目的基因的克隆与基因文库的构建

第讲目的基因的克隆与分离引言目的基因是指在一项研究中，具有研究意义或实际应用价值的基因。

目的基因克隆和分离是分子生物学研究的重要环节，它们为后续研究提供了基础和保障。

本文将介绍目的基因克隆和分离的方法和技术。

一、目的基因的克隆1. PCR扩增PCR是聚合酶链反应的简称，是一种利用DNA聚合酶酶作用、在体外增加DNA序列数量的技术。

PCR扩增可以在保证目的基因序列一致性的前提下，扩增出足够的DNA量，用于后续实验。

PCR扩增的步骤一般包括模板DNA的选择、引物的设计和勘误、PCR反应体系的搭建等。

2. 基因文库筛选基因文库指的是将一个或多个组织的基因在体外克隆并构建而成的基因库。

基因文库筛选是一种在文库中选取目的基因的方法。

其中最常用的是基于杆菌的蛋白表达文库、细胞质体DNA文库和DNA合成文库。

基因文库筛选的步骤一般包括构建文库、传统筛选和高通量筛选。

3. 限制性内切酶切割限制性内切酶切割是指利用特定的酶切位点将DNA分割成碎片，然后选取目标DNA寻找需要的限制酶切片段的方法。

这种方法可以快速而准确地寻找目的基因，并进行克隆。

限制酶切割的步骤一般包括DNA提取、DNA质量检测、选取限制酶和体外反应等。

二、目的基因的分离1. 分子杂交分子杂交是指在体外或体内使某一脱氧核糖核酸（DNA）与另一种DNA或核酸杂交而形成方法的过程。

它的作用是寻找与目的基因DNA互补的DNA序列，并在该序列中分离目的基因。

分子杂交的步骤主要包括细胞培养和DNA序列的寻找和筛选等。

2. 化学合成化学合成是指通过化学方法合成目的基因的方法。

这种方法可以直接合成目的基因，只要知道目的基因的序列就可以了，不需要进行PCR扩增、克隆等操作。

化学合成的步骤主要包括碱基合成、链延伸、中间产物合成和连接、滤液等。

3. 通量基因测序通量基因测序也称为高通量测序，是一种快速且准确测定DNA或RNA序列的方法。

通过对目的基因进行测序，可以快速分离目的基因。

第八章 DNA文库的构建和目的基因的筛选第一节 概述基因工程主要是通过人工的方法分离、改造、扩增并表达生物的特定基因，从而深入开展核酸遗传研究或者获取有价值的基因产物。

通常将那些已被或者准备要被分离、改造、扩增或表达的特定基因或DNA片段，称为目的基因。

因目的基因片段需插入载体，导入宿主细胞内复制，所以对宿主细胞DNA而言，又称它为外源性基因。

目的基因主要是编码蛋白质(酶)的结构基因，诸如抗逆性相关基因、生物药和保健品相关基因、毒物降解相关基因以及工业用酶相关基因等。

随着生物长期的进化，生物界积累了大量对人类有用的基因。

它是大自然恩赐于人类的宝贵资源，等待人们去开发利用。

目的基因用途很广，主要有以下几个方面：①研究该基因的全貌与内涵，如详细分析其结构、功能及调控。

②与正常基因对比，寻找异常基因的异常点，进而探索疾病发生的分子生物学机理及治疗对策。

③研究生物种系进化与相关同源性。

④应用某种基因大量表达，生产所需要的蛋白质或多肽（如胰岛素、干扰素等药物）。

⑤在农、林、牧、副、渔业中，改造某些目的基因，以改良品种，促进经济发展。

⑥建立基因疗法院，选用某种正常基因,引入患者体内，对某些先天性遗传疾病进行治疗。

根据研究对象的研究目的不同，目的基因可来自原核细胞或真核细胞。

原核生物基因组较简单，较易获得目的基因。

哺乳动物真核细胞基因组庞大复杂，可根据不同的要求选择适宜方法，从中获得目的基因。

要从数以万计的核苷酸序列中挑选出非常小的所感兴趣的目的基因，是基因工程中的第一个难题。

欲想获得某个目的基因，必须对其有所了解，然后根据目的基因的性质制定分离的方案。

目的基因的制备是基因工程研究和应用的关键内容之一。

根据实验需要，待分离的目的基因可能是一个完整的有功能的基因，除了编码区，还包含转录启动区和终止区序列，或者是一个完全的操纵子或基因簇，也可能是只具有编码序列的基因区，甚至是只含启动子或终止子等部件的DNA片段。

