基因文库的构建与筛选

第八章 DNA文库的构建和目的基因的筛选第一节 概述基因工程主要是通过人工的方法分离、改造、扩增并表达生物的特定基因，从而深入开展核酸遗传研究或者获取有价值的基因产物。

通常将那些已被或者准备要被分离、改造、扩增或表达的特定基因或DNA片段，称为目的基因。

因目的基因片段需插入载体，导入宿主细胞内复制，所以对宿主细胞DNA而言，又称它为外源性基因。

目的基因主要是编码蛋白质(酶)的结构基因，诸如抗逆性相关基因、生物药和保健品相关基因、毒物降解相关基因以及工业用酶相关基因等。

随着生物长期的进化，生物界积累了大量对人类有用的基因。

它是大自然恩赐于人类的宝贵资源，等待人们去开发利用。

目的基因用途很广，主要有以下几个方面：①研究该基因的全貌与内涵，如详细分析其结构、功能及调控。

②与正常基因对比，寻找异常基因的异常点，进而探索疾病发生的分子生物学机理及治疗对策。

③研究生物种系进化与相关同源性。

④应用某种基因大量表达，生产所需要的蛋白质或多肽（如胰岛素、干扰素等药物）。

⑤在农、林、牧、副、渔业中，改造某些目的基因，以改良品种，促进经济发展。

⑥建立基因疗法院，选用某种正常基因,引入患者体内，对某些先天性遗传疾病进行治疗。

根据研究对象的研究目的不同，目的基因可来自原核细胞或真核细胞。

原核生物基因组较简单，较易获得目的基因。

哺乳动物真核细胞基因组庞大复杂，可根据不同的要求选择适宜方法，从中获得目的基因。

要从数以万计的核苷酸序列中挑选出非常小的所感兴趣的目的基因，是基因工程中的第一个难题。

欲想获得某个目的基因，必须对其有所了解，然后根据目的基因的性质制定分离的方案。

目的基因的制备是基因工程研究和应用的关键内容之一。

根据实验需要，待分离的目的基因可能是一个完整的有功能的基因，除了编码区，还包含转录启动区和终止区序列，或者是一个完全的操纵子或基因簇，也可能是只具有编码序列的基因区，甚至是只含启动子或终止子等部件的DNA片段。

