12 第十二讲 DNA文库的构建

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12 第十二讲 DNA文库的构建

部mRNA反转录成cDNA，并全部克隆成重组子，在该重组子群集中包含了其全部特别适合某些病毒基因组结构克隆对应一种mRNA序列，这样在目的基因的选择中出现假阳性的概率就会比较低，因此阳性的杂交信号一般都是有意义的，由此选择出来的阳性克隆将会含有目的基因序列。
基因重组
体外包装不同的基因，但在一定时间阶段的单个细胞或个体中，有 15%左右的基因得以表达，产生约15000种不同的mRNA分子。可见，由mRNA出发的cDNA克隆，其复杂程度要比直接从基因组克隆简单得多。
转录区段序列，不能用于研究基因编码区外侧调控序
列的结构与功能。基因组DNA与cDNA的比较基因组DNA的重组cDNA分子反映来源细胞中表达信息的完整性。 3.2 重组cDNmRNA； ⑶ cDNA的合成； ⑷ 黏性末端片段与载体的连接； ⑸ 离体包装获得重组噬菌体； ⑹ 检测⑴基因组DNA的分离制备不同来源的DNA制备方法不同。一般来说，有液相法和固相法两种。液相法提取的DNA长度一般在100kb左右，基本可以满足构建各种小插入片段基因组文库的要求。
大相对分子质量(high molecular weight,HMW) 基因组DNA的提取方法
基因组DNA
限制性内切酶
……
克隆、转化、培养、鉴定基因组3.2 基因组信息的可重建性通过建立叠连群(conti一般来说，DNA片段长，完整基因组文库所含的克隆数越少。反之，越多。基因组越大，应包含的克隆数越多，反之，越少。
4.2 cDNA第一链的合成 ① oligo(dT)引导的DNA合成法利用真核mRNA分子所具有的poly(A)尾巴的特性，加入12-20个脱氧胸腺嘧啶核苷组成的 oligo(dT)短片段，由反转录酶合成cDNA的第一链。

7.DNA 文库的构建

cDNA 第二条链的合成在 cDNA 的构建中非常重要，非常重要，有：自身引导法，置换合成法，引自身引导法，置换合成法，导合成法，引物－导合成法，引物－衔接头合成法可以后可以通过表型筛选法、杂交筛选和 PCR 筛选、免疫筛选法筛选目标基因。筛程序包括：
1、提取研究对象基因组 DNA ，制备合适大小的 DNA 片段，或提取组织或器官的 mRNA 片段，并反转录成 cDNA ； 2、DNA 片段或 cDNA 与经特殊处理的载体连接形成重组 DNA ； 3、重组 DNA 转化宿主细胞或体外包装后侵染受体菌；染受体菌； 4、阳性重组菌落或噬菌斑的选择。阳性重组菌落或噬菌斑有不同，构建。连接产物不用电转化的方法转化宿主，而是采连接产物不用电转化的方法转化宿主，用包装蛋白进行包装并侵染宿主。用对简单，其需要很多特殊的处理以及必要的仪器设备，其需要很多特殊的处理以及必因组覆盖倍数的计算方法一般包括两个过程 1.计算法，基因组覆盖倍数＝平均插入片段长度× 1.计算法，基因组覆盖倍数＝平均插入片段长度×克计算法隆数/ 隆数/基因组 DNA 的长度（一般是约数）；的长度（一般是约数）； 2.结合基因组覆盖度的检测来进行的。 2.结合基因组覆盖度的检测来进行的。基因组覆盖覆盖倍数又等于该基因位点的覆盖倍数，因此，所有探针筛到的阳性克隆的总个数/ 所有探针筛到的阳性克隆的总个数/使用的总探针数的比值。代表性和随机性二、代表性和随机性
代表性是指中所有克隆所携带的 DNA 片段重新组合起来可以覆盖整个基因组，即可片段寻找最适的比例。在电转化和包装侵染过程中，在电转化和包装侵染过程中，首先选择转化效率高的感受态细胞或行脱盐处理也可以明显地提高其效率。其效率。对于电转化而言，选择合适的转化电压对不对于电转化而言，同插入片段的 DNA 的转化效率也有所不同。的转化效率也有所不同。