《基因工程》思考题第一章绪论1. 简述基因操作、基因重组和基因工程的关系。

2. 为什么说基因工程是生物学和遗传学发展的必然产物？3. 简述基因的结构组成对基因操作的影响。

4. 谈谈你对gene的认识，并简要说说gene概念的演变过程.5. 如何理解gene及其产物的共线性和非共线性？6. 试从理论和技术两个方面谈Gene Engineering诞生的基础.第二章基因工程的基本原理与支撑技术1. 试比较原核基因组与真核基因组的结构和功能特点2. 试比较原核基因和真核基因表达调控的主要方式和特点3. 分析比较琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳的异同点？4. 琼脂糖凝胶电泳中，简述影响DNA在凝胶中迁移速率的因素.5. 小量制备质粒DNA，用质粒中特定的酶切发现切割不动，试分析可能原因及克服方法？6. 在基因操作实践中有哪些检测核酸和蛋白质分子量的常规方法？7. 印迹分子杂交有哪些种类，并说明在什么情况下需要使用这些方法。

8. 核酸分子的标记有哪些方法，各有何特点？9. 由mRNA反转录成cDNA和DNA的PCR扩增是两个完全不同的酶催化反应过程，如何将两个过程联系在一起，实现由mRNA起始扩增出DNA？10. Primer是PCR反应体系的四大要素之一，PCR的许多应用都是通过primer设计来实现的，请问primer设计的一般原则是什么？11. 在PCR反应的后期，或者循环次数过多时，反应体系中就会出现一种所谓的平台效应（Plateau effect），请问什么叫Plateau effect？产生Plateau effect的原因有哪些？12. 在对PCR产物进行电泳检测时，有时会出现拖带或非特异性扩增条带，请分析其原因？如果检测结果是看不到DNA带或DNA带很弱，那又是为什么？13. 通过双向蛋白质电泳发现某蛋白质与某植物的一种表型密切相关，若要利用编码该蛋白质的基因来转基因植物，试问如何分离得到该基因？14. 现有一序列已知的DNA片段和一序列未知的DNA片段，你分别如何设计测序策略？15. 设想一下在什么情况下你希望知道一个基因或一段DNA的序列？16. 什么叫有性PCR？有性PCR导致DNA重组的分子机制跟体内重组有何异同？17. Explain the PCR. List the steps in carrying it out; include all the components and special conditions, explaining why each one is used. Illustrate the process with appropriate labels. Use the correct scientific terminology in your explanation.第三章基因工程操作的基本条件1. 试指出影响限制性内切核酸酶（Restriction endonuclease）切割效率的因素.2. 在酶切缓冲液中，一般需加入BSA，请问加入BSA的作用是什么？并简述其原理？3. 何谓Star activity？简述Star activity的影响因素及克服方法.4. 某DNA序列中存在DpnI酶切位点，以此DNA为模板，在体外合成DNA序列，当用该酶进行酶切时，发现切割不动，试分析可能原因？5. 天然的质粒载体（plasmid vectors）通常需经改造后才能应用，包括去除不必要的片段，引入多克隆位点等。

