专题一、基因工程知识点归纳

基因⼯程知识要点第⼀章1.基因⼯程:是在分⼦⽔平上进⾏的遗传操作，指将⼀种或多种⽣物体（供体）的基因或基因组提取出来，或者⼈⼯合成的基因，按照⼈们的愿望进⾏严密的设计，经过体外加⼯重组，转移到另⼀种⽣物体（受体）的细胞内，使之能在受体细胞遗传并获得新的遗传性状的技术。

2.基因⼯程的基本过程为哪些？切—接—转—增—检①获得⽬的基因：从供体细胞分离出基因组DNA，⽤内切酶将外源DNA切开。

——切（同时选择运载⽬的基因的载体）②⽬的基因与载体DNA拼接：⽤DNA连接酶将含有外源基因的DNA⽚段接到载体分⼦上，形成DNA重组分⼦。

——接③重组体分⼦导⼊受体细胞：借助于细胞转化⼿段将DNA重组分⼦导⼊受体细胞中。

——转④短时间培养转化细胞，以扩增DNA重组分⼦或使其整合到受体细胞的基因组中。

——增⑤筛选和鉴定转化细胞，获得使外源基因⾼效稳定表达的基因⼯程菌或细胞。

——检3.哪些基因是真核⽣物特有的？①假基因：核苷酸序列同其相应的正常功能基因基本相同，但却不能合成出功能蛋⽩质的失活基因。

②基因家族：由功能相关的基因成套组合形成③重复序列哪些是原核⽣物特有的：插⼊序列。

哪些是真核和原核共有的：移动基因、重叠基因第⼆章1.寄主细胞控制的限制与修饰宿主控制限制——核酸限制性内切酶宿主控制修饰——修饰的甲基转移酶以λ(k)噬菌体侵染E.coli B菌株为例解释寄主控制与修饰的现象。

（简述寄主控制的限制与修饰现象。

⼤多数细菌的噬菌体侵染都存在着⼀些功能性障碍。

所谓的寄主控制的限制与修饰现象简称（R/M体系）。

R/M体系：寄主是由两种酶活性配合完成的⼀种是修饰的甲基转移酶——修饰另⼀种是核酸内切限制酶——限制R/M体系的作⽤：保护⾃⾝的DNA不受限制；破坏外源DNA使之迅速降解；2. 简述Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型核酸内切酶的基本特性。

（1）Ⅰ型酶基本特性①有内切酶活性和甲基化酶活性——互斥②需要ATP、SAM（S—腺苷甲硫氨酸）和Mg 2+辅助因⼦；③EcoB和EcoK是由三种不同亚基组成。

专题一基因工程知识点汇总1．1 DNA重组技术的基本工具一、基因工程的原理：基因工程是指按照人们的愿望，进行严格的设计，通过体外和，赋予生物以新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。

由于基因工程是在水平上进行设计和施工的，因此又叫做。

1.“分子手术刀”——（1）来源：主要是从中分离纯化出来的。

（2）功能：能够识别双链DNA分子的，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的断开，因此具有性。

（3）结果：经限制酶切割产生的DNA片段末端通常有两种形式：和。

（4）这类酶在生物体内能将外来的DNA切断，即能够限制异源DNA的侵入并使之失去活力，但对自己的DNA却无损害作用，这样可以保持细胞原有的遗传信息。

2.“分子缝合针”——(1)两种DNA连接酶（E·coliDNA连接酶和T4DNA连接酶）的比较：①相同点：都缝合。

②区别：E·coliDNA连接酶来源于，只能将双链DNA片段互补的末端之间的磷酸二酯键连接起来；而T4DNA连接酶能缝合，但连接的之间的效率较低。

(2)与DNA聚合酶作用的异同: DNA聚合酶只能将加到已有的核苷酸片段的末端，形成磷酸二酯键。

DNA连接酶是连接的末端，形成磷酸二酯键。

3.“分子运输车”——载体（1）基因操作过程中使用载体两个目的：一是用它作为运载工具，将目的基因转移到宿主细胞中去；二是利用它在宿主细胞内对目的基因进行大量的复制。

（2）现在通常使用的载体是，它是一种相对分子质量较小、独立于之外，并具有自我复制能力的 DNA分子的环状DNA，有的细菌中有一个，有的细菌中有多个。

（3）质粒通过细菌间的接合由一个细菌向另一个细菌转移，可以复制，也可整合细菌拟核DNA中，随着拟核DNA的复制而复制。

（4）其他载体还有和等。

（5）作为载体必须具备以下条件：①能够在宿主细胞中；②具有多个，以便与外源基因连接；③具有某些，便于进行筛选，如对抗菌素的抗性基因、产物具有颜色反应的基因等。

高中生物选修三专题一基因工程知识点专题一基因工程基因工程的概念基因工程就是指按照人们的心愿，展开严苛的设计，通过体外dna重组和转基因技术，剥夺生物以代莱遗传特性，缔造出以合乎人们须要的代莱生物类型和生物产品。

基因工程就是在dna分子水平上展开设计和施工的，又叫作dna重组技术。

（一）基因工程的基本工具1.“分子手术刀”——限制性核酸内乌酶（管制酶）（1）来源：主要是从原核生物中分离纯化出来的。

（2）功能：能辨识双链dna分子的某种特定的核苷酸序列，并且并使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开，因此具有专一性。

（3）结果：经管制酶研磨产生的dna片段末端通常存有两种形式：黏性末端和平末端。

黏性末端：当限制酶从识别序列的中心轴线两侧切开时，被限制酶切开的dna两条单链的切口，带有几个伸出的核苷酸，他们之间正好互补配对，这样的切口叫黏性末端。

平末端：当管制酶从辨识序列的中心轴线处剖开时，剖开的dna两条单链的切口，就是平坦的，这样的切口叫做元显恭末端。

2.“分子缝合针”——dna连接酶(1)两种dna连接酶（e·colidna连接酶和t4-dna连接酶）的比较：①相同点：都缝合磷酸二酯键。

②区别：e·colidna连接酶源于大肠杆菌，就可以将双链dna片段优势互补的黏性末端之间的磷酸二酯键连接起来；而t4dna连接酶能缝合两种末端，但连接平末端的之间的效率较低。

