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第四章基因文库的建立
1） λDNA的包装物的制备
使用的大肠杆菌菌株： E.coli BHB2688(N205 recA[λimm434 cItsb2 red Eam Sam/λ])包装蛋白 E.coli BHB2690(N205 recA[λimm434 cItsb2 red Dam Sam/λ])头部蛋白
i. 两菌株分别培养，分别收集和制备，包装前混合---本底低（对λDNA分子大小有严格限制），高效。 ii. 两菌株分别培养，混合收集和制备----操作简单， 本底高，可包装不同大小的λDNA分子。 2） 重组λDNA分子的包装过程 包装制备物（-70℃）于冰上缓慢融化 加入重组 λDNA分子 边融化边混合边包装 离心除去 细胞碎片 λ颗粒于-70℃保存待用
2.0 kb 1.6 kb 1.8 kb
1.6 - 2.0 kb大小区域内的凝胶
块，从此凝胶块中回收DNA片
段，然后与载体进行拼接
鸟枪法操作的改进
凝胶DNA片段回收 技术
冻融法
滤纸法
吸附法 低融点凝胶法 溶解法
鸟枪法克隆目的基因的局限性
工作量较大，需要了解目的基因的 背景知识
不能获得的最小长度的目的基因
B
Ap r
H
Ap r
B
H
利 用 单
H
cos
Ori Ori
cos
Cos S
Hind H S1 S
SalI H
Cos S
COS
Cos S BamH I 大片段 Cos S
S1 Cos H BamH I 小片段 Cos H
质 粒 载 体 文 库
35-45kb DNA 片段 T4 DNA ligase
Cos
3. DNA的连接 4. 重组DAN分子的转化: 原生质体转化法 5. 转化子的保存: 单菌落保存于96孔平板中
使用的大肠杆菌菌株： E.coli BHB2688(N205 recA[λimm434 cItsb2 red Eam Sam/λ])包装蛋白 E.coli BHB2690(N205 recA[λimm434 cItsb2 red Dam Sam/λ])头部蛋白
i. 两菌株分别培养，分别收集和制备，包装前混合---本底低（对λDNA分子大小有严格限制），高效。 ii. 两菌株分别培养，混合收集和制备----操作简单， 本底高，可包装不同大小的λDNA分子。 2） 重组λDNA分子的包装过程 包装制备物（-70℃）于冰上缓慢融化 加入重组 λDNA分子 边融化边混合边包装 离心除去 细胞碎片 λ颗粒于-70℃保存待用
2.0 kb 1.6 kb 1.8 kb
1.6 - 2.0 kb大小区域内的凝胶
块，从此凝胶块中回收DNA片
段，然后与载体进行拼接
鸟枪法操作的改进
凝胶DNA片段回收 技术
冻融法
滤纸法
吸附法 低融点凝胶法 溶解法
鸟枪法克隆目的基因的局限性
工作量较大，需要了解目的基因的 背景知识
不能获得的最小长度的目的基因
B
Ap r
H
Ap r
B
H
利 用 单
H
cos
Ori Ori
cos
Cos S
Hind H S1 S
SalI H
Cos S
COS
Cos S BamH I 大片段 Cos S
S1 Cos H BamH I 小片段 Cos H
质 粒 载 体 文 库
35-45kb DNA 片段 T4 DNA ligase
Cos
3. DNA的连接 4. 重组DAN分子的转化: 原生质体转化法 5. 转化子的保存: 单菌落保存于96孔平板中
基因文库(1)
RST, STU
以QRS为探针筛查: OPQ, PQR, QRS, RST, STU
❖ 限制酶分别切割cDNA与载体DNA分子;
❖ 载体与cDNA连接构建重组体DNA分子;
❖ 重组体DNA转化宿主细胞与转化细胞培养;
❖ 平板培养与各个cDNA克隆分定组织细胞在特定
时期的基因表达.
编辑ppt
15
编特定DNA克隆.
