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血吸附法检测新生牛血清病毒1原理有些病毒在其敏感宿主细胞中增殖，并不引起细胞病变，但在细胞表层存在病毒蛋白质，用一定百分比的红细胞悬液覆盖细胞表面，置于不同温度条件下一定时间，显微镜下观察，即可出现红细胞被吸附的现象。
血吸附法的技术主要特点是:敏感性高、速度快、成本低。
主要缺点是:病毒特异性检查问题尚未解决，结果判定的客观性较差，是间接检查病毒存在的方法，技术程序也还比较陈旧。
该方法首先使用无病毒血清对实验用Vero细胞进行培养增值，然后分别制备阴性供试品、阳性供试品以及待测试供试品。
取两瓶细胞，分别加入供试品。
然后在适宜的条件下处理，然后观察实验结果。
2材料和方法2.1材料2.1.1病毒牛副流感病毒。
2.1.2细胞Vero细胞(非洲绿猴肾细胞系)：购自中国生物制品检定所；2.1.3试剂无病毒污染的新生牛血清：阴性对照品使用；MEM培养基：细胞基础培养基；0.85%生理盐水：洗脱血细胞；胰蛋白酶：消化细胞；鸡血；豚鼠血。
2.1.4仪器设备①专门的病毒实验室：生物安全柜(CBK一DZOI)操作，符合国家生物安全要求；②洁净工作台；③倒置显微镜；④冰箱；⑤离心机；⑥离心瓶、注射器、吸管。
2.1.5阳性病毒将牛副流感病毒在Vero细胞上连续传代至病毒滴度为5.0lgCCID50/ml以上时进行合并，分为若干批，零下70℃冻存，作为阳性病毒对照液。
2.2方法2.2.1细胞制备以细胞密度为2~3×105/mL的Vero细胞，接种到适宜的细胞培养瓶后置于37℃培养箱培养，每天镜下观察细胞的分裂增殖情况，并记录形成良好单层的时间(镜下观察细胞生长成片率达90%以上为良好单层)。
注意将制备的细胞及时进行编号和标注，以免造成混淆。
2.2.2红细胞悬液配制取体重300一500g豚鼠，心脏采血2一3mL放入内含3一5mL生理盐水的离心管中，盖栓、轻摇。
豚鼠血加入生理盐水洗三次，800一1000转/分钟离心10一15分钟，压积血球，备用。
畜禽免疫抗体监测血样采集与血清分离保存技术畜禽血样的采取是动物免疫抗体监测和疫病监测工作中的重要内容。
在畜禽血样的采取过程中，其做好采前准备、采血方法、采集时机、血样运送、保存和处理等环节，都直接关系到免疫抗体检测结果的准确性及可靠性，笔者通过多年的实际操作，积累了一定的方法和经验，供同行参考。
1采血前的准备采血前应穿好工作服，备好保定器械，v形管、v形管架，一次性注射器(采血针)、记号笔、酒精棉球、干棉球、相关表格等。
16号针头、9号和7号头皮针若干，镊子、剪刀、酒精(75％)、药棉若干、保定棍和绳2副、一次性5ml真空管若干。
2血样的采集根据畜禽种类、所需血样或血清的数量确定采血部位、器械及采血量。
禽类采翅静脉、猪采前腔静脉或耳静脉、牛采颈静脉或耳静脉、羊采颈静脉：禽类用5ml一次性医用注射器，猪、牛、羊用10～20ml 一次性医用注射器：禽类采血量不少于2ml，猪、牛、羊不少于5ml。
2．1猪血样采集2．1．1猪的保定 (1)徒手保定法：适用于中、小猪，可根据具体情况采用正提、倒提或横卧方法保定。
保定人抓住猪的双耳向上提起，两腿夹住猪背。
也可用双手抓住猪的两后肢，向上倒提后，两腿夹住其肩胸部。
保定中猪时，保定者应背靠圈栏增加稳定性。
横卧保定由一人或二人操作。
保定者从背侧将猪后肢及前肢或耳抓住后，用力提起横卧放倒，并紧压其头部及后躯。
(2)器械保定法：适用于成年公猪、母猪或野性较强的猪。
一种为鼻绳保定，即用直径1cm、长3～4m的一根绳子，一端结成直径为20cm的活套，将其套于猪的上颌犬齿后方后，收紧环套，另一端拉紧或缠绕于栏杆上。
另一种为鼻捻棒保定，即用1m长木棒，一端栓一直径20cm的绳套，同上法套用于猪上颌犬齿后方后，捻转收紧绳套将猪保定。
