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细胞培养法检测新生牛血清病毒1原理某些病毒在其敏感的宿主细胞内增殖时，可引起细胞病变，即出现细胞变圆、细胞破裂、细胞融合等现象。
细胞培养法的主要特点是：广泛的适用性、操作方法简单、成本较低并且该技术方法成熟。
主要缺点是：特异性差、敏感性较低、检测速度慢。
该方法首先使用无病毒血清对实验用Vero细胞进行培养增值，然后分别制备阴性供试品、阳性供试品以及待测试供试品。
将Vero细胞均匀分为至少3份，分别加入以上供试品。
然后再适宜的温度条件下培养，每日进行观察，最多观察21天并记录细胞病变情况。
2材料和方法2.1材料2.1.1病毒牛腹泻病毒；狂犬病毒；牛腺病毒、牛细小病毒、牛副流感病毒、呼肠孤病毒。
2.1.2细胞Vero细胞(非洲绿猴肾细胞系)：购自中国生物制品检定所2.1.3试剂无病毒污染的新生牛血清：阴性对照品使用；MEM培养基：细胞基础培养基；胰蛋白酶：消化细胞。
2.1.4仪器设备①专门的病毒实验室:生物安全柜(CBK一D201)操作，符合国家生物安全要求；②洁净工作台；③倒置显微镜；④冰箱；⑤离心机；⑥离心管、注射器、吸管。
2.1.5阳性病毒将BVDV等，六种病毒在Vero细胞上连续传代至病毒滴度为5.0lgCCID50/mL以上时进行合并，分为若干批，零下70℃冻存，作为阳性病毒对照液。
2.2方法2.2.1非血吸附病毒检查是指利用传统的细胞培养或利用其他的对不具有动物血细胞吸附性质的病毒进行检测方法的统称。
2.2.2细胞制备以细胞密度为2~3×105/mL的Vero细胞，接种到适宜的细胞培养瓶后置于37℃培养箱培养，每天镜下观察细胞的分裂增殖情况，并记录形成良好单层的时间(镜下观察细胞生长成片率达90%以上为良好单层)。
注意将制备的细胞及时进行编号和标注，以免造成混淆。
2.2.3供试品检测取良好单层细胞培养瓶，弃掉Vero细胞旧营养液，在方瓶中分别加入胰蛋白酶消化液0.8mL，待可见细胞面呈松散状态，弃掉胰蛋白酶消化液，方瓶中分别加入适量生长液将所有细胞都从方瓶壁上吹打下来，再轻轻吹打几次，使细胞尽量分散成单个状态。
血吸附法检测新生牛血清病毒1原理有些病毒在其敏感宿主细胞中增殖，并不引起细胞病变，但在细胞表层存在病毒蛋白质，用一定百分比的红细胞悬液覆盖细胞表面，置于不同温度条件下一定时间，显微镜下观察，即可出现红细胞被吸附的现象。
血吸附法的技术主要特点是:敏感性高、速度快、成本低。
主要缺点是:病毒特异性检查问题尚未解决，结果判定的客观性较差，是间接检查病毒存在的方法，技术程序也还比较陈旧。
该方法首先使用无病毒血清对实验用Vero细胞进行培养增值，然后分别制备阴性供试品、阳性供试品以及待测试供试品。
取两瓶细胞，分别加入供试品。
然后在适宜的条件下处理，然后观察实验结果。
2材料和方法2.1材料2.1.1病毒牛副流感病毒。
2.1.2细胞Vero细胞(非洲绿猴肾细胞系)：购自中国生物制品检定所；2.1.3试剂无病毒污染的新生牛血清：阴性对照品使用；MEM培养基：细胞基础培养基；0.85%生理盐水：洗脱血细胞；胰蛋白酶：消化细胞；鸡血；豚鼠血。
2.1.4仪器设备①专门的病毒实验室：生物安全柜(CBK一DZOI)操作，符合国家生物安全要求；②洁净工作台；③倒置显微镜；④冰箱；⑤离心机；⑥离心瓶、注射器、吸管。
2.1.5阳性病毒将牛副流感病毒在Vero细胞上连续传代至病毒滴度为5.0lgCCID50/ml以上时进行合并，分为若干批，零下70℃冻存，作为阳性病毒对照液。