• 靶DNA克隆可用DNA探针通过分子杂交方❖ 将某种生物细胞的基因组或染色体DNA的所有限制 酶切片断(或机械剪切片段)随机地连接到基因载体 上，然后转移到适当的宿主细胞中，通过细胞增殖 而构成含各个随机片段的一系列无性繁殖系 (DNA 克隆)，当DNA克隆数目足以包括该种生物的全部基 目不够多, 率之间关系可用下列公式表示:
N = ln (1- P)/ln (1-组的比例
编辑ppt
5
❖ 如果E. coli 随机片段的大小为 20 kb, 要求含有各 序列的概率为 0.99, 其基因库的克隆数应为: N = ln(1-0.99)/ln(1- 2×104/4.6×106) = 1100
编辑ppt
9
1 mRNA分离提取及纯化
磁珠分离法
Poly (T)
磁珠
摇晃振荡
mRNA
总RNA
纯化的mRNA
编辑ppt
磁珠 磁铁
tRNA rRNA
10
❖ 通过寡聚T-纤维素的mRNA分离纯化
Poly (T)
寡聚T-纤维素
总RNA 吸附mRNA
洗脱 mRNA
tRNA rRNA
编辑ppt
mRNA
11
2 cDNA合成故cDNA也称表达.• 特定组织细胞在特定发育时期或特定环境条件下的总
以QRS为探针筛查: OPQ, PQR, QRS, RST, STU
❖ 限制酶分别切割cDNA与载体DNA分子;
❖ 载体与cDNA连接构建重组体DNA分子;
❖ 重组体DNA转化宿主细胞与转化细胞培养;
❖ 平板培养与各个cDNA克隆分定组织细胞在特定
时期的基因表达.
编辑ppt
15
编特定DNA克隆.
• 靶DNA克隆可用DNA探针通过分子杂交方❖ 将某种生物细胞的基因组或染色体DNA的所有限制 酶切片断(或机械剪切片段)随机地连接到基因载体 上，然后转移到适当的宿主细胞中，通过细胞增殖 而构成含各个随机片段的一系列无性繁殖系 (DNA 克隆)，当DNA克隆数目足以包括该种生物的全部基 目不够多, 率之间关系可用下列公式表示:
N = ln (1- P)/ln (1-组的比例
编辑ppt
5
❖ 如果E. coli 随机片段的大小为 20 kb, 要求含有各 序列的概率为 0.99, 其基因库的克隆数应为: N = ln(1-0.99)/ln(1- 2×104/4.6×106) = 1100
编辑ppt
9
1 mRNA分离提取及纯化
磁珠分离法
Poly (T)
磁珠
摇晃振荡
mRNA
总RNA
纯化的mRNA
编辑ppt
磁珠 磁铁
tRNA rRNA
10
❖ 通过寡聚T-纤维素的mRNA分离纯化
Poly (T)
寡聚T-纤维素
总RNA 吸附mRNA
洗脱 mRNA
tRNA rRNA
编辑ppt
mRNA
11
2 cDNA合成故cDNA也称表达.• 特定组织细胞在特定发育时期或特定环境条件下的总
基因组文库的构建.ppt
重 组cDNA的总和，通常是在细菌或酵母中。 这些克隆代表从某个特定物种或器官的所 有mRNA制备得到的cDNA。
cDNA分子克隆(cDNA clone) ：将 cDNA片段装在载体上转化细菌,组中分离单拷贝的基因；N
AAAAAAA mRNA
(b)寡聚(dT)引物
第一条 cDNA 的合成
An
An
Tn
(c)发夹引物
第二条 cDNA 的合成
TTTTTTຫໍສະໝຸດ GGGGGGCCCCCC
加接头 1
TTTTTT
GGGGGG
AAAAAA
CCCCCC
(d)同聚物加尾反应 TTTTTT
TTTTTT AAAAAA
连接 DNA 片段和载体
重组载体 DNA 导入 E.coli (体外包装或转化)
基因库的鉴定与段的产生与分离
一.基因组DNA的片段化
1.用限制酶片段化:
用限制酶消化DNA，不经凝胶电泳分部离,直接和载体 连接的克隆方法叫鸟枪法(shot-gan approach)
(2)有的基因表达具有严格的时空性，要获得 其mRNA并非易事。用不同发育阶段，或差A。不能用于基因结构和调节的研 究。一个基因经不同的剪接可产生不同的部 分重叠的cDNA克隆。
高速搅拌：1500转/分×30分 长度8kb的分子群体。
可切 平均
3.双酶消化
单酶消化的产物一般分子较大，选择时要考 虑到载体容量，如噬菌体插入片段不超过 25kb,为此可选用识别4bp的限制酶(切割平 均长度为256bp) ,识别6bp的限制酶切割平 均长度4096 bp.