基因工程中为什么要建立基因文库？基因文库是如何建立的？基因文库是指一个包含了某一生物体全部DNA序列的克隆群体。

目的：当我们要对某一基因结构和功能进行研究时，首先要获得此基因，最简便的方法就是直接从基因文库中获取。

构建过程：将纯化的细胞基因组DNA用限制性内切酶消化，获得一定大小的DNA片段，将这些片段克隆到载体中，从而获得含有不同DNA片段的噬菌体，这就是基因组文库。

打个比方让你建图书馆，你就得把所有书分门别类放，以便于找。

这么多书你一个人又搞不定，所以你得找一群人，一个人负责一部分，各自干各自的，然后最后一汇总就行了。

基因组文库和cDNA文库一.基因组文库用限制性内切酶切割整个基因组DNA，把所得的大量基因组DNA片段与载体连接，然后转化到细菌中去，让宿主菌长成克隆。

由此而得的克隆中每个细胞的载体上都包含有特定的基因组DNA片段。

这样的一套克隆便称作基因组克隆，而这些克隆中的一套基因组DNA片段则叫做基因组文库(genomic library)。

二.cNDA 文库的构建及应用cDNA基因文库(cDNA library)是指以 mRNA为模板，在反转录酶及其他一系列酶的催化作用下所获得的双链cDNA，经与适当载体连接并转化到寄主细胞内进行扩增，由此而构成包含着相应基因编码序列的一群克隆。

与基因组DNA克隆不同，用作cDNA克隆的真核mRNA，其间隔序列早已在拼接过程中被删除，而由这种成熟mRNA 为模板转变而来的DNA基因，自然也不含有非编码序列。

cDNA克隆除以 mRNA为起始材料这一优点外，其构建比较简易可行，而且由于每一个cDNA克隆都只含有一种mRNA序列，这样在选择中出现假阳性的概率也就较低。

随着分子克隆研究在理论和技术上的进步，cDNA 基因文库的构建不仅是分离基因的重要手段，也是当前真核分子生物学研究的强有力工具。

首先，在基因工程的操作中，以cDNA为探针可从基因组文库中分离出相应的特异基因；其次，cDNA序列只与基因中的编码序列有关，有助于对真核生物mRNA结构和功能的认识；再者，cDNA 克隆还可以有效地分析真核基因的结构和功能。

基因文库的构建与使用在生物科学领域，基因文库的构建和使用是研究基因功能和生物多样性的重要工具。

基因文库是指包含某种生物全部基因的克隆文库，它可以为我们提供深入了解该生物基因组的信息。

本文将详细介绍基因文库的构建与使用，包括基因文库的基本概念、构建方法、使用方法以及优势和展望。

一、基因文库的基本概念和作用基因文库是包含某种生物全部基因的克隆文库，它为我们提供了该生物基因组的全面信息。

构建基因文库的目的是为了方便研究者们筛选、分析和研究基因的功能以及多样性。

基因文库可以用于寻找基因的新颖功能、发现新的药物靶点以及为基因组编辑和改造提供资源。

二、构建基因文库的方法构建基因文库主要包括以下步骤：1、基因组文库的构建：首先需要获得该生物的基因组，然后将基因组进行分解，形成一系列重叠的DNA片段。

这些片段经过纯化、扩增和克隆到特定的载体中，形成基因组文库。

2、表达文库的构建：为了筛选出具有特定功能的基因，还需要构建表达文库。

表达文库中的基因需要在特定的细胞或组织中表达，以便研究者们能够确定基因的功能。

在构建基因文库时，需要考虑到基因的种类、基因表达水平以及克隆载体的选择等因素。

这些因素都会影响到基因文库的质量和实用性。

三、基因文库的使用方法使用基因文库可以方便地筛选和研究基因的功能。

以下是如何使用基因文库的一般步骤：1、选择相应的基因文库：首先需要选择包含所需基因的文库。

如果研究目标是寻找特定功能的基因，可以选择包含该功能基因的文库。

2、筛选候选基因：根据研究目标，可以在文库中进行筛查，挑选出可能具有所需功能的候选基因。

3、验证基因功能：通过实验验证挑选出的候选基因是否具有所需功能。

这可以通过表达和检测候选基因在细胞或整体生物中的功能来实现。

4、利用基因文库进行基因组编辑：基因文库也可以为基因组编辑提供资源和指导。

通过比对和分析基因文库中的序列，可以确定目标基因的精确位置和剪切位点，从而实现精准的基因组编辑。

一、目的基因克隆的策略有哪些？其理论依据什么？如何根据具体条件，如目的性状的特点，已知控制目的性状的基因的信息合理选择基因克隆的方法？1、主要有以下几个克隆的策略：（1）PCR法分离目的基因：从蛋白质的一级序列分析得到核酸序列的相关信息，设计简并引物，通过对mRNA进行反转录得到cDNA，以cDNA为模板，然后将目的基因通过PCR方法扩增，或者直接从基因组DNA扩增的方法。

