开始连接脱氧核苷酸。
③原料：4种dNTP。
④热稳定的DNA聚合酶：Taq酶。
⑤其他：缓冲液、Mg2＋等。
4．过程(1)变性：在约94_℃高温下,作为模板的双链DNA解旋(变性)为两条单链DNA。
(2)退火：反应体系的温度降至约55 ℃,2条引物分别与对应单链DNA上的特定部位配对。
(3)延伸：反应体系的温度回升到约72_℃左右,4种脱氧核苷三磷酸根据碱基互补配对原则,在Taq酶的作用下连接到引物的3′端之后,使引物链延伸,并形成互补的DNA双链。
判断对错(正确的打“√”,错误的打“×”)1．基因工程的原理是基因重组,不过在这里这种变异是定向的。
( ) [答案] √2．DNA聚合酶也可以用作DNA重组技术的工具。
( ) ×提示：DNA重组技术的工具有限制酶、DNA连接酶和载体,没有DNA聚合酶。
3．不同DNA分子用同一种限制酶切割形成的黏性末端相同。
( ) [答案] √4．DNA连接酶既能连接黏性末端,又能连接平末端。
( ) ×提示：E.coli DNA连接酶不能连接平末端。
5．载体的种类有质粒、噬菌体、动物病毒等,其中动物病毒必须是DNA病毒。
( )[答案] √6．PCR技术需要热稳定的DNA聚合酶和解旋酶的参与。
( ) ×提示：PCR技术中通过加热使双链DNA解旋,不需要解旋酶参与。
7．扩增目的基因时只需要一种引物。
( )× 提示：需两种引物分别与两条母链结合。
基因工程的工具酶1．限制性内切核酸酶(1)作用特点：具有专一性,表现在以下两个方面①能够识别双链DNA 分子中特定的核苷酸序列。
②能够切割特定序列中的特定位点。
(2)识别序列的特点：遵循碱基互补配对原则,无论是奇数个碱基还是偶数个碱基,都可以找到一条中心轴线,如图,中轴线两侧的双链DNA 上的碱基是反向对称重复排列的。
如GCCG ⎪⎪⎪GC CG 以中心线为轴,两侧碱基互补对称；以为轴,两侧碱基互补对称。
(3)作用产物：黏性末端或平末端。
①黏性末端：是限制性内切核酸酶在它识别序列的中心轴线两侧将DNA 的两条链分别切开时形成的,如图所示：②平末端：是限制性内切核酸酶在它识别序列的中心轴线处切开时形成的,如图所示：2．限制性内切核酸酶与DNA 连接酶的关系(1)区别作用 应用 限制性内切核酸酶 使特定部位的磷酸二酯键断裂 用于提取目的基因和切割载体DNA 连接酶 在DNA 片段之间重新形成磷酸二酯键用于目的基因和载体的连接3．DNA连接酶与DNA聚合酶的比较比较项目DNA连接酶DNA聚合酶相同点作用实质相同,都是催化磷酸二酯键的形成不同点是否需要模板不需要需要接DNA链双链单链作用过程在两个DNA片段间形成磷酸二酯键将单个核苷酸加到已存在的DNA单链片段上,形成磷酸二酯键作用结果将已存在的DNA片段连接合成新的DNA分子用途基因工程DNA复制合作探究：(1)为什么限制酶主要从原核生物中分离纯化而来？推测它在原核生物中的作用是什么？它会不会切割自己的DNA分子？提示：原核细胞容易受到外源DNA的入侵,原核细胞中的限制酶能够切割入侵的外源DNA 而保护自身。
原核细胞中的限制酶不会切割自己的DNA分子,因为酶具有专一性或自己的DNA 分子已被修饰而不被识别。
(2)限制性内切核酸酶和DNA连接酶的作用是否都体现了酶的专一性？提示：限制性内切核酸酶能够识别双链DNA分子的特定核苷酸序列,并且使每一条链中特定部位的磷酸二酯键断开,体现了酶的专一性。
E.coli DNA连接酶能将具有互补黏性末端的DNA片段连接起来,对末端的碱基序列没有要求；T4 DNA连接酶既可以连接双链DNA片段互补的黏性末端,又可以连接双链DNA分子的平末端,都对末端的碱基序列没有要求,因此DNA连接酶的作用没有体现酶的专一性。