双酶切产生的DNA片段平均大小不超过1kb, 但如采用双酶部分消化，产物的分子量 可达10～30kb,它们存在着随机序重叠， 用蔗糖梯度离心或凝胶电泳可将这些片 段群体按大小分开，可得到的分子量大 小约为20kb的随机DNA片段群体。
cDNA分子克隆(cDNA clone) ：将 cDNA片段装在载体上转化细菌,组中分离单拷贝的基因；N
AAAAAAA mRNA
(b)寡聚(dT)引物
第一条 cDNA 的合成
An
An
Tn
(c)发夹引物
第二条 cDNA 的合成
TTTTTTຫໍສະໝຸດ GGGGGGCCCCCC
加接头 1
TTTTTT
GGGGGG
AAAAAA
CCCCCC
(d)同聚物加尾反应 TTTTTT
TTTTTT AAAAAA
连接 DNA 片段和载体
重组载体 DNA 导入 E.coli (体外包装或转化)
基因库的鉴定与段的产生与分离
一.基因组DNA的片段化
1.用限制酶片段化:
用限制酶消化DNA，不经凝胶电泳分部离,直接和载体 连接的克隆方法叫鸟枪法(shot-gan approach)
(2)有的基因表达具有严格的时空性，要获得 其mRNA并非易事。用不同发育阶段，或差A。不能用于基因结构和调节的研 究。一个基因经不同的剪接可产生不同的部 分重叠的cDNA克隆。
高速搅拌：1500转/分×30分 长度8kb的分子群体。
可切 平均
3.双酶消化
单酶消化的产物一般分子较大，选择时要考 虑到载体容量，如噬菌体插入片段不超过 25kb,为此可选用识别4bp的限制酶(切割平 均长度为256bp) ,识别6bp的限制酶切割平 均长度4096 bp.
双酶切产生的DNA片段平均大小不超过1kb, 但如采用双酶部分消化，产物的分子量 可达10～30kb,它们存在着随机序重叠， 用蔗糖梯度离心或凝胶电泳可将这些片 段群体按大小分开，可得到的分子量大 小约为20kb的随机DNA片段群体。
基因组DNA 文库的构建PPT课件
注1：高纯度大分子量基因组DNA (High molecular weight DNA采用包装蛋白进 行包装并侵染宿主。/共17页
λ噬菌体载体；
• 分离有用的目的基因：
• 分离特点的基因片段； • 分析特点基因结构；
• 研究基因表达调控。 • 保存生物的全部基因：
• 全基因组物理图谱的构建； • 全基因组序列测定。
第5页/共17页基因组DNA的特点• 代表性• 中所有克隆所携带的 DNA 片段重新体DNA片段
第12页/共17页
② 载 体 的 制 备
④③
HMW DNA
真核基因组DNA （约3×109bp）
脉
Sau3 A做局部消化
冲 电
被限制酶切开的DNA片段
泳
分的
琼脂糖凝胶电泳
级提
S
S 纯化约20kb片段
分取
离
第13页/共17页
cos L B S
S B R cos T4连接酶
约20kbDN片段 体外包装
①
工
限制性内切酶Sau3A、BamHⅠ；
具
准
琼脂糖凝胶（或蔗糖）；
备
T4连接酶；
注1：Sau3A与BamHⅠ，是一对同尾酶。 注2：同尾酶是指切割不同的DNA片段但产生相同的粘性末端的一类限制性内切酶。
第11页/共17页
BamH Ⅰ位点
cos L
R cos
载体DNA
弃去中间片段
cos L B B R 插入片段的大小和基因组
DNA 大小的比值。
的载体。 • 广泛用于细菌、真菌等基因组##
第1页/共17页基因组DNA与cDNA• cDNA：
• 以mRNA为模板，经反转录酶催化，在体外反 转录成cDNA，与适当的载体连接后转化受体菌， 每个细菌含有一段cD阶看！
λ噬菌体载体；
• 分离有用的目的基因：
• 分离特点的基因片段； • 分析特点基因结构；
• 研究基因表达调控。 • 保存生物的全部基因：
• 全基因组物理图谱的构建； • 全基因组序列测定。
第5页/共17页基因组DNA的特点• 代表性• 中所有克隆所携带的 DNA 片段重新体DNA片段