随机突变文库构建与筛选研究进展随机突变文库的构建是通过对目标基因或蛋白质进行随机突变，从而产生一个具有广泛多样性的突变体文库。

该文库可用于进一步筛选和研究目标基因或蛋白质的功能和特性。

化学诱变法：通过化学诱变剂处理DNA，使其发生随机突变。

转座子法：利用转座子在基因组中插入、删除或替换序列，从而产生随机突变。

同源重组法：利用同源重组原理，将外源基因随机插入细胞基因组中，从而产生随机突变。

高通量测序法：通过对大量基因组进行测序，发现基因中的随机突变，从而构建突变文库。

筛选是通过对随机突变文库中的突变体进行筛选，找出影响目标基因或蛋白质功能的关键突变体，从而研究其功能和特性。

含量测定法：通过检测突变体中目标蛋白质的含量，筛选出具有高表达量的突变体。

活细胞筛选法：通过对细胞生长、存活和代谢等指标进行检测，筛选出具有特定生物学表型的突变体。

测序法：通过对突变体进行测序，找出影响目标基因或蛋白质功能的关键突变序列。

功能筛选法：根据实验设计要求，通过特定筛选方法检测突变体的生物学功能，从而确定影响目标基因或蛋白质功能的关键突变体。

例如，利用双荧光杂交实验检测细胞因子的活性、利用表型筛选法检测抗药性突变等。

近年来，随着分子生物学和基因组学的快速发展，随机突变文库的构建和筛选已成为研究基因和蛋白质功能的重要工具。

尤其是以高通量测序技术为代表的技术手段，使得研究人员能够在短时间内对大量基因组进行测序和分析，快速发现基因中的随机突变。

新的筛选方法和技术也不断涌现，为随机突变文库的筛选提供了更多选择和可能性。

随机突变文库的构建和筛选是研究基因和蛋白质功能的重要工具。

随着技术的不断更新和发展，该领域的研究也将不断取得新的进展。

未来，随着更多技术和方法的涌现，相信研究人员将能够更加深入地了解基因和蛋白质的功能和特性，为解决人类面临的生物学问题提供更多思路和方法。

金黄色葡萄球菌是一种常见的病原菌，具有较强的抗药性和适应能力。

cdna基因文库构建的基本路线CDNA基因文库构建是一种常用的分子生物学技术，用于研究基因表达和功能的调查。

本文将介绍CDNA基因文库构建的基本路线，包括材料准备、RNA提取、反转录、合成cDNA、构建文库和筛选等步骤。

一、材料准备进行CDNA基因文库构建之前，需要准备一些实验材料和试剂。

主要包括：1. 细胞或组织样品：可以是人类、动物或植物的细胞或组织样品。

2. 细胞破碎液：用于细胞破碎和RNA保护，常用的有三种类型：TRIzol、RNeasy Mini Kit和RNAiso Plus。

3. 反转录试剂盒：包括反转录酶、随机引物、dNTPs等。

4. 克隆载体：用于构建基因文库的载体，常用的有质粒载体和噬菌体载体。

5. 细菌培养基和抗生素：用于细菌的培养和筛选。

二、RNA提取RNA提取是构建CDNA基因文库的第一步，目的是从细胞或组织样品中提取总RNA。

常用的提取方法有酚/氯仿法、硅胶膜法和磁珠法等。

提取的RNA应具有较高的纯度和完整性，以保证后续的反转录和文库构建质量。

三、反转录反转录是将提取的RNA转录成cDNA的过程。

在这一步中，需要将RNA模板与反转录酶、随机引物、dNTPs等反转录试剂一起反应，合成cDNA。

反转录的条件包括温度、时间和反应体系等，需要根据试剂盒的说明进行操作。

四、合成cDNA合成cDNA是将反转录得到的第一链cDNA转录成双链cDNA的过程。

一般采用PCR扩增的方法，在反应中加入适量的引物和dNTPs，进行多轮扩增，最终得到足够量的双链cDNA。

合成cDNA的条件包括PCR扩增的循环数、温度和时间等。

五、构建文库构建基因文库是将合成的cDNA插入到克隆载体中的过程。

常用的构建方法有限制性内切酶法、T/A克隆法和引物扩增法等。

在构建文库的过程中，需要将双链cDNA与克隆载体进行连接，形成重组DNA。

连接后的重组DNA可以通过转化到适当的宿主细胞中，得到大量的重组质粒。

六、筛选构建完基因文库后，需要进行筛选以获得感兴趣的基因。

基因文库的构建与使用在生物科学领域，基因文库的构建和使用是研究基因功能和生物多样性的重要工具。

基因文库是指包含某种生物全部基因的克隆文库，它可以为我们提供深入了解该生物基因组的信息。