(2)与dna聚合酶促进作用的优劣:dna聚合酶只能将单个核苷酸加到已有的核苷酸片段的末端，形成磷酸二酯键。

dna连接酶是（1）载体具有的条件：①能够在受到体细胞中激活并平衡留存。

②具有一至多个限制酶切点，供外源dna片段插入。

③具备标记基因，可供重组dna的鉴别和挑选。

④对受体细胞无害。

（2）最常用的载体就是质粒,它就是一种外露的、结构直观的、单一制于细菌染色体之外，并具备自我复制能力的双链环状dna分子。

选修三专题一基因工程1基因工程的工具1.1几种酶的比较被修饰。

②限制酶是一类酶，而不是一种酶。

③DNA连接酶发挥作用时，不需要模板，而DNA聚合酶则需要模板，二者不同。

1.2确定限制酶种类的方法1.2.1单酶切及筛选若用同一种限制酶切割质粒和目的基因形成相同的四个黏性末端，因而可能出现多种连接方式。

如：①质粒和质粒；②目的基因和目的基因；③质粒的自身环化，目的基因的自身连接；④质粒与目的基因的连接。

质粒与目的基因的连接又会出现正向连接和反向连接两种，目的基因与质粒的反向连接则导致目的基因不能成功表达。

1.2.2双酶切及筛选因为用单酶切会出现质粒与目的基因的任意连接，所以在实际操作中多使用双酶切。

双酶切可以避免质粒的自身环化，目的基因的自身连接和目的基因和质粒的反向连接，而目的基因与目的基因的连接因为没有抗生素抗性基因（标记基因）所以可以在含有该抗生素的培养基上去除，故只剩下质粒与质粒，以及质粒与目的基因的重组质粒。

1.2.3具体方法(1)根据目的基因两端的限制酶切点确定限制酶的种类①应选择切点位于目的基因两端的限制酶，如图甲可选择PstⅠ。

②不能选择切点位于目的基因内部的限制酶，如图甲不能选择SmaⅠ。

③为避免目的基因和质粒的自身环化和随意连接，也可使用不同的限制酶切割目的基因和质粒，如图甲也可选择用PstⅠ和EcoRⅠ两种限制酶(但要确保质粒上也有这两种酶的切点)。

(2)根据质粒的特点确定限制酶的种类①所选限制酶要与切割目的基因的限制酶相一致，以确保具有相同的黏性末端。

②质粒作为载体必须具备标记基因等，所以所选择的限制酶尽量不要破坏这些结构，如图乙中限制酶SmaⅠ会破坏标记基因；如果所选酶的切点不止一个，则切割重组后可能丢失某些片段，若丢失的片段含复制原点，则切割重组后的片段进入受体细胞后不能自主复制。

【例题】图2表示一种质粒的结构和部分碱基序列。

现有Msp I、BamH I、Mbo I、Sma I 4种限制性核酸内切酶，它们识别的碱基序列和酶切位点分别为C↓CGG、G↓GATCC、↓GATC、CCC↓GGG。

