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1.目的
建立血红蛋白测定的操作步骤，以保证试验的顺利进行和结果的真实可靠。
2.适用范围
适用于血清制品血红蛋白的测定（分光光度计法）
3.职责
检验人员。
4.定义
无
5.引用标准
《中国药典》2015版四部通则3604
6.材料及设备
6.1 751分光光度计
6.2 1-cm光路的比色杯
6.3 蒸馏水
7.流程图
无
8.内容
8.1.以蒸馏水为空白对照。
8.2 使用1-cm光路的比色杯，直接测定牛血清样品在576nm、623nm及700nm
波长下的吸光值。
8.3 每个样品至少测定2次。
8.4 计算平均测定值
8.5 按照下式计算样品中血红蛋白含量：
血红蛋白含量（mg/dl）=[(A576×115)−(A623×102)−(A700×39.1)] ×10。
8.6 其中；A576、A623、A700是样品在576nm、623nm及700nm波长下的平均
吸光值。
9.注意事项
9.1. 严格按照仪器说明书进行操作。
9.2. 比色杯要保持清洁，定期在盐酸液中进行浸泡。
9.3. 试验完毕将所有物品放归原处。
10.附录及派生记录
10.1. 血红蛋白检测记录F-SOP-ZL004-01
11.相关文件
无
12.修订记录。
《中华人民共和国药典（2015年版）》（四部）通则中有关生物测定部分的增、修订情况介绍作者：唐黎明陈桂良来源：《上海医药》2016年第07期摘要《中华人民共和国药典（2015年版）》将前版药典一、二、三部分别收载的附录整合归为四部，作为药典的通用要求。
四部中有关生物测定部分除整合了热原检查法、异常毒性检查法等原附录外，还新增了组胺物质检查法等，同时对部分原附录进行了修订。
本文介绍相关情况。
关键词《中华人民共和国药典（2015年版）》生物测定通则增、修订中图分类号：R921.2 文献标识码：C 文章编号：1006-1533（2016）07-0009-02Introduction of the revised information about the biologic test in general principle（volume IV）of the Pharmacopoeia of the People’s Republic of China （2015 version）TANG Liming*， CHEN Guiliang（Division of Pharmacology and Toxicology， Shanghai Institute for Food and Drug Control，Shanghai 201203， China）ABSTRACT The appendices in the Pharmacopoeia of the People’s Republic of China （ChP）（2010 version） volume I， II and III were integrated into volume IV in ChP （2015 version），which can be served as the common requirement for pharmacopoeia standards. The histamine test and so on were added in the biological test of volume IV besides the intergradation of pyrogens test and abnormal toxicity test and meanwhile some appendices on bioassay were revised as well. In this paper， the relevant information is introduced for reference.KEY WORDS Pharmacopoeia of the People’s Republic of China （2015 version）； biologic test； general principle； revision《中华人民共和国药典（2015年版）》（以下简称为“2015年版《中国药典》”）已自2015年12月1日起正式实施。