怎样构建基因组文库

NA分子导入宿主细胞，让其自主复制，重组DNA分子被扩增（重组子机挑取一些转化子或重组子，提取质粒DNA，电泳量越高，可大大减轻后续筛选基因工作量。
i. 两菌株分别培养,分别收集和制备，包装前混合---本底低（对λDNA分子大小有严格限制），高效。
ii. 两菌株分别培养，混合收集和制备----操作简单，本底高，可包装不同大小的λDNA分子。
2）重组λDNA分子的包装过程包装制备物（-70℃）于冰上缓慢融化加入重组 λDNA分子边融化边混合边包装离心除去细胞碎片 λ颗粒于-70℃保存待用
sa c B
K anr
p a c lo x P
D N A h ea d fu l
+
+ p a c c le a v a g e
p r o te in
C re
R e c o m b ila tio n
DNA
A m p lific a tio n七. 利用YAC载体构建基因组1. 两臂DNA片段的制备:
第四章基因的建立来自基因文全部遗传信息的重组D因组DNA长度之比
S
C o s o r i A pr S
SalI Cos
S
H
S
S1 Cos
H
BamH I 小片段
Cos
H
35-45kb DNA 片段
T4 DNA ligase
Cos
H
利
构用
建双
COS
基
因
组质
文粒
S
离体包装
S
库载
感染 E.coli
体六. 利用P1载体构建基因组构建过程也与λ载体构建过程十分相似:
1. 两臂DNA片段的制备: pAD10sacB BamHI/ScaI 2. 供体DNA片段的制备: 部分酶切蔗糖梯度离心 3. 两DNA的连接和重组DAN分子的包装

基因组文库构建

构建基因组 D N A 和 cD N A 文库的流程示意图
第一节 DNA克隆片段的产生与分离
一.基因组DNA的片段化 1.用限制酶片段化:
用限制酶消化DNA，不经凝胶电泳分部离,直接和载体连接的克隆方法叫鸟枪法(shot-gan approach) 存在的问题： ①所形成的重组体分子是一群带有大小不同插入片段的混合群体。以每个载体可插入1～3kbDNA计算，基因库至少含10～30万个重组质粒。从中筛出目的基因工作量是很大的。 ②目的基因内部可能有一个以上的酶切位点，即一个基因分载在几个重组质粒上，完整筛出更不容易。
H in d I I I C os N otI Z T7 P a rC CM SP6 N otI
r
H in d III 部分酶切
P a rB P a rA
BAC o r iS PFG L re p E H in d I I I C IP
P u lse d -fie ld g e l e le c tro 使其成为一定大小的片段连接到适当载体常为噬菌体上经体外包装转染细菌得到一群含不同dna片全部基因的随酶切使其成为一定大小的片段，连接到适当载体(常为噬菌体)上，经体外包装转染细菌，得到一群含不同DNA片段的重组噬菌体颗粒。此即是基因。这群DNA片段含盖基因组全部基因。
但应注意： (1) 细胞中不同mRNA的丰度不同，低丰度的 mRNA要求很高的克隆数(要用公式来计算)。 (2)有的基因表达具有严格的时空性，要获得其mRNA并非易事。用不同发育阶段，或DNA。不能用于基因结构和调节的研究。一个基因经不同的剪接可产生不同的部分重叠的cDNA克隆。
真核基因组 DNA
λ 取代型 λ 噬菌体载体