基因工程知识点总结基因工程是一门现代生物学领域的重要学科，它通过改造生物体的遗传物质，实现对生物体基因的精确操控和改良。

下面将对基因工程的相关知识点进行总结，以帮助读者更好地了解该领域的基本概念和技术应用。

一、基因工程的基本概念和原理基因工程是指通过人为手段修改生物体的基因组，以改变其性状和功能的技术。

其实现的基本原理包括基因定位、基因克隆和基因传递。

1. 基因定位：基因定位是指确定感兴趣的基因在基因组中的位置。

常用的方法有FISH（荧光原位杂交）和PCR（聚合酶链反应）等。

2. 基因克隆：基因克隆是指将感兴趣的基因从一个生物体中复制到另一个生物体中，使其在目标生物体中表达。

常用的方法有限制酶切、连接酶切和DNA合成等。

3. 基因传递：基因传递是指将经过克隆的基因导入到目标生物体中，并使其在目标生物体中稳定遗传。

常用的方法有基因枪、电穿孔和冷冻贮存等。

二、基因工程的应用领域基因工程技术在农业、医学和工业等领域有着广泛的应用，下面将分别介绍其主要应用领域。

1. 农业应用：基因工程技术在农业领域的应用主要包括转基因作物的培育和遗传改良。

通过导入特定基因，转基因作物可以获得抗病虫害、耐逆性或提高产量等特点，从而增加农作物的产量和质量。

2. 医学应用：基因工程技术在医学领域的应用主要包括基因诊断、基因治疗和生物药物的生产。

通过基因诊断，可以准确检测遗传病的基因突变，为疾病的早期预测和治疗提供依据。

基因治疗则通过修复或替代患者体内的异常基因，治疗遗传性疾病。

此外，基因工程技术还被用于生产重组蛋白和抗体等生物药物。

3. 工业应用：基因工程技术在工业领域的应用主要包括酶的生产和环境修复。

通过基因工程技术，可以大量生产具有特定功能的酶，用于工业生产和制药领域。

此外，基因工程技术还可以改造微生物，使其能够降解有机物污染物，用于环境修复和生物能源开发。

三、基因工程的伦理和安全问题尽管基因工程技术具有重要的应用前景，但也带来了一些伦理和安全问题。

生物选修三知识点梳理福建省厦门双十中学余炅昊专题一：基因工程（又叫DNA重组技术）1. 实现基因工程的技术：体外DNA重组和转基因2.操作水平：DNA分子水平第一节：DNA重组技术的基本工具一．限制性核酸内切酶1.来源：主要是原核生物2.作用特点：能识别双链DNA分子的某种（不仅限于一种，如：）特定核苷酸序列，并且使每条链中特定部位的两个核苷酸间的磷酸二酯键断开3.用途：切割DNA获取目的基因，切割载体4.切割得到的末端有黏性末端和平末端两种形式二、DNA连接酶1.作用对象：DNA片段2.分类：甲．从大肠杆菌中分离得到的Ecoli DNA连接酶特点：只能连接互补的黏性末端乙．从T4噬菌体中分离出来的T4 DNA连接酶特点：既可以连接黏性末端又可以连接平末端但连接平末端效率低DNA连接酶作用无专一性要求三、载体1、作用：将目的基因送入细胞2、分类：甲：质粒乙：噬菌体衍生物丙：动植物病毒3、质粒特点：裸露的、结构简单、独立于细菌拟核DNA之外并且具有自我复制能力的双链DNA分子4、作为运载体的条件甲：在宿主细胞中能保存下来并大量复制乙：有一个至多个限制酶切割位点（作用：供外源DNA片段插入其中）丙：有某种标记基因（抗性基因、绿色荧光蛋白基因或其他产物有特殊颜色的基因）第二节：基因工程的基本操作程序一、四个步骤目的基因的获取、基因表达载体的构建（基因工程的核心）、将目的基因导入受体细胞、目的基因的检测与鉴定二、具体内容甲、目的基因的获取：获取目的基因的方法：1、从基因文库中获取目的基因分类：基因组文库、部分基因文库根据2、利用PCR技术扩增目的基因原理（特点）前提原料过程3、人工合成条件乙、基因表达载体的构建1.目的：使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代，使目的基因能够表达和发挥作用2.组成：目的基因、启动子、终止子、标记基因启动子（有特殊结构的DNA片段），作用：是RNA聚合酶识别和结合的位点，驱动转录标记基因的作用：鉴别并筛选含目的基因的受体细胞丙：将目的基因导入受体细胞转化的定义：目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程1.将目的基因导入植物细胞大题问题汇总：专题一：基因工程：1、目的基因之所以能插入到转基因生物的染色体DNA上，其原因是：基因的组成、碱基配对方式和空间结构是相同的、用同一种限制酶对两者进行切割，产生相同的黏性末端2、不同生物基因可以拼接的结构基础是：DNA结构基本相同3、一般情况下，未经Ca2+溶液处理的大肠杆菌不作受体细胞的原因：未处理的大肠杆菌吸收质粒（外源DNA)的能力极弱4、PCR过程中所用的酶（Taq酶）的显著特点是：耐高温5、培养选择过程及其结果体现了质粒作为载体必须具备的两个条件：具有标记基因；能在受体细胞中复制并稳定保存6、DNA分子杂交技术中应用：用放射性同位素或荧光分子标记的含有目的基因的DNA单链（片段）作探针7、目的基因不一定能从cDNA文库中得到的原因：cDNA是由生物发育某个时期的mRNA逆转录产生的8、PCR过程中退火温度设定必须根据：引物的碱基数量和种类9、含目的基因的DNA片段和质粒表达载体用单酶切处理，并用DNA连接酶连接后，其中由两个DNA片段之间连接形成的产物有：目的基因-载体连接物、载体-载体连接物、目的基因-目的基因连接物3种10、微生物在基因工程中有哪些重要作用：工具酶主要来自微生物；最重要的目的基因供体库之一；目的基因的载体之一；作为受体细胞；提供用于发酵的工程菌11、PCR反应体系的主要成分应包括：扩增缓冲液；水；dATP/dGTP/dCTP/dTTP；Taq酶（热稳定DNA聚合酶）；对目的基因特异性的DNA引物对12、启动子的作用：提供RNA聚合酶识别和结合的位点；驱动基因转录出mRNA13、将目的基因导入愈伤组织细胞与采用叶肉细胞相比，其优点是：全能性高14、基因治疗就是把健康的外源基因导入：有基因缺陷的细胞15、检测大肠杆菌（受体细胞）是否导入了质粒或重组质粒，可采用的方法是：将大肠杆菌（受体细胞）培养在选择性培养基上，能够生长的，说明已导入了质粒A和重组质粒16、目的基因通过一定的途径整合到水稻的基因组中，也不一定会表达，其原因最可能是：目的基因受到转基因生物中相邻基因的影响（X：整合到转基因生物基因组的目的基因被转基因生物的某种酶破坏了）17、目的基因在转基因生物细胞中成功表达的标志是：在转基因生物的细胞中合成目的基因翻译产物18、两种不同的限制酶酶切后的产物可以连接的原因是：两种酶切割后产生的片段具有相同的黏性末端（或平末端）19、设计双酶切的目的：保证目的基因和载体定向连接，防止目的基因或质粒自身环化20、个体水平的检测方法（以抗虫基因为例）：分别向生长状况相同的转基因棉花和普通棉花接种相同等量棉铃虫观察棉花受害情况（单位时间死亡的棉铃虫数量）21、原核生物表达的s蛋白和真核生物表达的s蛋白的氨基酸序列相同，根本原因是：表达蛋白质所用的基因相同22、将目的基因导入植物细胞的常见方法有三种：土壤农杆菌转化法，基因枪法，花粉管通道法23、将已导入目的基因的植物细胞培养成植株需要利用：植物组织培养技术，该技术的核心是：脱分化和再分化24、要对蛋白质的结构进行设计改造，最终还必须通过基因完成的原因：基因决定蛋白质25、检测转基因植株中的目的基因是否成功表达可用的方法是：抗原-抗体杂交法26、在进行基因转移时通常需要将外源基因转入受精卵（或早期胚胎）中，原因是：受精卵或早期胚胎细胞具有全能性，可使外源基因在相应组织细胞表达27、转基因生物存在安全性的原因：科学家对基因的结构、基因间的相互作用以及基因的调控机制等都了解的相当有限；转移的基因不少是异种生物的基因；外源基因插入宿主基因组的部位往往是随机的；28、中国政府的态度是禁止生殖性克隆人，四不原则：不赞成、不允许、不支持、不接受任何生殖性克隆人实验，中国不反对治疗性克隆专题二：细胞工程一：动物细胞工程1、动物细胞培养过程中，随着细胞传代次数的增多，绝大部分细胞分裂停止，进而出现衰老甚至死亡的现象；但极少数细胞可以连续增殖，其中有些细胞会因为遗传物质发生改变而变成不死性细胞，该种细胞的黏着性下降，细胞膜表面蛋白质的量减少2、将动物组织消化成细胞可使用：胰蛋白酶或胶原蛋白酶3、动物细胞培养的理论基础：细胞增殖4、需要将动物组织消化成细胞的原因：成块组织中细胞与细胞靠在一起，彼此限制了细胞的生长和增殖；组织内部细胞难获得营养物质，难排除代谢废物，易死亡5、人们通常将动物组织消化后的初次培养称为原代培养6、贴满瓶壁的细胞需要重新用胰蛋白酶或胶原蛋白酶处理，然后分瓶继续培养，这种培养过程通常被称为传代培养7、动物细胞培养通常保持传代10代以内的原因：以保持细胞正常的二倍体核型8、动物细胞培养技术（其他动物细胞工程技术的基础）的应用：生产病毒疫苗、干扰素、单克隆抗体等/基因工程常用动物细胞作为受体细胞/检测有毒物质，判断某种物质的毒性/用于生理、病理、药理等方面的研究9、现用某种大分子染料，对细胞进行染色时，观察到死细胞被染色，而活细胞不染色，原因是：由于活细胞的膜具有选择透过性，大分子染料不能进入活细胞内，故活细胞不能着色10、在细胞培养过程中，通常在冷冻（超低温、液氮）条件下保存细胞11、哺乳动物核移植，使用动物胚胎细胞核移植的原因：动物胚胎细胞分化程度低，恢复其全能性相对容易12、在制备单克隆抗体的过程中，需先将经过免疫的B淋巴细胞和骨髓瘤细胞融合，这一诱导过程与植物体细胞杂交不同的是：用灭活的病毒诱导，之后，还需要通过多次筛选（至少两次），经选择性培养的杂交瘤细胞还需进行抗体检测和克隆化培养，才能获得足够的用于生产单克隆抗体的杂交瘤细胞，该细胞的特点是：既能迅速大量繁殖，又能产生专一的抗体13、与传统工艺相比，单克隆抗体试剂的优点：特异性强、灵敏度高、产量高14、制备单克隆抗体的B淋巴细胞一般从：脾中采集15、生产单克隆抗体一般不直接培养浆细胞，主要原因是：浆细胞不能无限增殖16、合成培养基的成分：糖/氨基酸/促生长因子/无机盐/微量元素/抗生素等，通常还需加入血清或血浆等一些天然成分17、早期胚胎培养所需的发育培养液的成分：无机盐类/有机盐类/维生素/激素/氨基酸/核苷酸以及血清等物质18、单克隆抗体制备中涉及的动物细胞工程技术：动物细胞培养/动物细胞融合19、将胚胎干细胞进行基因修饰，并将该干细胞嵌入正常囊胚中，胚胎将发育成只有部分细胞含有目的基因的“嵌合体”。