小牛血类产品原料质量管理自律规范（征求意见稿）目录第一章总则 (2)第二章机构与人员 (2)第三章厂房与设施 (3)第四章设备 (3)第五章验证 (4)第六章文件 (5)第七章生产管理 (5)第八章质量控制管理 (7)第九章运输管理 (8)第十章附则.................................................. 错误!未定义书签。
第一章总则第一条为了规范会员单位小牛血类产品原料的生产，提高小牛血类产品原料的质量，旨在保证药品质量和安全性前提下最大限度降低其生产过程中污染、交叉污染以及混淆、差错等风险，确保持续稳定地生产出符合制剂成品的小牛血（清）原料，制定本规范。
第二条本规范所指的小牛血类产品原料（以下简称原料）是指用于小牛血类产品如小牛血（清）去蛋白提取物的注射剂、口服制剂（胶囊片剂）、眼用制剂等生产用，采集自供血牛的血液经去纤维蛋白的小牛血和小牛血清。
第三条本规范适用于小牛血类产品原料生产的全过程，包括采集、规定的加工工艺、质量检验、储存和运输。
第二章机构与人员第四条企业应当对原料直接负责，实施监管。
应设立与原料生产相适应的管理机构，履行质量保证和质量控制的职责。
第五条企业应当配备足够数量并具有适当资质（含学历、培训和实践经验）的管理和操作人员。
第六条与原料生产、质量控制有关的所有人员应经过培训，培训的内容应当与岗位的要求相适应，培训记录等应以书面形式归入个人培训档案中。
第七条进入洁净区的工作人员（包括维修人员、辅助人员）应定期进行卫生和微生物学基础知识、洁净作业等方面的培训及考核，并纳入个人培训档案。
第八条企业应当对人员健康进行管理，并建立健康档案。
第三章厂房与设施第九条小牛血的采集点应设置在合法合规的屠宰企业或养殖场，并应有《动物防疫条件合格证》。
第十条用于小牛血采集的区域内表面应当平整光滑、无裂缝，避免积尘，便于有效清洁；并设置适当的隔离设施，能够有效防止虫、鼠进入，必要时应当进行消毒。
《中国药典》2015年版通则目录及增修订内容 0100 制剂通则 0101 片剂 0102 注射剂 0103 胶囊剂 0104 颗粒剂 0105 眼用制剂 0106 鼻用制剂 0107 栓剂 0108 软膏剂 0109 乳膏剂 0110 糊剂 0111 吸入制剂 0112 喷雾剂 0113 气雾剂 0114 凝胶剂 0115 散剂 0116 滴丸剂 0117 糖丸 0118 糖浆剂 0120 涂剂 0121 涂膜剂 0122 酊剂 0123 贴剂 0124 贴膏剂 0125 口服溶液剂口服混悬剂口服乳剂 0126 植入剂 0127 膜剂 0128 耳用制剂 0129 洗剂 0130 冲洗剂 0131 灌肠剂 0181 丸剂 0182 合剂 0183 锭剂 0184 煎膏剂(膏滋) 0185 胶剂 0186 酒剂 0187 流浸膏剂与浸膏剂 0189 露剂 0190 茶剂 0200 其他通则 0211 药材和饮片取样法(未修订) 0212 药材和饮片检定通则(第二增补本) 0213 炮制通则(未修订) 0251 药用辅料通则 0261 制药用水 0271 药包材通则(待定) 0272 玻璃容器(待定) 0291 国家药品标准物质通则(第二增补本) 0300 0301 一般鉴别试验(第二增补本) 0400 光谱法 0401 紫外-可见分光光度法 0402 红外分光光度法 0405 荧光分光光度法 0406 原子吸收分光光度法 0407 火焰光度法 0411 电感耦合等离子体原子发射光谱法 0412 电感耦合等离子体质谱法(增订) 0421 拉曼光谱法(新增) 0431 质谱法 0441 核磁共振波谱法 0451 X射线衍射法 0500 色谱法(未修订) 0501 纸色谱法 0502 薄层色谱法 0511 柱色谱法(未修订) 0512 高效液相色谱法 0513 离子色谱法 0514 分子排阻色谱法 0521 气相色谱法 0531 超临界流体色谱法(拟新增) 0532 临界点色谱法(拟新增) 0541 电泳法 0542 毛细管电泳法 0600 物理常数测定法 0601 相对密度测定法(未修订) 0611 馏程测定法 0612 熔点测定法 0613 凝点测定法 0621 旋光度测定法 0622 折光率测定法(未修订) 0631 pH值测定法 0632 渗透压摩尔浓度测定法 0633 黏度测定法 0661 热分析法(第二增补本) 0681 制药用水电导率测定法(未修订) 0682 制药用水中总有机碳测定法(未修订) 0700 其他测定法Other Assays 