（2）核酸杂交的方法：通过对蛋白质的氨基酸序列分析，设计简并引物，通过核酸杂交的方法从基因文库中筛选得到目的基因。

（3）免疫学筛选法分离目的基因：利用免疫学原理，通过目的蛋白的特异抗体与目的蛋白的专一结合，从表达文库中分离目的蛋白基因。

2、若控制该性状的目的蛋白质不容易分离纯化，这PCR方法比较适宜，若蛋白质分离纯化容易，且有现成的基因文库，则后两种方法较为简单。

二、蛋白组学方法克隆目的基因的理论依据是什么？有哪些技术环节？要用到哪些技术？1、理论依据：以分离纯化的目的蛋白为研究起点，通过对目的蛋白的一级结构分析，获得起码的氨基酸序列信息后，反推可能的DNA序列，然后设计引物，从cDNA中将目的基因扩增出来，或者设计核酸探针，通过杂交技术将目的基因从基因文库中筛选出来。

或通过抗体抗原免疫反应从表达文库中将该基因分离出来。

2、技术环节是确定并制备出高纯度的蛋白质。

3、所需要的实验技术有：蛋白质的双向电泳技术，由第一向的等电聚焦电泳和第二向的SDS-PAGE电泳组成；蛋白质氨基酸序列分析。

三、基因组学方法克隆基因的策略有哪些？各有什么特点？如何选择恰当的基因组学方法克隆目的基因？1、基因文库筛选方法通过对基因文库的筛选将目的基因分离出来，一般有两种方法：核酸杂交法，原理是分子杂交；PCR筛选法，通过ＰＣＲ方法将目的基因分离出来，对于以混合形式保存的文库，先将文库分成几份，每份为一个“反应池”进行PCR反应，待选出阳性池后，将阳性池的混合克隆稀释，然后等量分置96孔板中，进行横向池及纵向池的ＰＣＲ反应，然后将阳性菌落群进行稀释，重复上述工作，直到筛出阳性单克隆。

cDNA文库的构建基因文库的构建是现代生命科学研究中的一项重要技术。

自70年代初首例cDNA克隆问世以来，已用构建和筛选cDNA文库的方法克隆了很多基因。

通过构建cDNA文库能直接分离到生命活动过程中的一些调控基因及了解这些基因所编码的蛋白质的相互作用关系．因此cDNA文库的构建是基因克隆的重要方法之一，从cDNA文库中可以筛选到所需的目的基因，并直接用于该目的基因的表达。

它是发现新基因和研究基因功能的工具。

1.cDNA文库构建的原理真核生物基因的结构和表达控制元件与原核生物有很大的不同。

真核生物的基因是断裂的，在基因最后产物中表达的编码序列（外显子）被非编码序列（内含子）分隔开，需经RNA转录后加工过程才使编码序列拼接在一起。

真核生物的基因不能直接在原核生物中表达，只有将加工成熟的mRNA经逆转录合成互补的DNA（complementary DNA,cDNA）接上原核生物表达控制元件，才能在原核生物中表达。

而且，真核细胞的基因通常只有一小部分进行表达，由于mRNA的不稳定性，对基因表达和有关mRNA都常通过对其cDNA来进行研究。

为分离cDNA克隆或研究细胞的cDNA 谱，需要先构建cDNA文库。

所谓cDNA文库是指细胞全部mRNA逆转录成cDNA并被克隆的总和。

cDNA文库应包含的克隆数目可由以下公式来计算：N=ln(1-p)/ln(1-1/n)式中：N－cDNA文库所包含的克隆数目；P－低丰度cDNA存在于库中的概率，通常要求其大于99％；1/n－每一种低丰度mRNA占总mRNA的分数。

2.构建cDNA文库的基本步骤构建cDNA文库的基本步骤有五步：①制备mRNA；②合成cDNA；③制备载体DNA；④双链cDN 的分子克隆；⑤对构建的cDNA文库进行鉴定，测定文库包含的克隆数，抽查克隆的质量和异质性，如果需要可适当扩增。