选修三知识点专题一 基因工程一、工具 1、限制酶(1)来源：主要从原核生物中分离纯化而来。

(2)作用：识别特定的核苷酸序列并切开相应两个核苷酸之间的磷酸二酯键。

(3)结果：产生黏性末端或平末端。

2、DNA 连接酶常用类型 E ·coli DNA 连接酶T 4DNA 连接酶 来源 大肠杆菌 T 4噬菌体 功能 连接黏性末端连接黏性末端和平末端结果 恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键3 常用载体：质粒 动植物病毒 λ噬菌体衍生物等 质粒⎩⎪⎨⎪⎧化学本质 ：双链环状DNA 分子特点⎩⎪⎨⎪⎧ 能自我复制有一个至多个限制酶切割位点有特殊的标记基因载体具备的条件条件 适应性稳定并能自我复制 目的基因稳定存在且数量可扩大 有一个至多个限制酶切割位点 可携带多个或多种外源基因 具有特殊的标记基因（如抗生素抗性基因）便于重组DNA 的鉴定和选择 对宿主细胞无害不影响宿主细胞的生活二、基因工程的操作步骤(1)目的基因的获取方法⎩⎪⎨⎪⎧①从基因文库中获取②利用PCR技术扩增③通过化学方法人工合成(2)基因表达载体构建组成⎩⎪⎨⎪⎧①目的基因②标记基因③终止子④启动子(3)将目的基因导入受体细胞方法⎩⎪⎨⎪⎧①植物：农杆菌转化法、基因枪法、花粉管通道法②动物：显微注射技术③微生物：感受态细胞法(4)目的基因的检测与鉴定方法比较项目限制酶DNA连接酶DNA聚合酶解旋酶RNA聚合酶作用底物DNA分子DNA分子片段脱氧核苷酸DNA 分子核糖核苷酸作用部位磷酸二酯键磷酸二酯键磷酸二酯键碱基对间的氢键磷酸二酯键作用结果形成黏性末端或平末端形成重组DNA分子形成新的DNA分子形成单链DNA分子转录形成RNA专题二细胞工程（Ca2+处理）（目的基因序列未知）（知道其中的一段目的基因）（较小的，目的基因序列已知）一、植物组织培养和动物细胞培养项目植物组织培养动物细胞培养理论基础植物细胞全能性细胞增殖培养基类型固体或半固体培养基液体培养基成分水、矿质元素、维生素、蔗糖、氨基酸、琼脂葡萄糖、氨基酸、无机盐、维生素、促生长因子、动物血清等取材植物幼嫩部位或花药等动物胚胎或出生不久的幼龄动物的器官或组织过程结果新的组织或植株个体，可以体现全能性新的细胞系或细胞株，不形成个体，不体现全能性目的①植株快速繁殖②脱毒植株的培育③人工种子④生产药物、杀虫剂等⑤转基因植物的培育①蛋白质生物制品的生产②皮肤移植材料的培育③检测有毒物质④生理、病理、药理学研究相同点①两技术手段培养过程中细胞都进行有丝分裂，都是无性繁殖，都可称克隆，都不涉及减数分裂②均为无菌操作，需要适宜的温度、pH等条件二、植物体细胞杂交与动物细胞融合植物体细胞杂交动物细胞融合原理细胞膜的流动性、细胞的全能性细胞膜的流动性过程细胞A、B原生质体A、B融合的原生质体杂种细胞杂种植株细胞A、B杂交细胞多个相同杂交细胞相关酶纤维素酶和果胶酶胰蛋白酶或胶原蛋白酶融合方法物理法：离心、电激、振动；化学法：聚乙二醇等试剂诱导除物理法和化学法外还可以用灭活的病毒诱导结果杂种植株杂交细胞意义克服了远缘杂交的不亲和性，获得杂种植株突破了有性杂交方法的局限，使远缘杂交成为可能四核移植（课本P48）原理：动物细胞核具有全能性专题三胚胎工程一体内受精和早期胚胎发育1．精子和卵子的发生(1)精子的发生：①场所：睾丸的曲细精管。

专题1 基因工程※基因工程的概念：基因工程是指按照人们的愿望，进行严格的设计，通过体外DNA重组和转基因技术，赋予生物以新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。

基因工程是在DNA分子水平上进行设计和施工的，又叫做DNA重组技术。

﹡原理：基因重组﹡目的：创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。

﹡意义：能够打破生物种属的界限（即打破生殖隔离，克服远源杂交不亲和的障碍），在分子水平上定向改变生物的遗传特性。

﹡操作水平：DNA分子水平【思考】：（1）基因工程的物质基础是：所有生物的DNA均由四种脱氧核苷酸组成。

（2）基因工程的结构基础是：所有生物的DNA均为双螺旋结构。

（3）一种生物的DNA上的基因之所以能在其他生物体内得以进行相同的表达，是因为它们共用一套遗传密码子。

一、基因工程的基本工具1.“分子手术刀”——限制性核酸内切酶（限制酶）（1）来源：主要是从原核生物中分离纯化出来的。

（2）功能：能够识别双链DNA分子的某种特定的核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开，因此具有专一性。