第12页/共17页
② 载 体 的 制 备
④③
HMW DNA
真核基因组DNA （约3×109bp）
脉
Sau3 A做局部消化
冲 电
被限制酶切开的DNA片段
泳
分的
琼脂糖凝胶电泳
级提
S
S 纯化约20kb片段
分取
离
第13页/共17页
cos L B S
S B R cos T4连接酶
约20kbDN片段 体外包装
①
工
限制性内切酶Sau3A、BamHⅠ；
具
准
琼脂糖凝胶（或蔗糖）；
备
T4连接酶；
注1：Sau3A与BamHⅠ，是一对同尾酶。 注2：同尾酶是指切割不同的DNA片段但产生相同的粘性末端的一类限制性内切酶。
第11页/共17页
BamH Ⅰ位点
cos L
R cos
载体DNA
弃去中间片段
cos L B B R 插入片段的大小和基因组
DNA 大小的比值。
的载体。 • 广泛用于细菌、真菌等基因组##
第1页/共17页基因组DNA与cDNA• cDNA：
• 以mRNA为模板，经反转录酶催化，在体外反 转录成cDNA，与适当的载体连接后转化受体菌， 每个细菌含有一段cD阶看！
cDNA文库的构建和筛选PPT课件
Bait plasmid
AD gene prey gene
prey plasmid
诱饵与靶蛋白之间的 相互作用激活了报告 基因的表达
AD Gal4激活域
Prey (Y)
Bait (X)
BD
Gal4结合域
operator
LacZ
Repotep-
精选PPT课件
特点是：已知蛋 白产物，但对其 核酸序列或氨基 酸序列基本未知
25
C、利用同源基因中的目标基因序列
用不同来源的DNA分子制备成探针进行检测。 如：用来自鼠的基因A去检测人类中基因A 或基因家族中成员A去检测成员B
精选PPT课件
26
D、利用差异表达基因的扣除cDNA探针
表达目标基因
TTTTTTTTTTTTTTT
逆转录polyT引物
C、随机引物
精选PPT课件
15
第一节：将mRN有以下二种种方法：
A、降解mRNA-cDNA杂合链中的RNA， cDNA第一链3’端回折充当引物，形成第 二链
mRNA cDNA
E、洗脱的噬菌体感染宿主细胞后经繁殖扩增， 进行下一轮洗脱
F、经过3轮～5轮的“吸附-洗脱-扩增”后，与 靶分子特异结合的噬菌体得到高度富集。所得 的噬菌体制剂可用来做进一步富集有期望结合 特性的目标噬菌体。
精选PPT课件原理
A、转录激活因子GAL4
基因重组
cDNA
精选官或组织中的 比较多，在中 也有少数的克隆代表稀少mRNAs
如果某个基因有多种拼接方式，在中 也有代表该基因不同拼接方式的克隆。
精选PPT课件
✓ N端：147个氨基酸组成的DNA结合域(DNA binding domain,BD)
基因组文库MicrosoftPowerPoint演示文稿
体 （YAC） • 克 可以用来克隆完整的动物基因。在人类基 因组计划中，YAC被广泛的用 • ⅰ载体DNA的酶切 一般用Sau3AⅠ或MboⅠ限制性核酸内切 酶 • ⅱ载体DNA的纯化 氛-氯仿抽提和酒精沉淀法 蔗糖密度梯膜培养法段的制备 • （1）基因组DNA的提取 • 经典方法是在EDTA和SDS存在下，用蛋白 酶K消化细胞，然后用酚-氯仿混合液抽提 蛋白质，并用透制备 • 关键是将基因组DNA降解成大小适中的随 即片段。 • 方法：机械剪液器抽吸法和超声 波裂解法 • 随机性最高 • 但产生的DNA片段以平头末端为主，其连 接能产生与载体相匹配的黏粒末端的DNA片 段 • 不仅可直接与处理过的载体连接，而且连 接的效率较高。 • 酶切往往具有非随机倾向 • 在限制性核酸内切酶部分消化后，有必要 对产生的基因组DNA片段进行分离，以便 从中含有P)/ln(1-f) • 式中 N——重组子（空斑或菌落）的数量； • P——所要求的概率; • F——某一插入片段与相析研究基因的完整结构 包括基因编码区和各种调控提取高分子量的真核细胞染色体DNA。 3.