12第十二讲无终卡农与卡农模进

主体部份与卡农式模仿相同但在其结尾靠近回头处则需运用纵向移动或纵横移动的技术加以处理才能使其首尾贯通
第十二讲、无终卡农与卡农模进一、无终卡农
无终卡农是卡农式模仿的一种。如果卡农式模仿结束部分的旋律，能与其开始部分连接贯通，并作不间断的反复，即构成无终卡农。如：
例2
无终卡农的写作举例
二、卡农式模进
卡农式模进是复调模仿手法与音乐材料模进展开手法的结合。它是由一个包括起句、应句、对句在内的原始音组所作的周期性重复，而每次重复又在一个新的高度上。
例3 卡农式模进
卡农式模进的写作方法与无终卡农相近，通常也需借助第三辅助声部来完成。第三辅助声部位置和高度的确定与无终卡农确定辅助声部的方法完全相同。即：辅助声部的位置及其首音与新音组首音出现时的位置，在距离和高度上与起句首音到应句首音的距离和音程反方向相等。如图所示：
例1 无终卡农《两只老虎》
无终卡农的写作，开始部位和主体部份与卡农式模仿相同，但在其结尾靠近回头处，则需运用纵向移动或纵横移动的技术加以处理，才能使其首尾贯通。具体地说，需要借助于第三辅助声部来完成。确定第三辅助声部位置和高度的原则是： 1、辅助声部出现的部位在主题回头前，视主题单独呈示的长短(即起句与应句的距离)而定。若主题单独呈示的长度是2小节(如上例)，辅助声部则在反复记号两小节前设置。如果主题单独呈示的长度只有1小节，辅助声部就在反复记号1小节前设置。 2、辅助声部的高度以主题返回时第一个音(首音)的高度为基准，辅助声部首音与主题返回时首音的距离，与起句首音到应句首音的距离反方向相等。图示如下：
例4
卡农模进

第十一章 DNA文库的构建和目的基因的筛选

和仅为4.6%，低丰度的比例高达95.4% 基因组DNA饱和杂交法&基于复性，使筛选差异表达基因的可能性大大提高原理：将含目的基因的组织或器官的mRNA群体作为待测样本（tester），将基因表达谱相似或相近但不含目的基因的组织或器官的mRNA群体作为对照样本（driver），使tester和driver的cDNA进行多次杂交，去掉在二者之间都表达的基因，而保留二者之间差异表达的基因。
(3) 引导合成法
Okayama-Berg方法
（4）引物-衔接头合成法
4、双链 cDNA连接到质粒或噬菌体载体并导入大肠杆菌中繁殖的分子克隆
1.同聚100dA/dT, 20dG/dC) • 同聚尾结合的质粒： cDNA杂合分子转化 E.coli的效率随宿主不同而不同。
该法聪明地利用了反转录过程中用接头锚定的方法，与传统法相比，全长cDNA的比例得到大幅提高
2. G
1. 抑制性扣除杂交 suppression subtractive hybridization, SSH
含目的基因的cDNA：供体 tester 不含目的基因的cDNA：驱动 driver
• RsaI消化tester和driver • 将tester一分为二，分别加上接头1和接头2R • 第一轮杂交中，用过量的driver cDNA分别与带两种接头的tester cDNA杂交 • 第二轮杂交中，将第一轮杂交的两个体系混合，再加入过量的driver cDNA • 补平第二轮杂交产物的末端，进行两轮PCR扩增 • 巢式引物进行第二轮PCR扩增，富集差异表达基因 • T/A克length cDN因： • cDNA第二链合成工程中聚合酶的外切酶活性； • mRNA降解； • 反转录酶合成特性，从转录复合体上anism at 5' end of RNA • 指导合成高分子量蛋白质的能力无细胞翻译体系（源于网织红细胞）哺乳动物总mRNA可编码 10～100kDa蛋白

DNA文库的构建

，包含该生物的所有遗传物质：编码的、不编码的；应该是物种特异性的组织（某一类细胞）的mRNA反转录成cDNA构建而成，因此只包含被表达基因的编码序列（还有mRNA上的3‘、；体现了基因的表达调控。
真核生物mRNA的结构
2、提取RNA基本步骤
总步骤：裂解细胞、沉淀蛋白、去除DNA、质量分析等；裂解细胞：强离液剂：胍盐, SDS, N-laurylsarcosine
(sarcosyl), 尿素, 苯酚；破坏质膜，保持细胞核或细胞器的完整性：如Nonidet P-40 (NP-40)，研磨、蛋白酶K、蜗牛酶(含纤维素酶、甘露聚糖酶、葡糖酸酶和几丁质酶等，可破坏酵母菌细胞壁)、SDS等处理；沉淀蛋白：SDS、β -巯基乙醇、氯仿、苯酚、盐酸胍、异硫氰酸胍等；沉淀RNA：乙醇、异丙醇、氯化锂等； RNA质量分析；从总RNA中纯化分离mRNA； RNA的长期保存。
制备基因组DNA的常用试剂
破碎细胞（液氮研磨、匀浆、超声波破碎）除去蛋白杂质：（蛋白酶K、SDS、 CTAB、苯
酚）；除去RNA(RNase A) 除去黏多糖(CTAB); 沉淀DNA（乙醇、异丙醇）；抑制DNase（EDTA，可以螯合Mg++等）；脱盐（70%乙醇漂洗）。
关键是对付RNase：措施
为了保证mRNA的完整性，必须使用最新鲜的生物材料，最好是培养的活细胞，或从活体即刻采集的样品进行制备，或者置于液氮、超低温冰箱保存的样品；
DEPC处理配置溶液用水：用0.1% DEPC（焦碳酸二乙酯，一种很强的RNA酶抑制剂）浸泡处理和高压灭菌；
烘烤玻璃器皿：200-300℃烘烤4小时；塑料器皿：在0.5 M NaOH中浸泡10分钟，用水彻底清洗，灭菌，即可去除 RNase；