（3）结果：经限制酶切割产生的DNA片段末端通常有两种形式：黏性末端和平末端（回文结构特点）。

①在中心轴线两侧将DNA切开，切口是黏性末端。

②沿着中心轴线切开DNA，切口是平末端。

2.“分子缝合针”——DNA连接酶（1）分类：根据酶的来源不同，可分为E·coliDNA连接酶和T4DNA连接酶两类（2）功能：恢复被限制酶切开了的两个核苷酸之间的磷酸二酯键。

★两种DNA连接酶(E·coliDNA连接酶和T4DNA连接酶)的比较：①相同点：都缝合磷酸二酯键②区别：E．coIiDNA连接酶来源于大肠杆菌，只能使黏性末端之间连接；T4DNA连接酶能缝合两种末端，但连接平末端之间的效率较低。

(3)与DNA聚合酶作用的异同:DNA聚合酶只能将单个核苷酸加到已有的核苷酸片段的末端，形成磷酸二酯键。

第一章基因工程概述1.什么是基因工程,基因工程的基本流程基因工程Genetic engineering原称遗传工程;从狭义上讲,基因工程是指将一种或多种生物体供体的基因与载体在体外进行拼接重组,然后转入另一种生物体受体内,使之按照人们的意愿遗传并表达出新的性状;因此,供体、受体和载体称为基因工程的三大要素;1.分离目的基因2.限制酶切目的基因与载体3.目的基因和载体DNA在体外连接4.将重组DNA分子转入合适的宿主细胞,进行扩增培养5.选择、筛选含目的基因的克隆6.培养、观察目的基因的表达第二章基因工程的载体和工具酶1. 基因工程载体必须满足哪些基本条件➢具有对受体细胞的可转移性或亲和性;➢具有与特定受体细胞相适应的复制位点或整合位点;➢具有多种单一的核酸内切酶识别切割位点;➢具有合适的筛选标记;➢分子量小,拷贝数多;➢具有安全性;2. 质粒载体有什么特征,有哪些主要类型1、自主复制性2、可扩增性3、可转移性4、不相容性主要类型有1.克隆质粒2.测序质粒3.整合质粒4.穿梭质粒5.探针质粒6.表达质粒3. 质粒的构建1删除不必要的 DNA 区域,尽量缩小质粒的分子量,以提高外源 DNA 片段的装载量;一般来说,大于20Kb 的质粒很难导入受体细胞,而且极不稳定;2灭活某些质粒的编码基因,如促进质粒在细菌种间转移的 mob 基因,杜绝重组质粒扩散污染环境,保证 DNA 重组实验的安全,同时灭活那些对质粒复制产生负调控效应的基因,提高质粒的拷贝数3加入易于识别的选择标记基因,最好是双重或多重标记,便于检测含有重组质粒的受体细胞;4在选择性标记基因内引入具有多种限制性内切酶识别及切割位点的 DNA序列,即多克隆接头Polylinker,便于多种外源基因的重组,同时删除重复的酶切位点,使其单一化,以便环状质粒分子经酶处理后,只在一处断裂,保证外源基因的准确插入;5根据外源基因克隆的不同要求,分别加装特殊的基因表达调控元件;4. 什么是人工染色体载体将细菌接合因子、酵母或人类染色体上的复制区、分配区、稳定区与质粒组装在一起,即可构成染色体载体5. 什么是穿梭载体人工构建的、具有两种不同复制起点和选择标记、可以在两种不同的寄主细胞中存活和复制的载体;6.入-噬菌体载体及构建-DNA为线状双链DNA分子,长度为,在分子两端各有12个碱基的单链互补粘性末端;➢1缩短长度提高外源 DNA 片段的有效装载量删除重复的酶切位点➢引入单一的多酶切位点接头序列,增加外源DNA片段克隆的可操作性➢灭活某些与裂解周期有关基因;➢使λ-DNA载体只能在特殊的实验条件下感染裂解宿主细菌,以避免可能出现的污染现象的发生;➢加装选择标记,便于重组体的检测单链噬菌体DNA载体➢过定点诱变技术封闭重复的重要限制性酶切口;➢引入合适的选择性标记基因,如含有启动子、操作子和半乳糖苷酶氨基端编码序列lacZ’的乳糖操纵子片段lac、组氨酸操纵子片段his以及抗生素抗性基因等;➢将人工合成的多克隆位点接头片段插在 lacZ’标记基因内部,使得含有重组子的噬菌斑呈白色,而只含有载体 DNA 的混浊噬菌斑呈蓝色;➢4在多克隆位点接头片段的两侧区域改为统一的 DNA 测序引物序列,使得重组 DNA 分子的单链形式经分离纯化后,可直接进行测序反应;8. II类限制性内切核酸酶的特点限制性核酸内切酶 Restriction endonucleases是一类能在特异位点上催化双链DNA 分子的断裂,产生相应的限制性片段的核酸水解酶;➢识别位点的特异性：每种酶都有其特定的DNA识别位点,通常是由4、5或6核苷酸组成的特定序列靶序列;➢识别序列的对称性：靶序列通常具有双重旋转对称的结构,即双链的核苷酸顺序呈回文结构;➢切割位点的规范性：双链DNA被酶切后,分布在两条链上的切割位点旋转对称可形成粘性末端或平末端的DNA分子;同位酶：一部分酶识别相同的序列,但切点不同,这些酶称为同位酶;同裂酶：识别位点与切割位点均相同的不同来源的酶称为同裂酶同尾酶Isocandamers：识别位点不同,但切出的 DNA 片段具有相同的末端序列,这些酶称为同尾酶;9.甲基化酶Ⅱ类限制性内切酶有相应甲基化酶伙伴,甲基化酶的识别位点与限制性内切酶相同,并在识别序列内使某位碱基甲基化,从而封闭该酶切口;甲基化酶在封闭一个限制性内切酶切口的同时,却产生出另一种酶的切口➢甲基化酶可修饰限制性核酸内切酶识别序列,从而使DNA免受相应的限制性核酸内切酶的切割;➢甲基化酶的用途就是在必要时可以封闭某一限制性核酸内切酶的酶切位点;连接酶连接作用的特点:①DNA连接酶需要一条DNA链的3’末端有一个游离的羟基-OH,另一条DNA链的5’末端有一个磷酸基-P的情况下,只有在这种情况下,才能发挥连接DNA分子的作用;②只有当3’－OH和5’－P彼此相邻,并且各自位于与互补链上的互补碱基配对的两个脱氧核苷酸末端时,DNA连接酶才能将它们连接成磷酸二酯键;③DNA连接酶不能连接两条单链的DNA分子或环化的单链DNA分子,被连接的DNA链必须是双螺旋DNA分子的一部分;④DNA连接酶只能封闭双螺旋DNA上失去一个磷酸二酯键所出现的单链缺口nick,而不能封闭双链DNA的某一条链上失去一个或数个核苷酸所形成的单链裂口gap;⑤由于在羟基和磷酸基团之间形成磷酸二酯键是一种吸能反应,因此,DNA连接酶在进行连接反应时,还需要提供一种能源分子NAD＋或ATP11.