0701 电位滴定法与永停滴定法(未修订) 0702 非水溶液滴定法 0703 氧瓶燃烧法(未修订) 0704 氮测定法 0711 乙醇量测定法 0712 甲氧基、乙氧基与羟丙氧基测定法(未修订) 0713 脂肪与脂肪油测定法(未修订) 0721 维生素A测定法(未修订) 0722 维生素D测定法(未修订) 0731 蛋白质含量测定法 0800 限量检查法 0801 氯化物检查法(未修订) 0802 硫酸盐检查法(未修订) 0803 硫化物检查法(未修订) 0804 硒检查法(未修订) 0805 氟检查法(未修订) 0806 氰化物检查法 0807 铁盐检查法(未修订) 0808 铵盐检查法(第二增补本) 0821 重金属检查法(第一增补本) 0822 砷盐检查法(未修订) 0831 干燥失重测定法 0832 水分测定法 0841 炽灼残渣检查法(第二增补本) 0842 易炭化物检查法(未修订) 0861 残留溶剂测定法(未修订) 0871 甲醇量检查法 0872 合成多肽中的醋酸测定法(未修订) 0873 2-乙基己酸测定法(未修订) 0900 物理特性检查法 0901 溶液颜色检查法 0902 澄清度检查法 0903 不溶性微粒检查法 0904 可见异物检查法 0921 崩解时限检查法 0922 融变时限检查法(未修订) 0923 片剂脆碎度检查法(未修订) 0931 溶出度测定法(合并释放度测定法) 0941 含量均匀度检查法 0942 最低装量检查法 0951 吸入制剂微细粒子的空气动力学评价方法(原雾滴粒分布测定法) 0952 贴膏剂黏附力测定法 0981 结晶性检查法(未修订) 0982 粒度和粒度分布测定法(第一增补本) 0983 锥入度测定法 1000 分子生物学技术 1001 核酸分子鉴定法(待定) 1100 生物检查法 1101 无菌检查法 1105 非无菌产品微生物限度检查：微生物计数法 1106 非无菌产品微生物限度检查：控制菌检查法 1107 非无菌药品微生物限度标准 1121 抑菌效力检查法(第三增补本、新增) 1141 异常毒性检查法 1142 热原检查法 1143 细菌内毒素检查法 1144 升压物质检查法 1145 降压物质检查法(未修订) 1146 组胺类物质检查法(新增) 1147 过敏反应检查法(未修订) 1148 溶血与凝聚检查法 1200 生物活性测定法 1201 抗生素微生物检定法(未修订) 1202 青霉素酶及其活力测定法(未修订) 1205 升压素生物测定法 1206 细胞色素C活力测定法(未修订) 1207 玻璃酸酶测定法(未修订) 1208 肝素生物测定法(第三增补本) 1209 绒促性素生物测定法 1210 缩宫素生物测定法 1211 胰岛素生物测定法(未修订) 1212 精蛋白锌胰岛素注射液延缓作用检查法(未修订) 1213 硫酸鱼精蛋白生物测定法(未修订) 1214 洋地黄生物测定法(未修订) 1215 葡萄糖酸锑钠毒力检查法(未修订) 1216 卵泡刺激素生物测定法 1217 黄体生成素生物测定法 1218 降钙素生物测定法 1219 生长激素生物测定法(未修订) 1401 放射性药品检定法(未修订) 1421 灭菌法(未修订) 1431 生物检定统计法(未修订) 2000 中药相关检查方法 2001 显微鉴别法(第二增补本) 2002 中药材DNA条形码分子鉴定法(新增) 2101 膨胀度测定法(第二增补本) 2102 膏药软化点测定法(未修订) 2201 浸出物测定法(未修订) 2202 鞣质含量测定法(第二增补本) 2203 桉油精含量测定法(未修订) 2204 挥发油测定法(未修订) 2301 药材和饮片杂质检查法 2302 灰分测定法(未修订) 2303 酸败度测定法(未修订) 2321 铅、镉、砷、汞、铜测定法(未修订) 2322 元素形态及其价态测定法（拟新增） 2331 二氧化硫残留量测定法 2341 农药残留量测定法（第二增补本+增订） 2351 黄曲霉毒素测定法（第二增补本+增订） 2400 中药注射剂有关物质检查法(拟修订) 2401 中药注射剂蛋白质检查法(待定) 2402 中药注射剂鞣质检查法(待定) 2403 中药注射剂树脂检查法(待定) 2404 中药注射剂草酸盐检查法(待定) 2405 中药注射剂钾离子检查法(待定) 2406 中药注射剂高分子聚合物检查法(待定) 3000 生物制品相关检查方法(待定) 3100 含量测定法 3101 固体总量测定法 