基因文库的构建

5. 重组重组cDNA分子的转移和的建立分子的转移和的建立选用载体为质粒，可直接转化载体，选用载体为质粒，可直接转化E.coli；若为载体，则；若为λ载体需进行体外包装、感染等。需进行体外包装、感染等。
ds-DNA合成与SalI匹配接头相连 NotI酶切
cDNA的段或条件的某种细胞分定义：
离到的全部mRNA经反转录成 cDNA后再重经反转录成离到的全部后再重组和增殖所产生的无性繁殖系的总和。组和增殖所性
常来自结构基因，常来自结构基因，仅代表某种生物的一小部分遗传信且只代表那些正在表达的基因的遗传信息：息，且只代表那些正在表达的基因的遗传信息：1—5% mRNA，80—85% rRNA，10—n(1―p) ln(1―f)
f为某一特定为某一特定cDNA（mRNA）的分子数目与全部为某一特定（） cDNA (mRN1. 载体载体DNA片段的制备片段的制备 2. 多聚（A）RNA的分离与纯化多聚（）的分离与纯化 3. 双链双链cDNA 的合成
2. 器官特异性
不同器官或组织的功能不一样，不同器官或组织的功能不一样，因而有的结构基因的表达就具有器官特异性，故由不同器官提取的mRNA所表达就具有器官特异性. 代谢或发育特异性
处于不同代谢阶段（或发育阶段）处于不同代谢阶段（或发育阶段）的结构基因表达亦不相同
4. 不均匀性在同一个cDNA中，不同类型的cDNA分中，不同类是大不相同的，尽管它们都是由单拷贝基因转贝基因均有相同的克隆数相较，这是两种文库的另一差别。库的另一差别。
NotI primer/adaptor
载体
1)SalI/NotI 2)T4 DNA ligase
SalI adaptor

基因文库构建的过程、原理及方法

基因⽂库构建的过程、原理及⽅法基因⽂库构建的过程、原理及⽅法1 cDNA ⽂库的构建1.1 cDNA ⽂库构建的基本原理与⽅法cDNA ⽂库是指某⽣物某发育时期所转录的全部 mRNA 经反转录形成的 cDNA ⽚段与某种载体连接⽽形成的克隆的集合。

经典 cDNA ⽂库构建的基本原理是⽤ Oligo(dT) 作逆转录引物，或者⽤随机引物，给所合成的 cDNA 加上适当的连接接头，连接到适当的载体中获得⽂库。

其基本步骤包括：RNA 的提取(例如异硫氰酸胍法，盐酸胍—有机溶剂法，热酚法等等，提取⽅法的选择主要根据不同的样品⽽定)，要构建⼀个⾼质量的 cDNA ⽂库，获得⾼质量的 mRNA 是⾄关重要的，所以处理 mRNA 样品时必须仔细⼩⼼。

由于RNA 酶存在所有的⽣物中，并且能抵抗诸如煮沸这样的物理环境，因此建⽴⼀个⽆ RNA 酶的环境对于制备优质 RNA 很重要。

在获得⾼质量的 mRNA 后，⽤反转录酶 Oligo(dT) 引导下合成 cDNA 第1链， cDNA 第2链的合成(⽤ RNA 酶 H 和⼤肠杆菌 DNA 聚合酶 I，同时包括使⽤ T4 噬菌体多核苷酸酶和⼤肠杆菌 DNA 连接酶进⾏的修复反应)，合成接头的加⼊、将双链DNA 克隆到载体中去、分析 cDNA 插⼊⽚断，扩增 cDNA ⽂库、对建⽴的 cDNA ⽂库进⾏鉴定。