对cDNA的文库的要求：一是希望文库能包括各种稀有mRNA的cDNA克隆；二是克隆的cDNA应是全长的，避免丢掉5’端的序列。

如何通过构建基因⽂库来获取⽬的基因⼀、概念主要有两种基因⽂库：基因组⽂库和cDNA⽂库。

基因组⽂库：⼀个⽣物体的基因组DNA⽤限制性核酸内切酶部分酶切后，将酶切⽚段插⼊到载体DNA分⼦中，所有这些插⼊了基因组DNA⽚段的载体分⼦的集合体，将包含这个⽣物体的整个基因组，也就是构成了这个⽣物体的基因⽂库。

cDNA⽂库：是指某⽣物某发育时期所转录的全部 mRNA 经反转录形成的cDNA⽚段与某种载体连接⽽形成的克隆的集合体。

⼆、构建基因⽂库的主要程序1、DNA提取及⽚段化或是cDNA的合成⼀个⽣物体的基因组DNA⽤限制性核酸内切酶部分酶切或全部mRNA经反转录形成的cDNA⽚段。

2、载体的选择及制备这些载体可以分为两类，⼀类是基于噬菌体改建的，利⽤了噬菌体的包装效率⾼和杂交筛选背景低的优点；另⼀类经改造的质粒载体或⼈⼯染⾊体，其主要优点在于可容纳超过100kb以上的外源⽚段。

3、DNA⽚段或cDNA与载体连接⽤重组DNA技术将某种⽣物细胞的DNA的所有⽚断随机地连接到基因载体上。

4、重组体转化宿主细胞⽤质粒作为载体的重组DNA分⼦可以通过转化引进细胞。

⽤λ噬菌体的DNA作载体的重组分⼦直接经转染引⼊细胞的效率较低；⼀般需先⾏离体包装，即把重组DNA分⼦包在噬菌体外壳中，再通过噬菌体感染⽽把重组DNA分⼦引⼊敏感细菌细胞中。

三、鉴定和转化细胞的筛选当获得了含重组体的宿主细胞时，即完成了基因的克隆。

然⽽，它只是分离基因的第⼀步，基因克隆后还要对克隆的基因进⾏分离。

因此，还必须对其进⾏必要的检测与分析，如序列测定，体外转录及翻译、功能互补实验等。

通过这些实验确定基因结构及功能，此时才能算分离到了⽬的基因。

所以，基因克隆、克隆基因分离、分离基因鉴定是利⽤基因⽂库技术分离⽬的基因的主要内容。

从基因⽂库中筛选某⼀克隆的基因常⽤办法是分⼦杂交。

⾸先把属于⼀个⽂库的细菌或噬菌体以较低密度接种在培养⽫上以取得相当分散的菌落或噬菌斑，然后⽤硝酸纤维滤膜吸印，使培养⽫和滤膜的相对应的位置上具有相同的克隆。

基因工程中的目的基因获得的方法
基因工程中获得目的基因的方法有以下几种：
1. PCR扩增法：利用聚合酶链反应（PCR）从一个已知源
DNA扩增目的基因的特定片段。

这种方法需要已知目的基因
的序列或者已知相关基因的序列来设计引物，通过PCR扩增
特定片段。

2. 基因合成法：利用化学合成技术合成目的基因的DNA序列。

这种方法可以通过合成多个片段，再进行连接而合成完整的目的基因。

3. DNA文库筛选法：构建基因文库，将源DNA片段插入载体中形成DNA文库。

然后利用对目的基因编码的蛋白质进行筛选，找出含有目的基因的载体。

4. 基因克隆法：将目的基因从一个生物体中剪切出来，然后将其插入到另一个载体中，形成重组DNA。

这种方法通常使用
限制酶切和连接酶进行DNA分割和连接。

5. 基因编辑法：利用CRISPR-Cas9、TALENs或ZFNs等基因
编辑技术，直接对细胞或生物体进行基因编辑，将目的基因插入到细胞或生物体的基因组中。

这些方法可以根据具体的实验需求和技术可行性来选择合适的方法来获得目的基因。