用琼脂糖凝胶电泳，脉冲场凝胶电泳或 蔗糖密度梯度离心法，分离所需大小片段。 • 4.载体DNA与外源DNA片段的连接反应。 • 5.对于λ和cosmid载体，重组DNA需要进行 体外包装反应，形成噬菌段，仅需筛选几千个重组 子。而对于较大的基因组来说，插入片段 越大，所需筛选的重组子就越少，这就是 人们为什么研究大容量黏粒和Y：由mRNA逆转录的DNA，因组DNA，是一 种生物体全部染色体DNA被随机切割成适 应为模板，经反转录 酶催化，在体外反转录成cDNA，与适当 的载体（常用噬菌体或质粒载体）连接后 转化受体菌，则每个细菌含有一段cDNA， 并能繁殖扩增，这样包含着细胞全部 mRN的载体 两端各有一个黏性末端可以被无关的外源 DNA序列取代。 • 替代型λ噬菌体载体的插入片段的适宜粒）载体 • 真核生物的许多基因含有内含子序列，使 得整个基因长达40kb以远远大于质粒载体 和噬菌体载体的装载量。 Cosmid载体能• 黏粒载体克隆片段的库来说，将包装反应置 于密封的试管内，加入少量氯仿，在四度 冰箱内可较长时间的保存(六个月内低度保 持稳定)，低温冰箱中可建 • 主要是插入片段与经过特定限制性核酸内 切酶处理的载体的连接，从而产生重组 DNA分子的过程。 • 连接效率主要受两种因素影响 ：插入片段 与λ噬菌体DNA两臂的摩尔数比 ；反应受体细胞 • 以噬菌体颗粒的形式将重组DNA分子导入 大肠杆菌细胞中，可大大提高建立基因文 库的效率 • 噬菌体颗粒的体外包装 ：将适当量的包装 抽提物与欲包装的重组DNANA用限制 性内切酶部分酶切后，将酶切片段插入到 载体DNA分子中，所有这些插入了基因组 DNA片段的载体分子的集合体，将包含这 个生物体的整时期析研究基因的完整结构 包括基因编码区和各种调(3*109bp)而言，欲获得 概率为0.99，大小为20kb的插入片段所要 筛选的重组子的数量分别是： • N（大肠杆菌）=ln(1-0.99)/ln[1(2*104/4.6*106)]=1.1*103 • N（人类）=ln(1-0.99)/ln[1(2*104/3*109)]=6.9*105
DNA文库的构建和目的基因ppt课件
含
▪ 从特定组织提取的染色制性 内切酶
……
克隆、转化、培养、鉴定基因 91)基因组 (Genomic library) ：
▪ 是指将某种生物体基因组转录的全部
mRNA经反转录产生的cDNA片段分别与克 隆载体重组，储存于某种受体ntary DNA，互补
DNA)：是由生物的某一特定器官或特定发 育时期细胞内的mRNA经体外反转录后形 成的互补DNA。
因，因此从特定组织中制备的mRNA通常会 富集某些特异序列。所以起始材料的选择 十分重要。
30
1、mRNA的制备: 动物细胞或植物细胞mRNA的制备
2、mRNA的来源: 选用mRNA含量高的组织材料，或通过药物等方
法提高mRNA的含量。 3、mRNA完整性的检测
1)mRNA分子的大小：哺乳动物mRNA长度为5008000bp，大部分mRNA位于1.51
▪ 外源基因：插入到载体内的那个特定
的片段基因。
▪ 目的基因：那些已被或者准备要分离、
改造、扩增或表达的特定基因或DNA片 段。
2
对于高等真核生物而言，基因组DNA 十分庞大,基因可达数万个，且基因组成 结构复杂，除编码序列，还有非编码序 列及调控序列，基因间还存在大量的间 隔序列和重复序列，因此，单个目的基 因在整个基因组中所占的比例极其微小， 除少数例外，绝大多数基因难以直接分 离得到。
15
（二）基因组DNA的不完全酶切 1、根据实验需要选择合适的限制性内切 酶 2、分离目的酶切片段大小的确定
a) 克隆单个基因：< 10 kb b) 克隆基因族：< 20kb 3、DNA不完全酶切条件的确定 a) 确定限制酶用量，改变酶切时间 b) 固定酶切时间，改变限制酶的用量
16
▪ 从特定组织提取的染色制性 内切酶
……