2.2方法2.2.1细胞制备以细胞密度为2~3×105/mL的Vero细胞，接种到适宜的细胞培养瓶后置于37℃培养箱培养，每天镜下观察细胞的分裂增殖情况，并记录形成良好单层的时间(镜下观察细胞生长成片率达90%以上为良好单层)。
注意将制备的细胞及时进行编号和标注，以免造成混淆。
2.2.2红细胞悬液配制取体重300一500g豚鼠，心脏采血2一3mL放入内含3一5mL生理盐水的离心管中，盖栓、轻摇。
豚鼠血加入生理盐水洗三次，800一1000转/分钟离心10一15分钟，压积血球，备用。
细胞培养时为什么要加入胎牛血清？许多临床和做科研的小伙伴们都要涉及到细胞培养，在细胞培养实验中，血清无疑成为影响实验成功与否的重要因素，而在众多血清之中，牛血清是最为常用的。
牛血清是细胞培养中用量最大的天然培养基，其中含有丰富的细胞生长所必须的营养成份，常用于动物细胞的体外培养，具有极为重要的功能。
牛血清是一种成分复杂的混合物，而且血清的组成及含量通常随供血动物的性别、年龄、生理条件和营养条件不同而存在差异。
牛血清主要成分有蛋白质，多肽类，激素类，其他成分如氨基酸、葡萄糖、微量元素等。
我们都知道牛血清根据取材时间不同而有不同的区分。
分别有胎牛血清应取自剖腹产的胎牛；新牛血清取自出生24小时之内的新生牛；小牛血清取自出生10－30天的小牛。
由于胎牛从未接触过外界，与新生牛和小牛血清相比，抗体含量明显降低，故抗体与培养细胞发生交叉反应的风险也较低，是理想的细胞生长补充剂。
市场上胎牛血清的品牌种类很多，鱼龙混杂，很多科研工作者，特别是刚接触细胞培养的人，难以分辨血清质量的优劣。
小编汇总了多家用户和血清经销商以及网络的经验，分析如下：养过细胞的童鞋大都有着这样的共识：血清，由于其复杂的内在成分和难以控制的外界因素，它既是细胞生长的必备营养，也是细胞死亡的致命毒药，当我们废寝忘食的，呕心沥血的，鞠躬尽瘁的养着细胞同时，也极有可能因为一时的疏忽和大意选错了血清，导致珍贵的细胞意外身外，一切归零，不得不洗心革面重头开始！当血清中内毒素含量≤10EU/ml时，此血清为特级胎牛血清；目前，由于同一厂家，不同批次的血清，内毒素数值也可能有较大差异，因此很多血清厂家在名称上已不注明级别。
但使用者仍可通过检测报告，自行甄别挑选。
编辑Ausbian品牌许晴将经过初步检测合格的很多供体胎牛的粗血清，混合在一起，在低温条件下，经七次加压过滤，最后三次为0.1 µm无菌过滤处理，保证用血清的安全性，同事价格上也有较大优势，是一款高性价比的血清品牌。
血吸附法检测新生牛血清病毒1原理有些病毒在其敏感宿主细胞中增殖，并不引起细胞病变，但在细胞表层存在病毒蛋白质，用一定百分比的红细胞悬液覆盖细胞表面，置于不同温度条件下一定时间，显微镜下观察，即可出现红细胞被吸附的现象。
血吸附法的技术主要特点是:敏感性高、速度快、成本低。
主要缺点是:病毒特异性检查问题尚未解决，结果判定的客观性较差，是间接检查病毒存在的方法，技术程序也还比较陈旧。
该方法首先使用无病毒血清对实验用Vero细胞进行培养增值，然后分别制备阴性供试品、阳性供试品以及待测试供试品。
取两瓶细胞，分别加入供试品。
然后在适宜的条件下处理，然后观察实验结果。
2材料和方法2.1材料2.1.1病毒牛副流感病毒。
2.1.2细胞Vero细胞(非洲绿猴肾细胞系)：购自中国生物制品检定所；2.1.3试剂无病毒污染的新生牛血清：阴性对照品使用；MEM培养基：细胞基础培养基；0.85%生理盐水：洗脱血细胞；胰蛋白酶：消化细胞；鸡血；豚鼠血。
2.1.4仪器设备①专门的病毒实验室：生物安全柜(CBK一DZOI)操作，符合国家生物安全要求；②洁净工作台；③倒置显微镜；④冰箱；⑤离心机；⑥离心瓶、注射器、吸管。