本文将详细介绍基因文库的构建与使用，包括基因文库的基本概念、构建方法、使用方法以及优势和展望。

一、基因文库的基本概念和作用基因文库是包含某种生物全部基因的克隆文库，它为我们提供了该生物基因组的全面信息。

构建基因文库的目的是为了方便研究者们筛选、分析和研究基因的功能以及多样性。

基因文库可以用于寻找基因的新颖功能、发现新的药物靶点以及为基因组编辑和改造提供资源。

二、构建基因文库的方法构建基因文库主要包括以下步骤：1、基因组文库的构建：首先需要获得该生物的基因组，然后将基因组进行分解，形成一系列重叠的DNA片段。

这些片段经过纯化、扩增和克隆到特定的载体中，形成基因组文库。

2、表达文库的构建：为了筛选出具有特定功能的基因，还需要构建表达文库。

表达文库中的基因需要在特定的细胞或组织中表达，以便研究者们能够确定基因的功能。

在构建基因文库时，需要考虑到基因的种类、基因表达水平以及克隆载体的选择等因素。

这些因素都会影响到基因文库的质量和实用性。

三、基因文库的使用方法使用基因文库可以方便地筛选和研究基因的功能。

以下是如何使用基因文库的一般步骤：1、选择相应的基因文库：首先需要选择包含所需基因的文库。

如果研究目标是寻找特定功能的基因，可以选择包含该功能基因的文库。

2、筛选候选基因：根据研究目标，可以在文库中进行筛查，挑选出可能具有所需功能的候选基因。

3、验证基因功能：通过实验验证挑选出的候选基因是否具有所需功能。

这可以通过表达和检测候选基因在细胞或整体生物中的功能来实现。

4、利用基因文库进行基因组编辑：基因文库也可以为基因组编辑提供资源和指导。

通过比对和分析基因文库中的序列，可以确定目标基因的精确位置和剪切位点，从而实现精准的基因组编辑。

基因组文库的构建和池化筛选综述与专论?生物技术通报BloTECHNoLoGYBULLETIN201O年第5期基因组文库的构建和池化筛选陈献伟娜日苏朱超.王会'雷娜,高剑峰关伟军马月辉(中国农业科学院北京畜牧兽医研究所,北京100193;2石河子大学生命科学学院,石河子832003;广西大学动物科学技术学院,南宁530004;山西农业大学,太谷030801)摘要:作为物种保护策略的重要部分,建立濒危畜禽的基因组文库,可有效保存濒危畜禽种质资源.BAC(bacterialartificialchromosome)文库具有高容量,遗传特性稳定和嵌合体少等优点,因而被用于畜禽基因组文库的构建.对BAC文库的构建方法和文库池化筛选系统作一综述.关键词:BAC栽体基因组文库池化筛选ConstructionandScreeningofGenomicLibrary ChenXianweitNaRisuZhuChaofWangHuifLeiNa?GaoJianfengGuanWeijunMaYuehui ('InstituteofBeijingAnimalScienceandV eterinary,CAAS,Beijing100193;CollegeofLife Science,ShiheziUniversity,Shihezi832003; CollegeofAnimalScienceandTechnology,GuangxiUniversity,Nanning530004;ShanxiA griculturalUniversity,raigu030801)Abstract:ConstructionofthegenomicLibraryofdomesticanimalasthebasiccompone ntofs peciesconservationstrategycan preserveendangeredanimalgermplasmresourcesefficiently.Beingcapableofinsertinglarg efragments,maintainingthestabilityofin—sertedDNAinE.coli,producingfewchimerismes,BAClibraryhavebeencontributedtorese archesofconstructionofgenomiclibrary. ThispaperdescribedtheconstructionmethodandscreeningsystemofBAClibrary. Keywords:BACvectorsGenomiclibraryPoolingScreening高分子量的DNA文库是基因组研究的基础,如重要经济性状基因的图位克隆,比较基因组研究,基因组测序及物理图谱的构建.BAC载体具有容量大,遗传特性稳定和嵌合体少等优点,非常适合于基因组文库的构建.1BAC文库的研究进展基因组文库是利用DNA重组技术将某种生物细胞的核DNA的全部或大部分片段随机地连接到克隆载体上,之后转移到适当的宿主细胞中,通过细胞增殖而形成的各个片段的无性繁殖系的总集.