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基因⽂库构建的过程、原理及⽅法基因⽂库构建的过程、原理及⽅法1 cDNA ⽂库的构建1.1 cDNA ⽂库构建的基本原理与⽅法cDNA ⽂库是指某⽣物某发育时期所转录的全部 mRNA 经反转录形成的 cDNA ⽚段与某种载体连接⽽形成的克隆的集合。
经典 cDNA ⽂库构建的基本原理是⽤ Oligo(dT) 作逆转录引物，或者⽤随机引物，给所合成的 cDNA 加上适当的连接接头，连接到适当的载体中获得⽂库。
其基本步骤包括：RNA 的提取(例如异硫氰酸胍法，盐酸胍—有机溶剂法，热酚法等等，提取⽅法的选择主要根据不同的样品⽽定)，要构建⼀个⾼质量的 cDNA ⽂库，获得⾼质量的 mRNA 是⾄关重要的，所以处理 mRNA 样品时必须仔细⼩⼼。
由于RNA 酶存在所有的⽣物中，并且能抵抗诸如煮沸这样的物理环境，因此建⽴⼀个⽆ RNA 酶的环境对于制备优质 RNA 很重要。
在获得⾼质量的 mRNA 后，⽤反转录酶 Oligo(dT) 引导下合成 cDNA 第1链， cDNA 第2链的合成(⽤ RNA 酶 H 和⼤肠杆菌 DNA 聚合酶 I，同时包括使⽤ T4 噬菌体多核苷酸酶和⼤肠杆菌 DNA 连接酶进⾏的修复反应)，合成接头的加⼊、将双链DNA 克隆到载体中去、分析 cDNA 插⼊⽚断，扩增 cDNA ⽂库、对建⽴的 cDNA ⽂库进⾏鉴定。
这⾥强调的是对载体的选择，常规⽤的是λ噬菌体，这是因为λ DNA 两端具有由12个核苷酸的粘性末端，可⽤来构建柯斯质粒，这种质粒能容纳⼤⽚段的外源 DNA。
1.2 cDNA 全长⽂库经典 cDNA ⽂库的构建虽然⾼效、简便，但⽂库克隆的⽚段⼀般较⼩，单个克隆上的 DNA⽚段太短，所能提供的基因信息很少，⼤多需要⼏个克隆才能覆盖⼀个完整的全基因的 cDNA。
为了克隆到真正的 cDNA 全长，建⽴富含全长的 cDNA⽂库具有重要意义。
为此，必须克服仅⽤ mRNA 的 PolyA 尾合成以及由普通逆转录酶作⽤特点所导致的局限性。
基因组文库构建的程序基因组文库构建程序基因组文库构建是基因组学研究中的重要步骤之一，它是将DNA 分子切割成小片段，并将这些小片段插入到载体DNA中，形成文库。
文库构建的成功与否直接影响到后续的测序结果和分析结果。
因此，开发高效、准确的基因组文库构建程序对于基因组学研究具有重要意义。
基因组文库构建程序的主要步骤包括DNA片段切割、文库构建、文库质量控制等。
其中，DNA片段切割是文库构建的关键步骤之一。
DNA片段切割的方法有多种，如限制性内切酶切割、超声波切割、化学切割等。
不同的切割方法适用于不同的样品类型和研究目的。
例如，限制性内切酶切割适用于较小的基因组，而超声波切割适用于大型基因组。
文库构建是基因组文库构建程序的核心步骤之一。
文库构建的方法有多种，如插入式文库构建、接头式文库构建等。
插入式文库构建是将DNA片段直接插入到载体DNA中，而接头式文库构建则是在DNA片段的两端加上接头序列，再将其插入到载体DNA中。
接头式文库构建相对于插入式文库构建具有更高的文库构建效率和更低的文库构建偏差。
文库质量控制是基因组文库构建程序的最后一步。
文库质量控制的目的是检测文库的质量和纯度，以保证后续的测序结果和分析结果的准确性。
文库质量控制的方法有多种，如琼脂糖凝胶电泳、荧光定量、质量评估等。
其中，质量评估是文库质量控制的重要步骤之一，它可以评估文库的质量和纯度，并确定文库的适用范围和测序深度。
基因组文库构建程序是基因组学研究中不可或缺的步骤之一。
开发高效、准确的基因组文库构建程序对于基因组学研究具有重要意义。
未来，随着基因组学研究的不断深入，基因组文库构建程序的研究和开发将会越来越重要。