2．1．2采血猪血样采集耳静脉或前腔静脉，猪的采血最好是空腹，在早上或午后进行。
采血场所有充足的光线；室温夏季最好在25～2 8℃，冬季15～20℃为宜。
活性炭对小牛血清去蛋白提取液中多肽的吸附作用（作者:___________单位: ___________邮编: ___________）【摘要】目的研究活性炭对小牛血清去蛋白提取液中多肽的吸附作用。
方法将活性炭加入小牛血清去蛋白提取液中，过滤后检测蛋白含量及吸光度值,呼吸活性及氨基酸的含量。
结果与无活性炭对照比较，加入活性炭后小牛血清去蛋白提取液吸光度值、多肽含量均明显下降;呼吸活性及氨基酸含量没有明显变化。
结论活性炭对小牛血清去蛋白提取液中多肽有吸附作用。
【关键词】活性炭;小牛血清去蛋白提取液;多肽The Absorption Effect of Active Carbon on the Polypeptide in Calf Serum Abstract Protein-freeLI Xin,WANG Tie (Liaoning Ahon Pharmaceuticals Corporation Limited,Jinzhou 121000 China)Abstract：Objective To study the effects of active carbon on the polypeptide in calf serum abstract protein-free. Methods Put active carbon into calf serum abstract protein-free; and determine protein content, absorbance, amino acid content and breath nature afterfiltration.Result Compared with the group without active carbon, absorbance and protein content decreased ,while breath nature and amino acid content did not decrease.Conclusions Polypeptide was absorbed by active carbonKey words：active carbon; calf serum abstract protein-free; polypeptide活性炭是一种多孔径的炭化物，有极丰富的孔隙构造，具有良好的吸附特性，它的吸附作用藉物理及化学的吸咐力而成的,其外观色泽呈黑色。
生物制品生产和检验用新生牛血清质量标准用于生物制品生产的牛血清应为从出生14小时内未进食初乳的新生小牛采血分离血清，经除菌过滤制成。
主要用于细胞培养。
【性状】为淡黄色澄清稍黏稠的液体，无溶血或异物。
【无菌检验】按附录页进行检验，应无菌生长。
【支原体检验】按附录页进行检验，应无支原体生长。
【外源病毒检验】将被检血清按10%浓度加入MEM培养基中，接种48孔细胞培养板培养的VERO、BHK21、PK15、牛睾丸细胞单层，每种细胞接种8孔，同时设立牛病毒性腹泻／粘膜病病毒（BVDV）对照各2孔，37℃培养5日，观察细胞病变，细胞均不得出现细胞病变。
培养至第5日时，对每种细胞的2孔及病毒对照孔，用PBS洗涤3次，每孔加入80%丙酮0.5ml，4℃以下固定30分钟，弃丙酮后自然干燥，每孔加入BVDV荧光抗体染色0.3ml，室温染色30分钟，弃荧光抗体并用PBS洗涤3次，荧光显微镜观察，被检血清孔不得出现荧光染色。
剩余的6个细胞孔,前3孔，每孔加入0.2%豚鼠、人O型、鸡红细胞等量混合液0.3 ml，2～8℃作用30分钟，另3孔同样加入红细胞后室温作用30分钟。
倒置显微镜观察，均不得出现红细胞吸附现象。