基因组文库构建的关键取决于所使用的克隆载体.自Cohen等构建第一个质粒载体pSC101以来,相继出现了大量的克隆载体.克隆载体大致可分为噬菌体系列和人工染色体系列.前者主要包括质粒(plasmid),噬菌体(bacteriophage),柯斯质粒(cosmid,又称粘粒)等,其主要特点是载体在宿主细胞内能稳定遗传,易分离,转化效率高,但克隆容量有限,一般小于45kb.许多真核生物的基因庞大而复杂,难以克隆到这些载体中.后者主要有酵母人工染色体(yeastartificialchromosome,YAC),细菌人工染色体(bacterialartificialchromosome,BAC)以及可转化人工染色体(TransformationArtificialChromo—some,TAC)和哺乳动物人工染色体(mammalianarti—ficialchromosome,MAC)等,显着特点是载体的容载收稿日期:2009—12-29基金项目:国家科技支撑项目(2006BAD13BOB,2008BADB2B01),转基因重大专项(2008ZX08009-003),国家"863"计划项目(2006AA10Z1982007AA10Z170)作者简介:陈献伟,男,硕士,主要从事分子生物学研究工作;E.mail:****************通讯作者:关伟军,男,教授,博士生导师,主要从事动物细胞分子生物学方面研究工作;E—mail:********************.cn马月辉,男,研究员,博士生导师,主要从事动物遗传资源保护方面研究工作;E—mail:yuehui—**********12生物技术通报BiotechnologyBulletin2010年第5期能力大,约100—350kb.这些具有较大外源片段承受能力的人工染色体对于真核生物基因组文库的构建极为有利.近年来得到广泛应用的克隆载体主要是细菌人工染色体(BAC).细菌人工染色体是在大肠杆菌F一因子基础上发展而来的.F.因子的复制是严谨型的,在每个细胞中仅有1—2个拷贝,这样就减少了质粒所携带的外源片段发生重组的可能性,而且F.因子能携带的外源片段可达1mb,表明F一因子更适合于克隆大片段的DNA.BAC克隆体系的第一代载体pBAC108L(图1).pBAC108L能克隆的外源片段可达300kb,但它存在的一个问题是只有10%一50%的转化子是重组子.自从BAC载体问世以来,出现了许多目的在于增加易用性和用于特定系统和环境的修饰.pBeloBAC11和pBACe3.6是对pBAC108L进行修饰构建的载体,通常作为进一步修饰的基础载体(图2).pBeloBAC11代表了第二代的BAC克隆系统,也是应用非常广泛的一种BAC载体.其外源DNA片段的容量最大可至300kb以上,可应用于基因组文库的构建工作.主要特点是在pBAC108L的多克隆位点上增加了LacZ基因,可用于蓝白斑筛选.然而pBeloBAC11仍是低拷贝质粒.T7—?'_SP6SalINotIBHNotI卜口_[卜卜—)—EcoRV图1pBAC108L载体H/ndmBamHIrepE图2pBeloBACll载体Frengen等构建了pBACe3.6载体(图3).pBACe3.6是在pBAC108L的基础上构建的,但比pBeloBAC11修饰程度高.