3102 唾液酸测定法 3103 磷测定法 3104 硫酸铵测定法 3105 亚硫酸氢钠测定法 3106 氢氧化铝(或磷酸铝)测定法 3107 氯化钠测定法 3108 枸橼酸离子测定法 3109 辛酸钠测定法 3110 乙酰色氨酸测定法 3111 苯酚测定法 3112 间甲酚测定法 3113 硫柳汞测定法 3114 对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯含量测定法 3115 O-乙酰基测定法 3116 己二酰肼含量测定法 3117 高分子结合物含量测定法 3118 人血液制品中糖及糖醇测定法 3119 人血白蛋白多聚体测定法 3120 人免疫球蛋白类制品IgG单体加二聚体测定法 3121 人免疫球蛋白类制品甘氨酸含量测定法 3122 重组人粒细胞刺激因子蛋白质含量测定法 3123 组胺人免疫球蛋白中游离磷酸组胺测定法 3124 IgG含量测定法 3200 化学残留物测定法 3201 乙醇残留量测定法 3202 聚乙二醇残留量测定法 3203 聚山梨酯80残留量测定法 3204 戊二醛残留量测定法 3205 磷酸三丁酯残留量测定法 3206 碳二亚胺(EDAC)残留量测定法 3207 游离甲醛测定法 3208 人血白蛋白铝残留量测定法 3300 微生物检查法 3301 支原体检查法 3302 病毒外源因子检查法 3303 鼠源性病毒检查法 3400 生物测定法 3401 免疫印迹法 3402 免疫斑点法 3403 免疫双扩散法 3404 免疫电泳法 3405 肽图检查法 3406 质粒丢失率检查法 3407 SV40核酸序列检查法 3408 外源性DNA残留量测定法 3409 抗生素残留量检查法(培养法) 3410 激肽释放酶原激活剂测定法 3411 抗补体活性测定法 3412 牛血清白蛋白残留量测定法 3413 大肠杆菌菌体蛋白质残留量测定法 3414 假单胞菌菌体蛋白质残留量测定法 3415 酵母工程菌菌体蛋白质残留量测定法 3416 类A血型物质测定法 3417 鼠IgG残留量测定法 3418 无细胞百日咳疫苗鉴别试验(酶联免疫法) 3419 抗毒素、抗血清制品鉴别试验(酶联免疫法) 3420 A群脑膜炎球菌多糖分子大小测定法 3421 伤寒Vi多糖分子大小测定法 3422 b型流感嗜血杆菌结合疫苗多糖含量测定法 3423 人凝血酶活性检查法 3424 活化的凝血因子活性检查法 3425 肝素含量测定法 3426 抗A、抗B血凝素测定法 3427 人红细胞抗体测定法 3428 人血小板抗体测定法 3429 猴体神经毒力试验 3500 生物活性/效价测定法 3501 重组乙型肝炎疫苗(酵母)体外相对效力检查法 3502 甲型肝炎灭活疫苗体外相对效力检查法 3503 人用狂犬病疫苗效价测定法 3504 吸附破伤风疫苗效价测定法 3505 吸附白喉疫苗效价测定法 3506 类毒素絮状单位测定法 3507 白喉抗毒素效价测定法 3508 破伤风抗毒素效价测定法 3509 气性坏疽抗毒素效价测定法 3510 肉毒抗毒素效价测定法 3511 抗蛇毒血清效价测定法 3512 狂犬病免疫球蛋白效价测定法 3513 人免疫球蛋白中白喉抗体效价测定法 3514 人免疫球蛋白Fc段生物学活性测定法 3515 抗人T细胞免疫球蛋白效价测定法(E玫瑰花环形成抑制试验) 3516 抗人T细胞免疫球蛋白效价测定法(淋巴细胞毒试验) 3517 人凝血因子Ⅱ效价测定法 3518 人凝血因子Ⅶ效价测定法 3519 人凝血因子Ⅸ效价测定法 3520 人凝血因子Ⅹ效价测定法 3521 人凝血因子Ⅷ效价测定法 3522 重组人促红素体内生物学活性测定法 3523 干扰素生物学活性测定法 3524 重组人白介素-2生物学活性测定法 3525 重组人粒细胞刺激因子生物学活性测定法 3526 重组人粒细胞巨噬细胞刺激因子生物学活性测定法 3527 重组牛碱性成纤维细胞生长因子生物学活性测定法 3528 重组人表皮生长因子生物学活性测定法 3529 重组链激酶生物学活性测定法 3600 特定生物原材料/动物 3601 无特定病原体鸡胚质量检测要求 3602 实验动物微生物学检测要求 3603 实验动物寄生虫学检测要求 3604 新生牛血清检测要求 3611 细菌生化反应培养基 8000 试剂和标准物质(待定) 8001 试药 8002 试液 8003 试纸 8004 缓冲液 8005 指示剂与指示液 