【特异性抗体测定】生产企业应根据血清的使用对象确定测定的抗体种类，测定方法采用中和抗体测定法，如有适用的的ELISA方法，也可采用。
如用于生产口蹄疫疫苗的血清不得含有口蹄疫病毒抗体，用于生产猪瘟疫苗的血清不得含有BVDV抗体等。
【细菌内毒素测定】用凝胶法或细菌内毒素检测仪测定，按照鲎试剂或内毒素检测仪操作程序测定，每毫升血清的内毒素含量应低于10 EU。
【细胞增殖试验】取生长良好的Sp2/0小鼠骨髓瘤细胞，弃营养液，用无血清MEM配成每毫升30万～50万细胞悬液，计数细胞后，用无血清MEM在96孔细胞板上作1:200、1:400、1:800、1:1600稀释，每稀释度加8孔，每孔0.1ml，每孔再分别补加0.1ml含20%标准血清或20%被检血清MEM营养液，置5％CO2培养箱37℃培养至48小时，倒置显微镜下计数，取每孔克隆数均在30～50之间的稀释度的8个孔，求和计为总克隆数。
动物血清的区分比较与作用血清主要作用是提供基本营养物质、提供激素和各种生长因子、提供结合蛋白、提供促接触和伸展因子使细胞贴壁免受机械损伤、对培养中的细胞起到某些保护作用。
由于血清来源于动物，且含有细胞培养中所需的各种营养（血浆蛋白、多肽、脂肪、碳水化合物、生长因子、激素、无机物等），这奠定了血清是细胞培养实验中最pu遍的试剂的基础。
市面上的牛血清产品名称虽然五花八门，但根据其不同的特性，追其根本，但大致可分为以下四种。
根据牛的取血年龄可以区分：胎牛血清（Foetal Bovine Serum，简称FBS）指的是取自未出生，母牛剖腹心脏穿刺采血得来的血清。
国产胎牛血清（并无明确定义，但通常用此命名）指的是出生4-6小时，且未进行哺乳（unsuckled）进食的新生牛，有时还称作国产新生牛血清。
适用于常规细胞培养、细胞株保存和单抗研制等方面。
新生牛血清（Newborn Calf Serum，简称NBCS，或称小牛血清）指的是出生14天-3个月进行取血的牛血清。
适用于培养或对环境要求低的细胞。
成年牛血清（Adult Bovine Serum，简称ABS）指的是取血时牛龄通常超过12个月的牛血清。
适用于多种动物体外培养，包括：克隆细胞、单层细胞、悬浮细胞等。
以上取血牛龄的差异主要是受当地国家畜牧业的发展及法规限制影响，因为牛血多为畜牧业副产业，并未有专门为取血而养的牛。
几种血清的比较：提取血清体积/只牛：成年牛血清(5-8L) > 小牛血清(2L) > 国产胎牛血清(1L) > 胎牛血清(0.5L)培养细胞的效果：胎牛血清> 国产胎牛血清> 小牛血清> 成年牛血清价格：胎牛血清> 国产胎牛血清> 小牛血清> 成年牛血清这几种不同牛龄血清所含的促细胞生长因子、促贴附因子、激素及其他活性物质等组分与比例不同。
常规来说，年龄越小的牛血清，细胞培养效果越好。
血吸附法检测新生牛血清病毒
1原理
有些病毒在其敏感宿主细胞中增殖，并不引起细胞病变，但在细胞表层存在病毒蛋白质，用一定百分比的红细胞悬液覆盖细胞表面，置于不同温度条件下一定时间，显微镜下观察，即可出现红细胞被吸附的现象。
血吸附法的技术主要特点是:敏感性高、速度快、成本低。
主要缺点是:病毒特异性检查问题尚未解决，结果判定的客观性较差，是间接检查病毒存在的方法，技术程序也还比较陈旧。
该方法首先使用无病毒血清对实验用Vero细胞进行培养增值，然后分别制备阴性供试品、阳性供试品以及待测试供试品。
取两瓶细胞，分别加入供试品。
然后在适宜的条件下处理，然后观察实验结果。
2材料和方法
2.1材料
2.1.1病毒
牛副流感病毒。
2.1.2细胞
Vero细胞(非洲绿猴肾细胞系)：购自中国生物制品检定所；
2.1.3试剂
无病毒污染的新生牛血清：阴性对照品使用；
MEM培养基：细胞基础培养基；
0.85%生理盐水：洗脱血细胞；
胰蛋白酶：消化细胞；
鸡血；
豚鼠血。
2.1.4仪器设备
①专门的病毒实验室：生物安全柜(CBK一DZOI)操作，符合国家生物安全要求；
②洁净工作台；