2.1.5阳性病毒将牛副流感病毒在Vero细胞上连续传代至病毒滴度为5.0lgCCID50/ml以上时进行合并，分为若干批，零下70℃冻存，作为阳性病毒对照液。
2.2方法2.2.1细胞制备以细胞密度为2~3×105/mL的Vero细胞，接种到适宜的细胞培养瓶后置于37℃培养箱培养，每天镜下观察细胞的分裂增殖情况，并记录形成良好单层的时间(镜下观察细胞生长成片率达90%以上为良好单层)。
注意将制备的细胞及时进行编号和标注，以免造成混淆。
2.2.2红细胞悬液配制取体重300一500g豚鼠，心脏采血2一3mL放入内含3一5mL生理盐水的离心管中，盖栓、轻摇。
豚鼠血加入生理盐水洗三次，800一1000转/分钟离心10一15分钟，压积血球，备用。
一、牛血清在细胞培养基中的主要功能牛血清是细胞培养中用量最大的天然培养基，含有丰富的细胞生长必须的营养成份，具有极为重要的功能。
1.提供对维持细胞指数生长的激素，基础培养基中没有或量很少的营养物，以及主要的低分子营养物。
2. 提供结合蛋白，能识别维生素、脂类、金属和其他激素等，能结合或调变它们所结合的物质活力。
3.有些情况下结合蛋白质能与有毒金属和热原质结合，起到解毒作用。
4.是细胞贴壁、铺展在塑料培养基质上所需因子来源。
5.起酸碱度缓冲液作用。
6.提供蛋白酶抑制剂，使在细胞传代时使剩余胰蛋白酶失活，保护细胞不受伤害。
二、牛血清的主要成份血清是一种很复杂的混合物，其组成成份虽大部分已为人所知，但还有一部分尚不清楚，而且血清组成及含量常随供血动物的性别、年龄、生理条件和营养条件不同而异。
1.蛋白质是牛血清中主要成份。
除包括可携带金属离子、脂肪酸和自身是激素类蛋白外主要还有白蛋白，球蛋白。
纤维粘连素细胞促进细胞附着；α2 巨球蛋白抑制胰蛋白酶的作用；胎牛血清中含胎球蛋白促细胞附着；转铁蛋白能结合铁离子，减少其毒性和被细胞利用。
2.多肽：血小板促生长因子能促细胞分裂，是多肽家庭的主要成员之一，是主要的促细胞增殖因子；成纤维细胞生长因子、表皮细胞生长因子、神经细胞生长因子等，血清中含量虽很少，但对细胞生长也有一定作用。
3.激素：激素对细胞的作用是多方面的。
胰岛素：促进细胞摄取葡萄糖和氨基酸，与促细胞分裂有关。
类胰岛素生长因子：能与细胞表达的胰岛素受体结合，从而有胰岛素同样的作用。
促生长激素：促细胞增殖效应。
氢化可的松：血清中含有定量的该成分，它可能兼有促细胞贴附和增殖作用，但有人证明，血清中的氢化可的松，如细胞密度高时可能有抑制细胞的作用和诱导其发生分化。
4其他成份氨基酸、葡萄糖、酮酸等对多种营养成分的合成培养基意义不大。
与蛋白相结合状态的微量元素对细胞培养有意义。
三、牛血清的质量要求随着科学技术的发展和生活水平的不断提高对生物医药产品的质量要求也越来越高，所以对制备工艺中所涉及到的各种原材料的质量标准要求也越来越高，特别是对用于细胞培养基中的主要天然成份――牛血清的质量要求也不断提高。
新生犊牛血清生产工艺验证方案文件类别：技术方案制定、批准正文1.目的为了确认新生牛血清生产工艺是否符合质量牛血清标准，特制定本方案以验证目前的生产工艺的可行性和稳定性。
2.范围和责任2.1.范围：适用于牛血清生产工艺的确认。
22 责任1. 2.1.验证委员会：负责验证方案的审批；验证的协调工作，以保证本验证方案规定项目的顺利实施；验证数据及结果的审核；负责验证报告的审批；222.生产管理部：负责本验证方案、报告的起草与实施，并做好相应的记录；在验证过程中对验证相关SoP进行确认。
223.质量管理部：负责验证过程中的组织协调，并对验证过程的偏差处理进行审核；224.质量管理部经理：批准验证文件。