8006 滴定液 8061 标准物质 9000 指导原则 9001 原料药与药物制剂稳定性试验指导原则(待定) 9011 药物制剂人体生物利用度和生物等效性试验指导原则(待定) 9012 生物样品定量分析方法指导原则(待定) 9013 缓释、控释和迟释制剂指导原则(未修订) 9014 微粒制剂指导原则(待定) 9015 注射剂制备指导原则(拟新增，待定) 9101 药品质量标准分析方法验证指导原则 9102 药品杂质分析指导原则 9103 药物引湿性试验指导原则(未修订) 9104 近红外分光光度法指导原则(未修订) 9105 多晶型药品的质量控制技术与方法指导原则(新增) 9106 基于基因芯片技术的药物安全性和有效性评价技术指导原则(新增) 9201 药品微生物检验替代方法验证指导原则(未修订) 9202 微生物限度检查法应用指导原则 9203 药品微生物实验室质量管理指导原则(第三增补本) 9204 微生物鉴定指导原则(新增) 9205 药品洁净实验室微生物监测和控制指导原则(新增) 9206 无菌检查用隔离系统验证指导原则(新增) 9301 注射剂安全性检查法应用指导原则 9302 有害残留物限量制定指导原则(新增) 9401 中药生物活性测定指导原则 9501 正电子类放射性药品质量控制指导原则(未修订) 9502 锝[99mTc]放射性药品质量控制指导原则(未修订) 9701 药用辅料性能指标研究指导原则(第三增补本、拟新增) 9901 国家药品标准物质制备指导原则(第二增补本)。
0101 0102 0103 0104 0105 0106 0107 0108 0109 0110 0111 0112 0113 0114 0115 0116 0117 0118 01190120 0121 0122 0123 0124 0125 0126 0127 0128 0129 0181 0182 0183 0184 0185 0186 0187 0188 018902610400 0401 0402 0405 0406 0407 0411 0412 0421 0431 0441 0451 X050105020512 0513 05140531 0532 0541 05420611 0612 0613 06210631 pH 0632 063307020704 07110731 08060831 083208710901 0902 0903 0904 09210931 0941 0942 09510952 09831101 1105 1106 1107 1121 1141 1142 1143 11441146 114812051208 1209 12101216 1217 121823012322 2331 2341 23513104 硫酸铵测定法3105 亚硫酸氢钠测定法3106 氢氧化铝（或磷酸铝）测定法3107 氯化钠测定法3108 枸橼酸离子测定法3109 辛酸钠测定法3110 乙酰色氨酸测定法3111 苯酚测定法3112 间甲酚测定法3113 硫柳汞测定法3114 对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯含量测定法3115 O-乙酰基测定法3116 己二酰肼含量测定法3117 高分子结合物含量测定法3118 人血液制品中糖及糖醇测定法3119 人血白蛋白多聚体测定法3120 人免疫球蛋白类制品IgG单体加二聚体测定法3121 人免疫球蛋白类中甘氨酸含量测定法3122 重组人粒细胞刺激因子蛋白质含量测定法3123 组胺人免疫球蛋白中游离磷酸组胺测定法3124 IgG含量测定法3200 化学残留物测定法3201 乙醇残留量测定法3202 聚乙二醇残留量测定法3203 聚山梨酯80残留量测定法3204 戊二醛残留量测定法3205 磷酸三丁酯残留量测定法3206 碳二亚胺（EDAC）残留量测定法3207 游离甲醛测定法3208 人血白蛋白铝残留量测定法3209 羟胺残留量测定法3300 微生物检查法3301 支原体检查法3302 病毒外源因子检查法3303 鼠源性病毒检查法3400 生物测定法3401 免疫印迹法3402 免疫斑点法3403 免疫双扩散法3404 免疫电泳法3405 肽图检查法3406 质粒丢失率检查法3407 SV40核酸序列检查法3408 外源性DNA残留量测定法3409 抗生素残留量检查法3410 激肽释放酶原激活剂测定法3411 抗补体活性测定法3412 