③倒置显微镜；
④冰箱；
⑤离心机；
⑥离心瓶、注射器、吸管。
2.1.5阳性病毒
将牛副流感病毒在Vero细胞上连续传代至病毒滴度为5.0lgCCID50/ml以上时进行合并，分为若干批，零下70℃冻存，作为阳性病毒对照液。
2.2方法
2.2.1细胞制备
以细胞密度为2~3×105/mL的Vero细胞，接种到适宜的细胞培养瓶后置于37℃培养箱培养，每天镜下观察细胞的分裂增殖情况，并记录形成良好单层的时间(镜下观察细胞生长成片率达90%以上为良好单层)。
注意将制备的细胞及时进行编号和标注，以免造成混淆。
2.2.2红细胞悬液配制
取体重300一500g豚鼠，心脏采血2一3mL放入内含3一5mL生理盐水的离心管中，盖栓、轻摇。
豚鼠血加入生理盐水洗三次，800一1000转/分钟离
心10一15分钟，压积血球，备用。
取一年龄以上来享公鸡，翼下静脉采血2一3mL放入内含3一5mL生理盐水的离心管中，盖栓、轻摇。
鸡血加入生理盐水洗三次，800一1000转/分钟离心10一15分钟，压积血球，备用。
按比例吸取鸡血球和豚鼠血球，用0.85%生理盐水配制成0.2一0.5%鸡豚红细胞混合悬液备用。
2.2.3供试品检测
取培养到期的接种供试品的每种细胞2瓶，观察细胞病变，细胞形态。
弃培养液，用生理盐水洗三次，加入鸡红细胞和豚鼠红细胞混合悬液5一10mL/瓶，覆盖细胞表面，置2一8℃作用30分钟，然后再置作用20一25℃作用30分钟，弃掉红细胞悬液，用生理盐水反复洗三次，显微镜下观察。
2.2.4阴性对照品制备
用无病毒污染的小牛血清替代供试品，同法操作，作为阴性对照。
2.2.5阳性对照品制备
将按照2.1.5方法将制备好的牛副流感病毒稀释液体，将病毒液稀释至100一240CCID50/mL，然后污染经过56℃灭活处理的新生牛血清，用含有病毒污染的小牛血清替代供试品，同法操作，作为阳性对照。
2.3结果
阳性对照应出现血细胞吸附。
供试品检查不出现血细胞吸附为阴性，判定合格。
供试品检查出现血细胞吸附，判定不合格。
附注：
牛副流感病毒为典型的血吸附病毒，因此利用血吸附法对病毒的存在与否进行确认。
副流感病毒中的HA可以促使动物红细胞的聚集，根据聚集情况判定病毒的存在或者判定病毒的滴度。
副流感病毒有一定的致病性因此在实际的操作中应特别注意实验人员的安全防护。
并且应在实验操作前应进行病毒滴度检测，最终的病毒滴度实验浓度应控制在200CCID50左右，但应注意所采取的方法也应为血吸附法，根据血细胞沉淀来判断该病毒的滴度而不是根据细胞的病变情况来确定，因为该病毒为胞内病毒，其对细胞的病变情况可能不是特别典型和明显。
阴性对照实验的选择同样需要对牛血清进行热灭活处理，副流感病毒对温度较为敏感，在常温条件下暴露时间过长也会影响细胞的正常培养，因此阴性新生牛血清的选取可以选择经过56℃灭活的新生牛血清作为基础培养血清和阴性对照血清，同样也可以选取经过培养无特异微生物的合格新生牛血清。
而在热灭活也会给新生牛血清带来负面的影响，在较热条件下新生牛血清的加热会导致血清中沉淀，会严重影响血吸附实验的结果判定，应需要在实际的实验操作中加以重视。
供试品的冻融次数对牛副流感病毒的影响较大，在实际的操作中由于新生牛血清反复冻融次数过多会对病毒的生长带来一定的影响，从而对病毒的检出率也有很大的影响，一般情况下供试品冻融的次数不能多余8次，否则就会对供试品中牛副流感病毒的判定产生偏差，并且还会对其他新生牛血清的使用者带来不必要的麻烦，造成较大的浪费和损失。
由于牛副流感病毒对温度的敏感性较强，因此在供试品制备实验中应尽量避免高温条件以及其他化学试剂的污染，而且在操作过程中应尽快的完成整个实验操作，避免可能存在的病毒由于长时间暴露而使活性降低。
在实际的新生牛血清保存中是放置在零下20℃的条件下进行保存，在此条件下牛副流感病毒会处于休眠的状态，所以仍然存在在实际使用过程中污染的可能。