3.人员确定确定参与本次验证的人员并要求所有参与人员签名确认。
5.设备/系统描述牛血清生产工艺分为初制血清的生产和精制血清的生产。
初制血清由基地采集出生14小时以下新生牛的血液，经大容量低温离心机300OrPm离心后、分离血清等步骤获得。
初制血清经检验合格后再通过混合、过滤除菌、分装、压塞、帖签包装而获得精制血清。
血清生产过程复杂，环节较多，厂房设施、空调系统、水系统均应符合生产工艺的需要。
过滤系统、高压灭菌设备达到灭菌标准。
所以本验证是在厂房设施验证、空调系统安装运行验证、工艺用水验证、设备验证、设备清洗验证、无菌生产验证已完成的基础上进行。
6.风险因素分析详见《纯化水系统部件关键性评估报告》7.参考文件7.12010版《中国药典7.22010版《药品生产质量管理规范》8.内容8.1文件检查确认8.1.1目的：确认文件资料已经完备，并且是当前最新版本。
8.1.2测试方法：检查最新版本的文件，现场不能出现旧文件。
8.1.3可接受标准：文件资料已经完备，并且是最终批准版本。
8.1.4记录：见附件18∙2培训检查确认8.2.1目的：确认参与验证的人员都经过此方案的培训8.2.2测试方法：检查培训记录8.2.3可接受标准：验证执行前，参与验证的人员已进行此方案的培训。
动物血清的区分比较与作用血清主要作用是提供基本营养物质、提供激素和各种生长因子、提供结合蛋白、提供促接触和伸展因子使细胞贴壁免受机械损伤、对培养中的细胞起到某些保护作用。
由于血清来源于动物，且含有细胞培养中所需的各种营养（血浆蛋白、多肽、脂肪、碳水化合物、生长因子、激素、无机物等），这奠定了血清是细胞培养实验中最pu遍的试剂的基础。
市面上的牛血清产品名称虽然五花八门，但根据其不同的特性，追其根本，但大致可分为以下四种。
根据牛的取血年龄可以区分：胎牛血清（Foetal Bovine Serum，简称FBS）指的是取自未出生，母牛剖腹心脏穿刺采血得来的血清。
国产胎牛血清（并无明确定义，但通常用此命名）指的是出生4-6小时，且未进行哺乳（unsuckled）进食的新生牛，有时还称作国产新生牛血清。
适用于常规细胞培养、细胞株保存和单抗研制等方面。
新生牛血清（Newborn Calf Serum，简称NBCS，或称小牛血清）指的是出生14天-3个月进行取血的牛血清。
适用于培养或对环境要求低的细胞。
成年牛血清（Adult Bovine Serum，简称ABS）指的是取血时牛龄通常超过12个月的牛血清。
适用于多种动物体外培养，包括：克隆细胞、单层细胞、悬浮细胞等。
以上取血牛龄的差异主要是受当地国家畜牧业的发展及法规限制影响，因为牛血多为畜牧业副产业，并未有专门为取血而养的牛。
几种血清的比较：提取血清体积/只牛：成年牛血清(5-8L) > 小牛血清(2L) > 国产胎牛血清(1L) > 胎牛血清(0.5L)培养细胞的效果：胎牛血清> 国产胎牛血清> 小牛血清> 成年牛血清价格：胎牛血清> 国产胎牛血清> 小牛血清> 成年牛血清这几种不同牛龄血清所含的促细胞生长因子、促贴附因子、激素及其他活性物质等组分与比例不同。
常规来说，年龄越小的牛血清，细胞培养效果越好。