大肠杆菌 DNA聚合酶和Klenow大片段各有什么作用DNA聚合酶作用的特点：➢要有底物4种dNTP为前体催化合成DNA;➢接受模板指导;➢需要有引物3’羟基的存在;➢不能起始合成新的DNA链;➢催化dNTP加到生长中的DNA链3’-OH末端;➢催化DNA的合成方向是5’→3’;Klenow酶的基本性质：➢大肠杆菌DNA聚合酶I经胰蛋白酶或枯草杆菌蛋白酶部分水解生成的C末端604个氨基酸残基片段,即Klenow酶;分子量为76kDa;➢Klenow酶仍拥有5’→3’的DNA聚合酶活性和5’→3’的核酸外切酶活性,但失去了5’→3’的核酸外切酶活性;Klenow酶的基本用途：➢修复由限制性核酸内切酶造成的 3’凹端,使之成为平头末端;➢以含有同位素的脱氧核苷酸为底物,对DNA片段进行标记;➢用于催化 cDNA 第二链的合成;➢用于双脱氧末端终止法测定 DNA 的序列;聚合酶T4-DNA聚合酶酶的基本特性：➢有3’→5’的核酸外切酶活性和5’→3’的DNA聚合酶活性;➢在无dNTP时,可以从任何3’-OH端外切;➢在只有一种dNTP时,外切至互补核苷酸;➢在四种dNTP均存在时,聚合活性占主导地位;T4-DNA聚合酶的基本用途：切平由核酸内切酶产生的3’粘性末端13. 影响连接效率的因素有：➢温度最主要的因素离子浓度➢ATP的浓度 10μM - 1μM➢连接酶浓度平末端较粘性末端要求高➢反应时间通常连接过夜➢插入片段和载体片段的摩尔比➢DNA末端性质➢DNA片段的大小14.如何将不同DNA分子末端进行连接1.相同粘性末端的连接如果外源DNA与载体DNA均用相同的限制性内切酶切割,则不管是单酶酶解还是双酶联合酶解,两种DNA分子均含有相同的粘性末端,因此混合后能顺利的连接成一个重组DNA分子 2.平头末端的连接T4-DNA连接酶在ATP和高浓度酶的条件下,能连接具有完全碱基配对的平末端DNA分子,但平末端连接效率不高,基因操作不经常采用;3.不用粘性末端的连接3’端的粘性末端用T4-DNA聚合酶切平5’端的粘性末端用klenow酶补平,或者用S1核酸酶切平最后用T4-DNA连接酶进行平末端连接15. 碱性磷酸酶有什么作用1.该酶用于载体 DNA的5’末端除磷操作,以提高重组效率；2.用于外源DNA片段的5’端除磷,则可有效防止外源 DNA 片段之间的连接;16. 末端脱氧核苷酸转移酶有哪些作用➢给载体或目的DNA加上互补的同聚物尾;➢DNA片段3’末端的同位素标记;17. 2、细菌转化的步骤：∙感受态的形成;感受态时细胞表面出现各种蛋白质和酶类,负责转化因子的结合、切割及加工;感受态细胞能分泌一种小分子量的激活蛋白或感受因子,其功能是与细胞表面受体结合,诱导某些与感受态有关的特征性蛋白质如细菌溶素的合成,使细菌胞壁部分溶解,局部暴露出细胞膜上的 DNA 结合蛋白和核酸酶等;∙转化因子的结合;受体菌细胞膜上的DNA结合蛋白可与转化因子的双链DNA结构特异性结合,单链DNA或RNA双链RNA以及DNA/RNA杂合双链都不能结合在膜上;∙转化因子的吸收;双链 DNA 分子与结合蛋白作用后,激活邻近的核酸酶,一条链被降解,而另一条链则被吸收到受体菌中;∙整合复合物前体的形成;进入受体细胞的单链 DNA 与另一种游离的蛋白因子结合,形成整合复合物前体结构,它能有效地保护单链DNA免受各种胞内核酸酶的降解,并将其引导至受体菌染色体DNA处;∙转化因子单链DNA的整合;供体单链DNA片段通过同源重组,置换受体染色体DNA的同源区域,形成异源杂合双链 DNA结构;+诱导转化原理：①在0℃的Cacl2低渗溶液中,细菌细胞发生膨胀,同时Cacl2使细胞膜磷脂层形成液晶结构促使细胞外膜与内膜间隙中的部分核酸酶解离开来,诱导大肠杆菌形成感受态;②Ca2+能与加入的DNA分子结合,形成抗DNA酶DNase的羟基-磷酸钙复合物,并黏附在细菌细胞膜的外表面上;当42℃热刺激短暂处理细菌细胞时,细胞膜的液晶结构发生剧烈扰动,并随之出现许多间隙,为DNA分子提供了进入细胞的通道;③Mg2+对DNA分子有很大的稳定性作用,因此利用Mgcl2与Cacl2共同处理大肠杆菌细胞,可以提高DNA的转化效率;∙但该法要求条件高,对外界污染物极为敏感,通常很少采用;介导细菌的原生质体转化∙PEG是乙二醇的多聚物, 存在不同分子量的多聚体,它可改变各类细胞的膜结构, 使两细胞相互接触部位的膜脂双层中脂类分子发生疏散和重组,此时相互接触的两细胞的胞质沟通成为可能,从而造成细胞之间发生融合;20.电穿孔法是指在细胞上施加短暂、高压的电流脉冲,在质膜上形成纳米大小的微孔,DNA直接通过这些微孔或者作为微孔闭合时所伴随发生的膜组分重新分布通过质膜进入细胞质中,这种方法称为电穿孔法;P52 接合转化,入噬菌体感染未归纳21.转化率的影响因素.载体及重组DNA方面载体本身的性质：不同的载体转化同一株受体细胞,其转化率不同;载体的空间构象：与受体细胞亲和性较强的质粒载体转化率要高于亲和性较弱的质粒载体; 插入片段大小：对质粒载体而言,插入片段越大,转化效率越低;重组DNA分子的浓度和纯度受体细胞方面：受体细胞必须与载体相匹配转化操作的影响22.