二代测序DNA文库构建概述杂交捕获流程➢探针根据感兴趣的目标序列设计➢探针与目标序列互补，因而可进行特异性杂交➢实验的关键是探针和基因组DNA或cDNA的杂交，其特异性决定了靶向富集的效率检测变异类型：•Single nucleotide polymorphism (SNP) •Insertion/deletion (indel)•Copy number variation (CNV)•Gene Fusion二代测序文库构建流程DNA 样品*片段化核心步骤：➢末端修复➢加A尾➢接头连接*文库扩增文库产出测序文库构建概述（Illumina平台）Y 形测序接头原始DNA片段化DNA接头连接PCR 扩增DNA 插入片段文库构建步骤概述DNA 样本投入DNA片段化片段末端补平&加“A”尾测序接头连接片段大小筛选（可选）PCR文库富集DNA 文库产出建库时需要加入多少的DNA量呢？需要根据实际的应用及样本情况进行选择优化如何对DNA进行片段化？1、物理打断：通常使用超声来打断，如Covaris2、酶切打断：如KapaHyperplus文库构建试剂盒DNA片段末端补平、5`端磷酸化、3`端加“A”尾补平及磷酸化末端加“A”尾测序接头与DNA片段的连接通过磁珠纯化、文库片段大小选择（可选步骤）通过调节结合buffer的浓度，实现磁珠选择吸附不同大小的片段对两端都加上接头的文库通过PCR扩增？Primer 1Primer 2AA最终得到的文库起始DNA片段最终文库。
基因组DNA测序文库构建1.对收到的DNA样品进行检测，取2-3ul样品，用1%的琼脂糖胶检测，对于纯度不够（含RNA或蛋白）的DNA样品需要柱纯化后重新检测。
对于细菌基因组需要扩增16S全长序列，进行验证。
对于噬菌体或者质粒样品，若用16S全长引物扩增，无目的条带则无细菌基因组污染，若出现目的条带则存在污染，需要去除后建库。
2.用Qubit检测DNA样品浓度。
3.吸取部分DNA样品，用TE或Elution Buffer稀释，终浓度在10ng/ul-30ng/ul之间，体积为130ul。
用Covaris破碎，破碎时请根据需要片段大小，按标准操作流程操作。
4.样品足够多的情况下，可以取适量破碎后的产物进行PAGE胶或者琼脂糖胶检测。
5.对破碎后的产物进行柱式法（5倍体积的B3+100-200ul异丙醇）浓缩回收，加入50-100ulTE或Elution Buffer洗脱。
回收产物用Qubit测值。
6.修平和磷酸化100ul体系DNA 1ug5 X T4 polymerase buffer 20ulBSA (5mg/ml) 2ulATP (100mm) 1uldNTP（10mm）10ulT4 DNA Polymerase (5U/ul) 1ulKlenow（10U/ul）1ulT4 PNK (10U/ ul) 1.5ul22°C反应20min，柱式法纯化,50-100ul TE洗脱。
纯化后Qubit测值。
7.加‘A’100ul体系DNA 0.5-2.5ug10 X klenow buffer 10uldATP(10mm) 1-3ulKlenow(exon-)（5U/ul）1-3ul37°反应20min，柱式法纯化，50-100ul TE洗脱。
纯化后Qubit测值。
8.连接头200ul体系10 X T4 DNA ligase buffer 20ulPEG4000 30ulATP(100mm) 2ulDNA X接头 YT4 DNA ligase 1.5-2ul加水至 200ulDNA与接头的摩尔比约在1:3至1:10之间。
基因组文库构建的程序
基因组文库构建的程序通常包括以下步骤：
1. DNA提取：从样品（比如细胞、组织、血液等）中提取DNA，并对其进行质量控制。
2. DNA片段化：将DNA样品通过不同的方式（比如随机切割、酶切等）分解成小片段，一般为200-800bp。
3. 处理DNA片段：对DNA片段进行多个步骤的处理，包括末端修复、加上适配器、文库大小筛选等。
4. PCR扩增：使用PCR技术通过适配器扩增DNA片段，以获得足够多的文库。
5. 纯化文库：对PCR扩增产生的文库进行纯化，以去除杂质。
6. 测序：利用高通量测序技术对文库进行测序，生成原始测序数据。
7. 数据处理：对原始测序数据进行序列质控、序列拼接、比对等处理，最终生成基因组序列。
常用的基因组文库构建程序有：TruSeq DNA Sample Preparation Kit（Illumina）、Nextera DNA Flex Library Prep Kit（Illumina）、KAPA HyperPlus Library Preparation Kit （Roche）等。