此外,它利用了不同于pBeloBAC11蓝白斑选择的另一选择机制,其多克隆位点位于蔗糖致死基因sacB上,这样重组克隆可以在含有蔗糖的培养基上进行阳性选择.OCM(R)mHIfl1lCIIf811c0RInO,SacIf2O)胁II(221PUC—LINKLI(766)LI(2012)ApaLI(2509)南R322NotI(2850)图3pBACe3.6载体1997年,Hamilton等"结合根癌农杆菌双元载体和BAC载体的特点,构建了一种"双元BAC载体(abinaryBAC)",即BIBAC.BIBAC作为第三代文库载体,不仅具有第二代载体的特征,而且有植物2010年第5期陈献伟等:基因组文库的构建和池化筛选转化的功能.BIBAC转化技术在双子叶植物中已经建立,Hamilton等'通过农杆菌介导的方法把克隆在BIBAC2中的完整的150kb大小的人类DNA片段转进了番茄和烟草.TAC(transforma.petentartificialchromosome)也是一种直接用于转化的人工载体.1999年,Liu等结合PAC载体和双元载体的特点,构建了植物可转化基因人工染色体TAC载体Pyltae7和Pyhac17.TAC载体能在大肠杆菌和根癌农杆菌中以单拷贝形式复制.目前,已有人和一些哺乳动物的基因组DNABAC文库建成,如猪",牛,大熊猫"和鲶鱼H等动物.通过BAC文库的构建,不仅长久而有效地保存动物基因遗传资源,而且,为进一步研究,开发和利用其与重要经济性状,生殖和遗传性疾病相关的功能基因,提供可靠的基因材料平台.2BAC文库的构建方法基因组DNA文库的构建流程相对简单,但其需要很多特殊的处理以及必要的仪器设备,成功的关键都体现在操作的细节上.BAC文库的构建过程包括以下几个步骤.2.1BAC载体的制备载体制备的好坏,直接关系到文库中空白载体的比例和文库的质量,载体的纯度越高,获得阳性克隆的概率越高,文库的质量也越好.采取酶切的同时进行彻底的脱磷处理,以减少或避免空白载体的比例,保证其符合建库要求.载体的制备主要包括BAC载体的大量提取和纯化,CsCL.EtBr密度梯度离心纯化得到的超螺旋质粒,BAC载体的后期处理(酶切和去磷酸化),载体脱磷效果检测,载体自连回收.2.2高分子量(HMW)DNA的制备由于构建BAC文库需要得到尽可能完整的大片段DNA,因此,首先要保证将细胞核包埋在琼脂糖凝胶块中的质量,即细胞核的质量和浓度,琼脂糖凝胶的浓度等.而且如果是组织样品,一般使用液氮将组织捣碎,并在整个研磨过程中使组织浸泡在液氮中,然后包埋在低熔点琼脂糖中形成"Plugs",以此来保护核DNA免受降解.2.3高分子量DNA的不完全消化高分子量DNA的不完全消化的目的使通过限制性内切酶的不完全消化,产生大量比较适合和集中的片段,一般通过脉冲场凝胶电泳进行两次片段选择'.DNA的分离一般有一次尺度选择和二次尺度选择(尺度选择即脉冲电泳),在脉冲场电泳条件下,由于不同分子量的DNA片段发生"共迁移",在大片段中混有很多小片段DNA,而这些小片段DNA 在连接过程中效率要明显高于大片段DNA,从而影响基因组文库的构建质量.二次尺度选择法得到的DNA连接转化效率较高,转化后插入的片段整齐度好,空载率低.为了获得纯度高,含量多的大片段,减少大片段的降解,同时又尽可能的去除小片段,采用二次尺度法进行大片段DNA的分离,按照部分酶切所确定的最佳酶用量,对基因组Plugs进行大量酶切,然后进行脉冲场电泳.2.4大片段DNA和载体的连接大片段DNA能否有效地连接到载体上,主要取决于插入片段与载体的比例,对于不同的生物采用的比例不同,大部分处于1:5—15(摩尔比)范围.2.5将连接产物转化入受体细胞对于转化大肠杆菌而言,电转化是目前使用最普遍的一种方法.研究表明,文库中载体的平均插入大小主要与转化效率相关.插入片度越大,转化效率越低;反之,越高.此外,转化条件也直接影响转化效率,插入片段大小及假阳性克隆的含量.2.6挑选阳性克隆,构建文库阳性克隆的分检有人工和使用机器手技术两种.一般通过lacZ的插入失活,显示蓝白斑的负同选择来筛选重组子,但是在基因组文库构建中常常发现有1%一10%左右的假阳性,用机器人操作时假阳性更高.现在又产生了正向选择的BAC载体pBACe3.6,pBAC/SACB¨,利用sacB的插入失活,产生的零背景可使机器人进行挑选重组子时不必进行菌落间的分辨,便于自动挑取收集.2.7文库的保存管理与质量检测文库构建完成后,还需要对文库进行评价,其质量的高低标准包括文库中克隆的数量,平均插入片l4生物技术通报BiotechnologyBulletin2010年第5期段的大小,克隆的稳定性,细胞器DNA的含量以及假阳性克隆的含量等.3BAC文库的池化和筛选基因组BAC文库有数万到数十万个克隆组成,因此建立高效的管理和筛选系统是必要的.