1.限制酶a和b的识别序列和切割位点如图所示,下列有关说法正确的是( )A．一个DNA分子中,酶a与酶b的识别序列可能有多个B．酶a与酶b切出的黏性末端不能相互连接C．酶a与酶b切断的化学键不完全相同D．用酶a切割有3个识别位点的质粒,得到4种切割产物A[一个DNA分子中,可能存在一个至多个酶a与酶b的识别序列,A正确；由图可知,酶a与酶b识别的序列虽然不同,但切出的黏性末端相同,相同的黏性末端能相互连接,B错误；酶a与酶b切断的化学键均为相邻脱氧核苷酸之间的磷酸二酯键,C错误；质粒为小型环状DNA分子,用酶a切割有3个识别位点的质粒,可得到3种切割产物,D错误。
] 2．下列有关DNA连接酶的叙述,正确的是( )A．T4 DNA连接酶只能将双链DNA片段互补的黏性末端之间连接起来B．E.coli DNA连接酶能将双链DNA片段平末端之间进行连接C．DNA连接酶能恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键D．DNA连接酶可连接DNA双链的氢键,使双链延伸C[DNA连接酶能使两个DNA片段之间形成磷酸二酯键,从而将它们连接起来。
E.coli DNA连接酶只能将双链DNA片段互补的黏性末端之间连接起来,不能将双链DNA片段平末端之间进行连接。
T4 DNA连接酶既可以“缝合”双链DNA片段互补的黏性末端,又可以“缝合”双链DNA片段的平末端。
]3．下列关于几种酶作用的叙述,错误的是( )A．DNA连接酶能使不同脱氧核苷酸的磷酸与脱氧核糖连接B．RNA聚合酶能与基因的特定位点结合,催化遗传信息的转录C．一种限制酶能识别多种核苷酸序列,并切割出多种目的基因D．DNA聚合酶能把单个脱氧核苷酸分子连接成一条DNA单链C[限制酶具有专一性,一种限制酶一般只能识别一种核苷酸序列,并在特定位点切割DNA分子。
DNA连接酶能使不同DNA片段的脱氧核苷酸的磷酸与脱氧核糖连接,重新形成DNA 分子；RNA聚合酶能与基因的特定位点结合,催化遗传信息的转录；DNA聚合酶能以DNA的一条链为模板,把单个脱氧核苷酸分子连接成一条DNA单链,复制形成新的DNA分子。
]基因工程中的载体1．种类常用载体：质粒、λ噬菌体的衍生物、动物病毒等。
质粒是一种裸露的、结构简单的、独立于细菌拟核DNA之外的、具有自我复制能力的、很小的双链环状DNA分子。
2．具备条件(1)能自我复制：能够在受体细胞中进行自我复制,或整合到染色体DNA上,随染色体DNA 进行同步复制。
(2)有切割位点：有一个至多个限制酶切割位点,供外源基因插入。
(3)具有标记基因：具有特殊的标记基因,供重组DNA的鉴定和选择。
(4)无毒害作用：对受体细胞无毒害作用,否则受体细胞将受到损伤甚至死亡。
说明：一般来说,天然载体不能同时满足所有条件,要对其进行人工改造才可以使用。
3．作用(1)用它作为运输工具,将目的基因送入受体细胞中。
(2)利用它在受体细胞内对目的基因进行大量复制。
合作探究：(1)细胞膜上的载体与基因工程中的载体有什么不同？提示：①化学本质不同：细胞膜上的载体化学成分是蛋白质；基因工程中的载体可能是物质,如质粒(DNA)、λ噬菌体的衍生物,也可能是生物,如动植物病毒等。
②功能不同：细胞膜上的载体功能是协助细胞膜控制物质进出细胞；基因工程中的载体是一种“分子运输车”,把目的基因导入受体细胞。
(2)标记基因标记的原理是什么？提示：①前提：载体上的标记基因一般是一些抗生素的抗性基因。
目的基因要转入的受体细胞没有抵抗相关抗生素的能力。
②过程：含有某抗生素抗性基因的载体导入受体细胞,抗性基因在受体细胞内表达,受体细胞对该抗生素产生抗性,因此培养受体细胞的培养基中加入该种抗生素即可筛选。