牛血清白蛋白残留量测定法3413 大肠杆菌菌体蛋白质残留量测定法3414 假单胞菌菌体蛋白质残留量测定法3415 酵母工程菌菌体蛋白质残留量测定法3416 类A血型物质测定法3417 鼠IgG残留量测定法3418 无细胞百日咳疫苗鉴别试验3419 抗毒素、抗血清制品鉴别试验3420 A群脑膜炎球菌多糖分子大小测定法3421 伤寒Vi多糖分子大小测定法3422 b型流感嗜血杆菌结合疫苗多糖含量测定法3423 人凝血酶活性检查法3424 活化的凝血因子活性检查法3425 肝素含量测定法3426 抗A、抗B血凝素测定法3427 人红细胞抗体测定法3428 人血小板抗体测定法3429 猴体神经毒力试验3430 人血浆病毒核酸检测技术要求3431 单抗纯度茨顶方法-CE-SDS毛细管电泳（还原和非还原）3500 生物活性/效价测定法3501 重组乙型肝炎疫苗（酵母）体外相对效力检查法3502 甲型肝炎灭活疫苗体外相对效力检查法3503 人用狂犬病疫苗效价测定法3504 吸附破伤风疫苗效价测定法3505 吸附白喉疫苗效价测定法3506 类毒素絮状单位测定法3507 白喉抗毒素效价测定法3508 破伤风抗毒素效价测定法3509 气性坏疽抗毒素效价测定法3510 肉毒抗毒素效价测定法3511 抗蛇毒血清效价测定法3512 狂犬病免疫球蛋白效价测定法3513 人免疫球蛋白中白喉抗体效价测定法3514 人免疫球蛋白Fc段生物学活性测定法3515 抗人T细胞免疫球蛋白效价测定法(E玫瑰花环形成抑制试验) 3516 抗人T细胞免疫球蛋白效价测定法(淋巴细胞毒试验)3517 人凝血因子Ⅱ效价测定法3518 人凝血因子Ⅶ效价测定法3519 人凝血因子Ⅸ效价测定法3520 人凝血因子Ⅹ效价测定法3521 人凝血因子Ⅷ效价测定法3522 重组人促红素体内生物学活性测定法3523 干扰素生物学活性测定法3524 重组人白介素-2生物学活性测定法3525 重组人粒细胞刺激因子生物学活性测定法3526 重组人粒细胞巨噬细胞刺激因子生物学活性测定法3527 重组牛碱性成纤维细胞生长因子生物学活性测定法3528 重组人表皮生长因子生物学活性测定法3529 重组链激酶生物学活性测定法3530 鼠神经生长因子生物学活性测定法3531 尼妥珠单抗生物学活性测定法3532 白介素-11-生物活性测定方法3600 特定生物原材料/动物3601 无特定病原体鸡胚质量检测要求3602 实验动物微生物学检测要求3603 实验动物寄生虫学检测要求3604 新生牛血清检测要求3611 细菌生化反应培养基8000 试剂与标准物质（待定）8001 试药8002 试液90119012901490159101910291059106910792029203 9204 9205 9206 9301 9302 9303 9304 9305 94019601 9621 96224.国家药典委员会2014年7月30日。
牛血清的质量检测（一）化学检测（1）渗透压（280-340mOsmol/kg）：使用凝固点降低的方法检测渗透压，使用国家标准技术研究所标定的标准溶液对我们的渗透压仪器进行校准；（2）PH值（7.0-7.5）：同样使用国家标准技术研究所标定的标准溶液对pH计进行校准；（3）蛋白含量：（电容法）样品被加到醋酸纤维素介质中并在缓冲溶液体系内迁移，条带经染色、清洁、干燥后用密度仪进行扫描以检测***和球蛋白组分的相对浓度。
***、球蛋白和血红蛋白随着牛年龄的增加血清中总蛋白含量相应增加，总的血清蛋白含量可以确认产品的规格和年龄。
（二）微生物检查（1）细菌和真菌:直接培养法（2）支原体：（培养法及DNA染色法）在支原体专业培养基上培养3-4周，培养温度34°C～36°C分别在需氧和厌氧的条件下进行，有的还需要在支原体琼脂培养皿上传4代，Hoechst 荧光素DNA染色检查哪些培养法无法检出的支原体如猪鼻支原体等。
（3）病毒：牛兰舌病毒Bovine blue tongue;牛腺病毒Bovine Adeovirus；牛细小病毒Bovine Parvovirus;牛病毒性腹泻病毒Bovine Viral Diarhea Virus;狂犬病病毒Rabies;呼肠狐病毒Reovirus；牛呼吸道合胞病毒BRSV;副流感病毒III型Parainfluenza。
检查方法：已证明无外源因子污染的牛细胞培养物，在细胞生长液中加15%待测血清，连传3代共21天。
阴性对照细胞培养液中价15%已知无病毒污染的牛血清，与试验组同条件下进行。