克隆、转化、培养、鉴定基因 91)基因组 (Genomic library) ：
▪ 是指将某种生物体基因组转录的全部
mRNA经反转录产生的cDNA片段分别与克 隆载体重组，储存于某种受体ntary DNA，互补
DNA)：是由生物的某一特定器官或特定发 育时期细胞内的mRNA经体外反转录后形 成的互补DNA。
因，因此从特定组织中制备的mRNA通常会 富集某些特异序列。所以起始材料的选择 十分重要。
30
1、mRNA的制备: 动物细胞或植物细胞mRNA的制备
2、mRNA的来源: 选用mRNA含量高的组织材料，或通过药物等方
法提高mRNA的含量。 3、mRNA完整性的检测
1)mRNA分子的大小：哺乳动物mRNA长度为5008000bp，大部分mRNA位于1.51
▪ 外源基因：插入到载体内的那个特定
的片段基因。
▪ 目的基因：那些已被或者准备要分离、
改造、扩增或表达的特定基因或DNA片 段。
2
对于高等真核生物而言，基因组DNA 十分庞大,基因可达数万个，且基因组成 结构复杂，除编码序列，还有非编码序 列及调控序列，基因间还存在大量的间 隔序列和重复序列，因此，单个目的基 因在整个基因组中所占的比例极其微小， 除少数例外，绝大多数基因难以直接分 离得到。
15
（二）基因组DNA的不完全酶切 1、根据实验需要选择合适的限制性内切 酶 2、分离目的酶切片段大小的确定
a) 克隆单个基因：< 10 kb b) 克隆基因族：< 20kb 3、DNA不完全酶切条件的确定 a) 确定限制酶用量，改变酶切时间 b) 固定酶切时间，改变限制酶的用量
16
基因组文库构建ppt课件
最新版整理ppt
13
(a) 随 机 六 碱 基 NNNNNN
AAAAAAA mRNA
(b)寡 聚 (dT)引 物
第 一 条 cDNA 的 合 成
An
An
Tn
(c)发 夹 引 物
第 二 条 cDNA 的 合 成
TTTTTT
GGGGGG
CCCCCC
加接头 1
TTTTTT
GGGGGG
AAAAAA
CCCCCC
3’ AAAAAAn 加 锚 定 引 物 (寡 聚 T)
3’ RT 酶
3’ AAAAAn 5’ TTTT
用 NaOH 降 解 mRNA 用 K len o w 酶 合 成 第 二 链
末端转移酶 dGTP
GGG GGG
CCC 连接
SI 酶 降 解 发 夹 结 构
末端转移酶加寡聚 C CCC
转 化 E .co li 扩增
PAC(P1 人工染色体) 细菌噬菌体 P1
100～300kb 稳定，但在细菌外难以维
BAC(细菌人工染色体) F 质粒
300kb
持
MACs(哺乳类人工染色 基于 Epstein-Barr 病 >300kb
体)
毒的游离载体
人类人工游离染色体(human artificial episomal chromosome,HAEC)是一类发展 中的 MACs,它来自于 Epstein-Barr 病毒
最新克隆中仅极少数含目的基因，且 大多数基因的产物不具有可选择的表型特征， 因此可采用以下策略来进行筛选：
(1)用特异探针进行分子杂交；
(2)用免疫和生化方法来检测基因产物；
(3)用特异性引物进行PCR扩增。
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粒DNA，电泳测定插高，质量越高，可大大减轻后续
筛选基因工作量。
精心整适合一些低 等真核生物和原核生物。
精 左右臂DNA片段的获得
2. 器官特性
不同器官或组织的功能不一样，因而有的结构基因的 表达就具有器官特异性，故由谢或发育特异性
处于不同代谢阶段（或发育阶段）的结构基因表达 亦不相同
4. 不均匀性在同一个cDNA中，不同类型的cDNA分子的数 目是大不相同的，尽管它们载体构建基因组1. 两臂DNA片段的制备:
pYAC4 BamHI/EcoRI 脱磷酸化
2. 供体DNA片段的制备:
琼脂糖凝胶-DNA样品的制备 EcoRI部分酶切 凝胶电泳 片段回收和纯化
3. DNA的连接 4. 重组DAN分子的转化: 原生质体转化法 5. 转化子的保存: 单菌落保存于96孔平板中
脉冲场
精心整理
酵 母 人 工 染 色 体 构 建
精心整理第二节cDNA的建立精心整理定义：从一定生长阶段或条件的某种细胞分离到的全部
mRNA经反转录成 cDNA后再重组和增殖所产生的来自结构基因，因此仅代表某种生物的一小部分遗 传信息，且只代表那些正在表达的基因的遗传信息： 1—5% mRNA，80—85% rRNA，10—1整理第一节基因组的构建精心整理定义：
含有某种生物全部遗传信息的重组D（1-f）
2) 重组DNA分子的包装与感染
与λ重组子包装相似, 然后感染E.coli NS3529 = E.coliK12 recA
mcrA Δ(hsdR hsdM mcrB mcrC mrr)(λimm434 nin5X1-cre) (λimmλLP1), 每微克DNA可在精K心a整n理r平板上4 X 105 - 2 备
DNA分离纯化 限制酶切 脱磷酸化反应
2． 供体DNA片段的制备
总DNA分离纯化 机械剪切法 分离特定大小DNA片段
酶法
部分酶切
分离特定大小DNA片段
完全酶切
精心整理
3. 供体与载体DNA连接4. 采用快速构建法以避免扩增时DNA丢失
精心整理
COS
利 用 单
质 粒 载 体 文 库
精心整理
COS
利 构用 建双 基 因 组质 文粒 库载
体
精心似:
1. 两臂DNA片段的制备: pAD10sacB BamHI/ScaI 2. 供体DNA片段的制备: 部分酶切 蔗糖梯度离心 3. 两DNA的连接和重组DAN分子的包装
E.coli BHB2690(N205 recA[λimm434 cItsb2 red Dam Sam/λ])-
头部蛋白
精心整理
精心整理
i. 两菌株分别培养，分别收集和制备，包装前混合---本底低（对λDNA分子大小有严格限制），高效。
ii. 两菌株分别培养，混合收集和制备----操作简单， 本底高，可包装不同大小的λDNA分子。
2. 供体DNA片段的制备:限制酶部分酶切，机械剪切法
3. 重组DNA分子的形成：
控制克分子比率，使其形成串状DNA分子
4. 重组DNA分子的包装
1） λDNA的包装物的制备
使用的大肠杆菌菌株：
E.coli BHB2688(N205 recA[λimm434 cItsb2 red Eam Sam/λ])包装蛋白
1) 包装物制备用菌株:
E.coli NS3208[=MC1061, supo recD1014 hsdR- hsdM+ mcrA- mcrB(P1 r-m- cm-2 c1.100 am10.1)] : 制备pacase E.coli NS3210[=MC1061, supo recD1014 hsdR- hsdM+ mcrA- mcrB(P1 r-m- cm c1.100 am131)] : 制备头部蛋白
2） 重组λDNA分子的包装过程 包装制备物（-70℃）于冰上缓慢融化 加入重组 λDNA分子 边融化边混合边包装 离心除去 细胞碎片 λ颗li 培养 分离λ颗粒 -70℃保存
精心整理
五. 利用COS质粒载体构建基因组构建过程与λ载体构建过程相似: 两臂DNA片段的制备， 供体DNA片段的制备，两DNA的连接和重组DAN分子的包 装。单C体系中的总DNA浓
度和两种DNA分子的克分子比率。
4. 重组DNA分子的转移和基因组的扩增利用转化或感染方法将连接DNA分子导入宿主细胞，
让其自主复制，重组DNA分子被扩增（重组子比率可机挑取产生不同末端以避免其自身形成串状体 2. 供体DNA脱磷酸化以避免供体DNA间的连接导致重排 3. 载体和供体DNA末端修饰以避免上述两种情形发生
载体DNA XhoI or SalI酶切 补CT 连接 重组DNA 供体DNA Sau3AI部分酶切 补AG