这⾥强调的是对载体的选择，常规⽤的是λ噬菌体，这是因为λ DNA 两端具有由12个核苷酸的粘性末端，可⽤来构建柯斯质粒，这种质粒能容纳⼤⽚段的外源 DNA。

1.2 cDNA 全长⽂库经典 cDNA ⽂库的构建虽然⾼效、简便，但⽂库克隆的⽚段⼀般较⼩，单个克隆上的 DNA⽚段太短，所能提供的基因信息很少，⼤多需要⼏个克隆才能覆盖⼀个完整的全基因的 cDNA。

为了克隆到真正的 cDNA 全长，建⽴富含全长的 cDNA⽂库具有重要意义。

为此，必须克服仅⽤ mRNA 的 PolyA 尾合成以及由普通逆转录酶作⽤特点所导致的局限性。

基因文库的构建

衔接头：一端为平头，一端为粘末端。
（2）cDNA与载体相连
cDNA与一个载体在T4连接酶作用下以粘末端互相连接，即为重组DNA 分子。
（3）导入宿主细胞重组体在一定条件下导入宿主细胞培
养或保存。宿主细胞必须是来自一个细胞的克隆
体的寡核苷酸链为探针）
2. mRNA比基因组中基因少, 因此筛选某一特定功能基因工作量较小。
3. mRNA中拷贝数大于基因组中的拷贝数, 利于获得较多的模板。（转录特征）
4. 可在原核细胞中表达有生物活性蛋白
5. 不同种类不同状态的细胞的cDNA不同 6. 不能研究基因组的结构功能
构建cDNA1.制备mRNA凝胶阻滞法
DNase Ⅰ足迹法
4.7.1 凝胶阻滞实验
又叫DNA迁移率变动实验（DNA mobility shift assay），是在80年代初期出现的用于在体外研究DNA与蛋白质相互作用的一种特殊的凝胶电泳技术。它具有简单、快捷等优点，也是当前被选作分离纯化特定DNA结合蛋白质定长度的DNA片段克隆到某种载体上发育时期所转录的mRNA 经逆转录形成的cDNA片段与某种载体ene pool)：某一生物群体所拥有的全部基因。
4. 筛选目的基因
原核细胞不可用来作为基因的表达系统（无转录后加工）。
原核细胞基因库——只能用核酸探针杂交筛选目反转录酶的作用下将点：
1. cDNA无内含子, 长度较基因组基因小, 使操皿内所形成的菌落或噬菌斑）转印到硝酸纤维素膜上，碱解后加带标记的探针进行杂交，能显示特异结合探针的点（克隆）便是目的基因所在处。确定菌落或噬菌斑的位置，扩增，提取，再用限制性酶切出cDNA基因片断，即为目的基因。（如图）
溶菌、使DNA 暴露