在观察期内注意细胞形态变化或细胞病变。
在观察期内第14天待检样品和对照样品用标准病毒检测方法检查。
如待检细胞培养物经胰酶消化后分种到6个含盖玻片的容器内。
阴性对照品按同样方法。
再将牛腹泻病毒、牛细小病毒、牛腺病毒、狂犬病毒和呼肠弧病毒分别加入待检培养物盖玻片容器内作为阳性对照，在培养7天，用荧光抗体技术进行检查。
1.目的：规范牛血清促细胞生长检查的检验操作程序，确保检验结果的准确有效。
2. 适用范围：2.1 本标准规定了本公司原材料牛血清促细胞生长检查的SOP。
2.2 本标准适用于本公司原材料牛血清促细胞生长检验。
3. 职责：3.1 检验人员：严格按照本SOP进行检定，并完成与本SOP相关的记录。
3.2 检定组长：按照本SOP组织相关人员进行培训，并监督实施。
3.3 质量控制室主任：负责对本SOP的实施进行管理。
4. 材料：4.1 供试品：新生牛血清4.2 器具：1ml、10ml刻度吸管，T25细胞培养瓶，96孔培养板，细胞计数板，盖玻片4.3 试剂及检定细胞：高糖DMEM培养基，对照血清（已检测合格的牛血清）,SP2/0细胞4.4 仪器与设备：CO培养箱、倒置显微镜，超净工作台25. 内容5.1 操作步骤：5.1.1取供试品牛血清和对照血清，分别配制含有10%供试品牛血清和对照血清的培养基。
5.1.2 复苏SP2/0细胞，用含有10%对照血清的培养基在T25瓶中培养。
待其状态良好时，分别用对照牛血清及供试品继续适应性传代，每三天传一代，至少连传三次。
5.1.3取对数生长期的细胞用于试验。
弃去T25瓶中的培养基，加入5mlDMEM培养基，用吸管吹打，将SP2/0细胞制成每1ml含104个活细胞的浓度，接种到96孔培养板中，每批供试品培养箱培养，同时做阴性对照。
从第3天起，供试品和阴16孔，每孔0.2ml，置37℃ 5%CO2性对照每天取1孔进行细胞计数，连续计数一周。
5.2 结果计算5.2.1 细胞生长曲线的测定：将计数一周的细胞绘制成生长曲线。
5.2.2 细胞倍增时间的测定：取细胞峰值前一天的细胞计数（Y）、接种细胞数（X）及生长时间（T）计算。
倍增时间＝T/A A= logY/X25.3结果判断：细胞最大增殖浓度应不低于106/ml；细胞倍增时间应不超过20小时。
6.健康、安全与环境：6.1 N/A7. 注意事项：7.1 N/A8. 术语：8.1 SP2/0细胞：骨髓瘤细胞9. 引用标准：9.1《中华人民共和国药典》2015年版三部。
药典三部(2015版)-通则-3604 新生牛血清检测要求．
3604 新生牛血清检测要求
本品系从出生14小时内未进食的新生牛采血分离血清，经除菌过滤后制成。
牛血清生产过程中不得任意添加其他物质成分。
新生牛血清应进行以下检查，符合规定后方可使用。
如采用经过验证的病毒灭活工艺处理的牛血清，大肠杆菌噬菌体及病毒检测必须在灭活前取样进行。
pH值应为7.00～8.50。
蛋白质含量采用双缩脲法（通则0731第三法）或其他适宜方法测定，应为35～50g/L。
血红蛋白用分光光度法或其他适宜的方法测定，应不高于
200mg/L。
以蒸馏水为空白对照，使用1cm光路的比色杯，直接测定供试品在576nm、623nm及700nm波长下的吸光度值，每个供试品至少测定2次，计算平均测定值。
按照下式计算供试品中血红蛋白含量：
血红蛋白含量（mg/L）=[(A×115)－(A×102)－(A×39.1)]×10 700623576式中 A、A、A为供试品在576nm、623nm及700nm波长下700623576的平均吸光度值。
渗透压摩尔浓度应为250～330mOsmol/kg（通则0632）。
细菌内毒素检查应不高于10EU/ml（通则1143凝胶限度试验）。
支持细胞增殖检查用Sp2/0-Ag14或适宜的传代细胞进行。
细胞复苏后，用待测样品配制的培养液至少连续传三代后使用，取对数
生长期的细胞用于试验。
（1）细胞生长曲线的测定取供试品按10%浓度配制细胞培养4的细胞浓度接种细胞，每天计数活细胞，连续观含10液，按每1ml6/ml。
察1周，并绘制生长曲线，细胞的最大增殖浓度应不低于10（2）细胞倍增时间的测定按生长曲线计算细胞的倍增时间。
取细胞峰值前一天的细胞计数（Y）、接种细胞数（X）及生长时间（T）计算。
倍增时间=T/A A=logY/X
2细胞的倍增时间应不超过20小时。