筛选系统有PCR筛选系统和Southern杂交筛选系统两种.3.1PCR筛选系统建立PCR筛选系统需要对所有的克隆进行保存和池化.整个BAC文库由若干个超级池组成,每个超级池有10个384孔板组成.将一个超级池的行克隆,列克隆和每板的克隆分别合并成池,提取质粒DNA作为第二步PCR筛选的模板,同时将10个板的克隆合并提取DNA,即有了第一步筛选超级池的DNA.对BAC文库进行两步.3D筛选的过程:首先,用目的序列的PCR引物筛选文库的若干个超级池的DNA,得到阳性超级池号;之后用阳性超级池的板池,行池,列池的DNA进行第二步筛选,得到阳性的板池号,行池号,列池号;从冻存的文库中依照筛选结果得出的克隆地址,挑出阳性克隆,再次做PCR验证.Bonet等¨构建了野草莓的BAC文库,共有18432个克隆,存于48块384孔板中,压缩到48个96孔板中.他将每6块96孔板的克隆混在一起,共形成8个超级池.用70个分子标记进行PCR分析,以超级池质粒为模板通过PCR的方法确定含有目的片段的阳性单克隆.Wang等.构建了尖吻鲈的BAC文库,49152个克隆保存在128块384孔板中,由11个超级池构成,每个超级池分成48个96 孔板,对文库进行超级池,板池和行列池3步法筛选,用24个微卫星和15个EST对文库进行PCR筛选表明文库具有较好的基因组覆盖率.3.2HD杂交膜筛选系统一般材料BAC文库库容量都是数以万计,若同时对这些数目庞大的BAC进行分析,非常困难.常规BAC文库的研究一般都是以尼龙膜为载体,用机械手将整个文库顺序点到膜上.将膜在固体培养基上培养一段时间后进行菌落原位裂解,将DNA结合在膜上,再用特异性探针进行Southern杂交筛选阳性克隆.每张膜可容纳50000以上的克隆.一个库用6—7张膜就可以包括.杂交膜筛选缺点是Southern杂交要用到同位素,存在假阳性和污染,放射性元素对人和环境都会产生影响,成本也高.对于功能基因克隆的筛选,用PCR筛选系统得到的结果比从高密度杂交膜筛选系统得到的结果更为可靠,假阳性少,而且方法简单,快速.但是对于构建大区域的物理重叠群,高密度膜杂交筛选阳性克隆可以一次得到一个标记的所有重叠克隆,更有利于快速的构建BAC重叠群.4展望细菌人工染色体(BAC)具有容量大,易于分离和操作等特性,比其它载体系统构建的基因组文库有更高的覆盖率和稳定性.利用BAC文库容量大的特点,进行基因筛选,目的基因定位,表达调控等研究是BAC文库利用的发展方向.BAC文库将在动物基因资源保存,基因组学,后基因组学等研究中发挥重要的作用.参考文献[1]QuiniouSM,WaldbieserGC,DukeMV,eta1.Afirstgeneration BACbasedphysicalmapofthechannelcatfishgenome.JBMCGe? 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基因组文库的构建和应用研究进展
近几年，随着基因组学的发展，基因组文库的构建和应用也受到了广
泛的关注。

为了提高基因组研究的精准度，开发一个能够有效收集和保存
基因序列及其相关信息的"基因组文库"变得非常重要。

基因组文库构建的三个主要步骤是：(1)基因组DNA提取：提取植物、微生物、动物等生物样本中的基因组DNA；(2)DNA测序：对提取的基因组
进行高通量测序，以获得基因组的结构序列；(3)基因组比对：根据基因
组序列，进行其他基因组或蛋白质序列数据库的比对，以确定基因的位置
及功能。

基因组文库的应用主要是对基因组的实验研究，其常用的方法有：(1)基因表达研究：利用芯片、qPCR或其他方法，检测基因组中基因表达水
平的变化；(2)基因复制研究：利用基因组文库中保存的基因序列，进行
合成基因的复制；(3)基因突变分析：对基因组中基因结构的变化进行研究，确定其影响；(4)结构基因组学：根据基因组文库中的基因组序列，
可以研究基因组结构的改变和功能网络的构建。

此外，基因组文库还可以应用于其他领域，比如药物开发，因组文库
进行药物靶点的发现和研究；农业快速检测。