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基因组DNA
限制性内切酶
……
克隆、转化、培养、鉴定基因组Hale Waihona Puk过建立叠连群(conti一般来说，DNA片段长，完整基因组文库所含的克隆数越少。反之，越多。基因组越大，应包含的克隆数越多，反之，越少。
oligo(dG)引导合成全长dscDNA
载体引导合成全长dscDNA
置换法合成某种生物体特定组织、特定发育阶一个基因都存在于完全的基因组文库中，并不受生物组织或发育时期的影响。
根据许多可能的序列，合成出6-10个核苷酸长的寡核苷酸短片段（混合物），作为合成第一链cDNA的引物。
在应用这种混合引物的情况下，cDNA的合成可以从mRNA模板的许多位点同时发生，而不仅仅从3’-末端的oligo(dT)引物一处开始。
4.3 第二链cDNA的合成 • cDNA第二链的合成就是将上一步形成的 mRNA:cDNA杂合双链变成互补双链cDNA 的过程。 • cDNA第二链的合成的方法大致4种：自身引导合成法置换合成法引导合成法引物－衔接头合成法
转录区段序列，不能用于研究基因编码区外侧调控序
列的结构与功能。基因组DNA与cDNA的比较基因组DNA
cDNA
基因重组
4.1 细胞总RNA的提取和mRNA的分离 RNA： tRNA、rRNA、mRNA(1%—5%）
真核生物的mRNA具有一个polyA的3’末端，可以被用于mRNA的分离；
oligo(dT):polyA 杂交链在高盐离子浓度下可以保持，在低盐离子浓度下或较高温度下就会分开，利用这一性质从RNA中分离纯化mRNA。
⑵基因组DNA的片段化 ①酶切部分酶切的主要目的小孔喷射超声波处理高速搅拌
⑶载体的制备要求：载体的去磷酸化处理载体的纯度
⑷重组连接按照连接酶催化反应的最适条件设置反应体系，同时还应通过预备性实验确立反应体系具体的参数。
4.2 cDNA第一链的合成 ① oligo(dT)引导的DNA合成法利用真核mRNA分子所具有的poly(A)尾巴的特性，加入12-20个脱氧胸腺嘧啶核苷组成的 oligo(dT)短片段，由反转录酶合成cDNA的第一链。
②随机引物引导的cDNA合成法 (randomly primed cDNA synthesis)
RNase H ：特异水解与DNA 杂交的RNA上的磷酸二酯键，产生带有3‘—OH和5’—P的产物
③引导合成法
library
导致cDNA不完整的原因： ①cDNA第二链合成中聚合酶的外切核酸酶活性
)
② mRNA的降解，它容易从5‘端降解。起始生物材料、抽提和纯化过程中RNase的污染、机械断裂. ③反转录酶的合成特性与mRNA的分子结构有关与反转录酶从转录复合体上脱离有关
cDNA克隆只能反映着mRNA的分子结构，没有A的分布状态，即：高丰度mRNA的cDNA克隆，所占比例较高，分离基因容易；低丰度mRNA的 cDNA克隆，所占比例较低，分离基因困难；从cDNA克隆中，不能克隆到基因组DNA 中的非
⑸噬菌体离体包装 ⑹中复制增殖造成有些克隆丢失，有的增加，有的减少。⑵的筛选噬菌斑原位杂交 PCR筛选
5 基因组DNA构建的程序 (噬菌体基因组的构建) ⑴基因组DNA的分离制备不同来源的DNA制备方法不同。一般来说，有液相法和固相法两种。液相法提取的DNA长度一般在100kb左右，基本可以满足构建各种小插入片段基因组文库的要求。
大相对分子质量(high molecular weight,HMW) 基因组D部mRNA反转录成cDNA，并全部克隆成重组子，在该重组子群集中包含了其全部特别适合某些病毒基因组结构克隆对应一种mRNA序列，这样在目的基因的选择中出现假阳性的概率就会比较低，因此阳性的杂交信号一般都是有意义的，由此选择出来的阳性克隆将会含有目的基因序列。 ⑷可以在原核中表达。
①自身引导合成法
获得的单链cDNA3’端会形成发夹结构的能力，以此作为第二链合成的引物，在大肠杆菌聚合酶I Klenow或反转录酶的作用下，合成cDNA的第二链。
②置换合成法以第一链合成产物cDNA：mRNA杂交体作为切口平移的模板，RNA酶H在杂交体的mRNA 链上造成切口和缺口，产生一系列RNA引物，在大肠杆菌DNA聚合酶I 的作用下合数不宜过大，以减轻筛选工作的压力
• 载体的装载量最好大于基因的长度，避免基因被分隔克隆； • 克隆与克隆之间必须存在足够长度的重叠区域，以利克隆排序；
• 克隆片段易于从载体分子上完整卸下；
• 重组克隆能稳定保存、扩增、筛选。基因组和cDNA的构建第一节
基因组的构建1 基因组(genomielibrary):
将某一生物基因组DNA片段化并全部克隆后所获得的重组子群体的总称。过产生一系列一定大小、覆盖全基因组的DNA 片段的重组cDNA分子反映来源细胞中表达信息的完整性。 3.2 重组cDNmRNA； ⑶ cDNA的合成； ⑷ 黏性末端片段与载体的连接； ⑸ 离体包装获得重组噬菌体； ⑹
基因重组
体外包装不同的基因，但在一定时间阶段的单个细胞或个体中，有 15%左右的基因得以表达，产生约15000种不同的mRNA分子。可见，由mRNA出发的cDNA克隆，其复杂程度要比直接从基因组克隆简单得多。

12 第十二讲 DNA文库的构建

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