转化细胞的扩增转化细胞的扩增操作：指转化完成之后细胞的短时间培养;在实验时,扩增操作往往与转化操作偶联在一起,如：∙Ca2+诱导转化后的37℃培养一个小时∙原生质体转化后的再生过程∙λ噬菌体转染后的30℃培养等,均属扩增操作扩增操作的目的∙增殖转化细胞,使得有足够数量的转化细胞用于筛选程序;∙扩增和表达载体分子上的标记基因,便于筛选;∙表达外源基因,便于筛选和鉴定;23.抗药性筛选法这是利用载体DNA分子上的抗药性选择标记进行的筛选方法;抗药性筛选法的基本原理：抗药性筛选法可区分转化子与非转化子、重组子与非重组子将外源DNA片段插在EcoRI位点：∙非重组子呈 Apr、Tcr∙重组子呈 Apr、Tcr将外源DNA片段插在BamHI位点：∙非重组子呈 Apr、Tcr∙重组子呈 Apr、Tcs抗药性筛选法的基本操作：先将转化液涂布含有Ap的平板再将Ap平板上的转化子影印至含有Tc的平板上在Ap平板上生长,但在Tc平板上不长的转化子即为重组子 P56抗药性标记插入失活选择法∙经过上述抗药性筛选获得的大量转化子中既包括需要的重组子,也含有不需要的非重组子;为了进一步筛选出重组子,可利用质粒载体的双抗药性进行再次筛选;如果外源基因插入在载体的抗药性基因中间使得该抗药性基因失活,这种抗药性标记就会消失,从而筛选出阳性重组子;24. 什么是蓝白斑筛选法这种方法是根据组织化学的原理来筛选重组体;主要是在λ载体的非必要区插入一个带有大肠杆菌β—半乳糖苷酶的基因片段,携带有lac基因片段的λ载体转入lac的宿主菌后,在含有5—溴—4—氯—3—引哚—β—D—半乳糖苷X-gal平板上形成浅蓝色的噬菌斑;外源基因插人lac或lac基因部分被取代后,重组的噬菌体将丧失分解X-gal的能力,转入lac-宿主菌后,在含有5—溴—4—氯—3—引哚—β—D—半乳糖苷 X-gal平板上形成白色的噬菌斑,非重组的噬菌体则为蓝色噬菌斑;筛选法利用合适的引物,以从初选出来的阳性克隆中提出的质粒为模板进行PCR,通过对PCR产物的电泳分析,确定目的基因是否插入到载体中;由于在载体DNA分子中,外源DNA插入位点的两侧序列多数是已知的,可以设计合成相应的PCR引物,以待鉴定的转化子或重组子的DNA为模板进行PCR反应,反应产物经琼脂糖凝胶电泳,若出现特异性扩增DNA带,并且其分子量同预期的一致,则可确定含此重组DNA分子的重组子是期待的重组子;第三章基因工程的常规技术1. 探针有哪些类型探针标记有哪些方法类型：同源或部分同源探针cDNA探针人工合成的寡核苷酸探针标记方法：①5’端标记法②反转录标记法③缺刻前移标记法④ABC标记法4.什么是ABC荧光显色酶标记法ABC 标记法;∙A为Avidin生物素抗性蛋白,每个Avidin分子可结合3 - 4个生物素分子；∙B为Biotin生物素,每个Biotin分子可结合2个Avidin分子；∙C为Complex,首先将Biotin共价结合在探针分子上,荧光胺标记在Avidin上,两者形成复合物,即可将荧光胺标记在探针上,发出的荧光也能使普通胶片感光;如果将某一生色酶接在Avidin上,并辅以合适底物,则杂交反应还可直接以颜色反应检测,这一技术称为酶标技术5.亚克隆法∙亚克隆：是将克隆片段进一步片段化后再次进行的克隆;∙一般是将重组DNA分别用几种限制性核酸内切酶切割后,将所得各片段分别重组到载体上再转化宿主细胞,然后通过转化细胞的表型鉴定或鉴定,获得含有目的基因的重组子;此时,该重组分子中的无关DNA区域以被大量删除;6. 菌落嗜菌斑原位杂交的基本原理、流程∙该项技术是直接把菌落印迹转移到硝酸纤维素滤膜上,经溶菌和变性处理后使DNA 暴露出来并与滤膜原位结合再与特异性DNA探针杂交,筛选出含有插入序列菌落;∙操作步骤：∙①菌落生长∙②转移到NC膜上∙③DNA释放和变性∙变成单链DNA：∙ 10％SDS NaOH∙④中和 Tris-HCl pH∙⑤固定 80 ℃ 120’∙⑥杂交包括预杂交,加探针DNA杂交∙⑦放射自显影∙⑧对照比较,选出重组克隆7.鸟枪法∙鸟枪法：将某种生物体的全基因组或单一染色体切成大小适宜的 DNA 片段,分别连接到载体 DNA上,转化受体细胞,形成一套重组克隆,从中筛选出含有目的基因的期望重组子;鸟枪法制备目的基因的主要步骤∙①目的基因组DNA片段的制备超声波处理：片段长度均一,大小可控,平头末端;原核生物的基因长度大都在2Kb以内,真核生物的基因长度变化很大,最大的基因可达100Kb以上;全酶切：片段长度不均一,粘性末端便于连接,但有可能使目的基因断开,大小不可控;部分酶切：片段长度可控,含有粘性末端,目的基因完整;∙②DNA片段与载体连接如果转化子采用菌落原位杂交法或限制性酶切图谱法筛选,则选择多拷贝克隆载体；如果转化子采用基因产物功能检测法筛选,则选择表达型载体;∙③重组DNA分子导入受体细胞如果转化子采用菌落原位杂交法或限制性酶切图谱法筛选,则选择大肠杆菌作为受体细胞；如果转化子采用基因产物功能检测法筛选,则选择能使目的基因表达的受体细胞;∙④筛选含有目的基因的目的重组子菌落原位杂交法、基因产物功能检测法筛选模型的建立;∙⑤目的基因的定位利用鸟枪法获得的期望重组子只是含有目的基因的 DNA 片段,必须通过次级克隆或插入灭活,在已克隆的 DNA 片段上准确定位目的基因,然后对目的基因进行序列分析,搜寻其编码序列以及可能存在的表达调控序列;法酶促逆转录主要用于合成分子质量较大,转录产物mRNA易分离的目的基因;这种方法以目的基因的mRNA为模板,在逆转录酶的作用下合成互补的DNA,即cDNA,然后在DNA聚合酶的催化下合成双链cDNA片段,与适当的载体重组后转入受体菌扩增,获得目的基因的cDNA克隆; 的分离纯化绝大多数的真核生物mRNA在其3’端都存在一个多聚腺苷酸的尾巴,利用它可以迅速的将mRNA从细胞总的混合物中分离出来,将寡聚脱氧胸腺嘧啶共价交联在纤维素分子上,制成亲和层析柱,然后将细胞总的RNA混合物上层析柱分离,mRNA会挂在层析住上,后洗脱即可分离10. 