（3）克隆率的测定按有限稀释法将细胞稀释至每1ml含10个活细胞的浓度，按每孔1个细胞接种于96孔细胞培养板，每板至少接种60孔，于37℃、5%二氧化碳培养，定期观察细胞克隆生长情况，培养1周后计数每孔中的细胞克隆数，并计算克隆率，应不低于70%。
克隆率=A/B×100%
式中 A为细胞克隆数；
B为接种细胞的总孔数。
无菌检查依法检查（通则1101），应符合规定。
支原体检查依法检查（通则3301），应符合规定。
大肠杆菌噬菌体采用噬斑法和增殖法检测。
不得有噬菌体污染。
病毒检查细胞培养法及荧光抗体检测
（1）样品制备取约250ml的新生牛血清供试品用于检测，将其配制成含15%供试品的培养液，用于检测全过程的细胞换液及传代。
以检测合格的血清作为阴性对照血清。
（2）指示细胞制备至少采用猴源（如Vero细胞）、2种牛源细胞（BT和MDBK细胞或无病毒污染的原代牛肾细胞）以及人二倍体细胞作为指示细胞。
细胞复苏后至少传代1次后使用。
根据所需量制备足够量的细胞。
275cm4种指示细胞分别接种于（3）用含有供试品的培养液将细胞培养瓶中，接种量应使细胞在培养7天后可达到至少80%～90%汇合。
同时制备阴性对照血清培养瓶。
将培养瓶置37℃、5%CO培2养箱中培养至少7天。
可在第5天时换液一次。
（4）第7天进行第1次盲传，将接种供试品及阴性对照的每种2培养瓶，继续培养至第75cm个14指示细胞培养瓶分别传出至少2天，在第12天时可换液一次。
（5）在第13天时（或第2次传代前1天）或阴性对照瓶细胞达到至少70%汇合时，制备阳性对照用细胞。
即取1个阴性对照细胞瓶分别传至6孔板或其他适宜的细胞板中用于细胞病变观察（CPE）、血吸附检查（HAd）及荧光抗体检测（IF），次日接种阳性对照病毒。
（6）第14天时进行第2次盲传。
将第1次传代后的细胞培养物分别传至6孔板或其他适宜的细胞板中，进行细胞病变观察及HAd检查时，接种于每种指示细胞上的待测样本至少接种3孔；进行荧光抗体检测时，接种于每种指示细胞上的待测样本进行每种病毒检测时
至少接种2孔。
继续培养至少至第21天。
剩余细胞样本-60℃或以下保存备用。
（7）在第14天接种阳性对照病毒：取（5）制备的指示细胞接种适量阳性对照病毒，置36℃±1℃、5%CO培养箱吸附2小时，吸2弃上清液，加入适量细胞维持液，置36℃±1℃、5%CO培养箱培养27天。
对于BT细胞，BVDV可作为病变阳性对照，BPI3可作为HAd
阳性对照，牛副流感病毒3型（PI3）、牛胰病毒（BAV-3）、牛细小病毒（BPV）以及牛腹泻病毒（BVDV）可作为IF检测阳性对照；对于MDBK细胞，呼肠孤病毒3型（REO3）和PI3可分别作为细胞病变及HAd检查阳性对照，PI3、BAV-3、BVDV、REO-3为IF检测阳性对照；对于Vero细胞，PI3可作为细胞病变及HAd检查阳性对照，PI3及REO-3作为IF检测阳性对照。
可不设立狂犬病病毒（Rabies）阳性对照。
所有IF检测阳性对照病毒应接种100～300CCID。
50（8）接种阴性对照及供试品的细胞培养物在接种后每日观察细胞病变情况，在接种后至少21天或末次传代后至少7天时分别进行病变观察、HAd检查及IF检测。
阳性对照培养物在接种后第7天或10%细胞出现CPE时可进行IF检测。
进行血吸附检查时，用鸡与豚鼠血红细胞在2～8℃及20～25℃进行检测。
进行荧光抗体检测时，将细胞固定后采用直接或间接免疫荧光抗体检查法，至少应对BVDV、PI3、BAV-3、BPV、REO3以及Rabies
进行检查，结果均应为阴性。
（9）结果判定阴性对照应无细胞病变，血吸附检查应为阴性，荧光抗体检测应为阴性；阳性对照应有明显的细胞病变，血吸附检查应为阳性，荧光抗体检测应为阳性，判为试验成立。
供试品如无细胞病变，血吸附检查为阴性，且荧光抗体检测为阴性，判定为符合要求。
待测样本如出现细胞病变，或血吸附检查为阳性，或任何一种荧光抗
体为阳性，则判定为不符合要求。
经病毒灭活处理的牛血清，灭活前取样检测后若任何一项检测显示为阳性，不建议用于生产。
除非可鉴别出污染的病毒，且病毒灭活工艺验证研究显示其污染量可被有效灭活时方可使用。
如果灭活前BVDV 病毒检测为阳性，灭活后还应取样采用敏感的方法检测BVDV，结果阴性为符合要求。
未经病毒灭活处理的牛血清若任何一项检测显示为阳性，则不得用于生产。
不能用感染试验检测的牛源性病毒可采用核酸检测法，但应采用较大量的样品提取核酸（如25～50ml的血清样本），并计算合并血清的最低检出限。