细胞增殖检测(CCK-8检测法)r最佳实验条件的确定林春丽;王旭;李世明;姚丽娜【摘要】在培养基的研发及生产中,促细胞增殖的能力是鉴定培养基质量优劣的一项重要指标,其检测方法也是至关重要的.近年来,各研究院和生物实验室普遍采用快速细胞增殖检测的方法,如CCK-8染色法.本文通过一系列实验分析影响细胞增殖检测结果的因素,以及这些因素的影响范围,从而确定最佳的实验条件.【期刊名称】《国外畜牧学-猪与禽》【年(卷),期】2017(037)005【总页数】3页(P88-90)【关键词】CCK-8试剂;细胞增殖;OD值【作者】林春丽;王旭;李世明;姚丽娜【作者单位】内蒙古维克生生物科技有限公司,内蒙呼和浩特 010109;内蒙古维克生生物科技有限公司,内蒙呼和浩特 010109;内蒙古维克生生物科技有限公司,内蒙呼和浩特 010109;内蒙古维克生生物科技有限公司,内蒙呼和浩特 010109【正文语种】中文【中图分类】Q343.6细胞增殖检测原理：CCK-8试剂中含有W ST-8[其化学名称为：2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4二磺酸苯)-2H-四唑单钠盐]，被细胞中的脱氢酶还原为具有高度水溶性的黄色甲臜染料，生成的甲臜产物的数量与活细胞的数量成正比，在波长为450 nm～ 490 nm条件下，利用酶标仪测定其吸光度，O D值越高证明活细胞数越多，供试品的细胞增殖能力就越强。
CCK-8检测法的操作步骤：细胞接种→细胞培养→添加CCK-8试剂→孵育→测定吸光度，其优点是：试剂不需要溶解，重现性好，操作简单，灵敏度高。
本实验通过改变细胞增殖检测的条件(细胞贴壁率、孵育时间)来检测已知结果的两批样品血清，通过已知的检测结果与实际检测结果对比，来确定影响CCK-8检测的因素，以及控制范围。
2.1 样品血清样品血清分别为胎牛血清和新生牛血清。
依据《中华人民共和国药典》2010版的细胞增殖检测法检测，结果为胎牛血清细胞增殖能力明显优于新生牛血清。
小牛血清和胎牛血清的区别点击次数：730 发布时间：2011-4-28来源不同：胎牛血清(Fetal Bovine Serum ,FBS) 是在屠宰怀孕母牛的时候,通过心脏穿刺采血获取的胎牛的血清，新生牛(小牛)血清(Calf serum, CS)采自出生10至14 天的小牛。
组份与比例不同：两者所含的促细胞生长因子、促贴附因子、激素及其他活性物质等组份与比例不同，用途与用法不同：某些细胞必需胎牛血清才能生长，而有些细胞只需小牛血清即可，使用浓度不同，一般在5%-10%，有特殊要求的浓度在20%。
血清保存和使用须注意：血清应保存在-5℃至-20℃，若存放在4℃不可超过一个月。
解冻血清时，应先将血清至于2-8℃冰箱，并经常摇匀使之溶解，然后至室温放置使之升温，绝对不可将冷冻的血清直接放入37℃水浴或者温箱中，如放在37℃解冻，颜色加深，粘稠度也会增加，血清在解冻和热灭活后，应按用量分装并于-20℃保存，避免反复冻融。
胎牛血清，小牛血清和新生牛血清三种之间的区别：这三种血清的成份，总体没有什么明显差别，只是有一些成分与其生存环境有关，如上述有人说的抗体很等少。
此外，因生长发育的需要，有些成分在小牛出生后会发生一些变化。
不过还没有搞清楚它与其它的血清之间的差别。
有一点可以肯定，胎牛血清中的部分功能蛋白与小牛血清中的含量有差别。
最为重要的一点是，胎牛本身生活在一个洁净环境当中，其血清与外界隔绝，只要生产工艺科学规范，其质量肯定要比后两者好。
根据牛出生时间和血清采制分离方法分为：1、胎牛血清：八月龄胎牛心脏穿刺取血；2、新生牛血清：出生12-24小时新生牛静脉采血；又可细分为：a.高级新生牛血清：采血后静置自然析出的血清；b.标准新生牛血清：c.经离心分离的血清；d.普通新生牛血清：融血或微融血的血清；3.小牛血清：出生三月龄小牛动脉采血分离血清；血清是血浆去除纤维蛋白而形成的一种很复杂的混合物，其组成成份虽大部分已知，但还有一部分尚不清楚，且血清组成及含量常随供血动物的性别、年龄、生理条件和营养条件不同而异。