简述PCR技术的基本原理,PCR反应体系的主要成分与主要程序是怎样的PCR技术的基本原理：类似于DNA的天然复制过程,其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物;过程：PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成：①模板DNA的变性：模板DNA经加热至93℃左右一定时间后,使模板DNA双链或经PCR 扩增形成的双链DNA解离,使之成为单链,以便它与引物结合,为下轮反应作准备；②模板DNA与引物的退火复性：模板DNA经加热变性成单链后,温度降至55℃左右,引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；③引物的延伸：DNA模板--引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下,以dNTP为反应原料,靶序列为模板,按碱基配对与半保留复制原理,合成一条新的与模板DNA 链互补的半保留复制链;重复循环变性--退火--延伸三过程,就可获得更多的“半保留复制链”,而且这种新链又可成为下次循环的模板;每完成一个循环需2～4分钟, 2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍;11. 什么是基因组文库其构建方法是怎样的是指将某种生物的全部基因组的遗传信息贮存在可以长期保存的稳定的重组体中,以备需要时能够随时应用它分离所需要的目的基因,这种保存基因遗传信息的材料,就称为基因文库又称DNA文库;基因组文库构建的一般步骤①载体的选择和制备;②高纯度、大分子量基因组 DNA 的提取;③基因组 DNA 的部分酶切与分级分离;④载体与DNA片段的连接;⑤转化或侵染宿主细胞;⑥筛选鉴定基因组及保存;12. 基因组DNA文库的质量标准除了尽可能高的完备性外,一个理想的基因组DNA文库应具备下列条件：∙重组克隆的总数不宜过大,以减轻筛选工作的压力∙载体的装载量最好大于基因的长度,避免基因被分隔克隆;∙克隆与克隆之间必须存在足够长度的重叠区域,以利于克隆排序;∙克隆片段易于从载体分子上完整卸下;∙重组克隆能稳定保存、扩增、筛选;基因文库的构建通常采用鸟枪法和cDNA法13.外源DNA片段的切割原则片段之间要有一定的重叠序列片段大小要均一文库构建的步骤∙细胞总RNA的提取和mRNA的分离∙第一链cDNA合成∙第二链cDNA合成∙双链cDNA的分级分离∙双链cDNA克隆进质粒或噬菌体载体并导入宿主中繁殖∙重组体的筛选与鉴定第四章基因在大肠杆菌、酵母的高效表达1. 启动子∙启动子：是DNA链上一段能与RNA聚合酶结合并能起始转录的序列,其大小在20～300个碱基,是控制基因转录的重要调控元件;在一定条件下mRNA的合成速率与启动子的强弱密切相关,而转录又在很大程度上影响基因的表达;∙启动子的特征：①序列特异性②方向性③位置特性④种属特异性2.启动子类型∙组成型启动子：是指在该类启动子控制下,结构基因的表达大体恒定在一定水平上,在不同组织、部位表达水平没有明显差异;∙组织特异启动子：又称器官特异性启动子;在这类启动子调控下,基因往往只在某些特定的器官或组织部位表达,并表现出发育调节的特性;∙诱导型启动子：是指在某些特定的物理或化学信号的刺激下,该种类型的启动子可以大幅度地提高基因的转录水平;目前已经分离了光诱导表达基因启动子、热诱导表达基因启动子、创伤诱导表达基因启动子、真菌诱导表达基因启动子和共生细菌诱导表达基因启动子等;3.终止子终止子：是位于结构基因下游的一段DNA序列,基因转录时,该序列被转录为mRNA的一部分,并形成特殊的二级结构,由此终止基因的转录;序列SD序列：mRNA中起始密码子上游8-13个核苷酸处有一段富含嘌呤核苷酸的顺序,它可以与30S亚基中的16S rRNA 3’端富含嘧啶的尾部互补,形成氢键结合,有助于mRNA的翻译从起始密码子处开始5.密码子不同生物对密码子的偏爱性1.生物体基因组中的碱基含量2.密码子与反密码子的相互作用的自由能3.细胞内tRNA的含量6. 密码子偏爱性对外源基因表达的影响∙由于原核生物和真核生物基因组中密码子的使用频率具有较大程大的差异性,因此外源基因尤其是高等哺乳动物基因在大肠杆菌中高效翻译的一个重要因素是密码子的正确选择;一般而言,有两种策略可以使外源基因上的密码子在大肠杆菌细胞中获得最佳表达：∙外源基因全合成∙同步表达相关tRNA编码基因7. 包涵体及其性质在某些生长条件下,大肠杆菌能积累某种特殊的生物大分子,它们致密地集聚在细胞内,或被膜包裹或形成无膜裸露结构,这种水不溶性的结构称为包涵体8. 包涵体的形成机理∙①折叠状态的蛋白质集聚作用;∙②非折叠状态的蛋白质集聚作用∙③蛋白折叠中间体的集聚作用;9. 包涵体的分离检测∙包涵体的分离主要包括菌体破碎、离心收集以及清洗三大操作步骤;10. 分泌型目的蛋白表达系统的构建∙包括大肠杆菌在内的绝大多数革兰氏阴性菌不能将蛋白质直接分泌到胞外,但有些革兰氏阴性菌能将细菌的抗菌蛋白细菌素分泌到培养基中,这一过程严格依赖于细菌素释放蛋白,它激活定位于内膜上的磷酸酯酶A,导致细菌内外膜的通透性增大∙因此,只要将细菌素释放蛋白编码基因克隆在一个合适的质粒上即可构建完全分泌型的受体细胞;此时,用另一种携带大肠杆菌信号肽编码序列和目的基因的表达质粒转化上述完全分泌型受体细胞,并使用相同性质的启动子介导目的基因的转录,则可实现目的蛋白从重组大肠杆菌中的完全分泌;11融合蛋白表达质粒的构建原则：∙受体细胞的结构基因能高效表达,且其表达产物可以通过亲和层析进行特异性简单纯化;。