内质网分子伴侣Calnexin的研究进展

浅谈内质网生理和病理之蔡仲巾千创作潘巍①，胡刚①（①南京医科大学，神经药理学系江苏南京 210029）摘要：内质网是蛋白质合成和加工的场合，是细胞“最大的工厂”。

作为细胞内最主要的Ca++库，内质网还介入了各种细胞信号的处理。

由此可见内质网是细胞内最重要的细胞器之一，内质网功能的紊乱对于细胞来说致死性的，特别是蛋白质合成旺盛的细胞类型，如腺细胞和神经元。

内质网的正常的生理功能与细胞内[Ca++]以及氧化还原状态密切相关，而细胞内[Ca++]和局部的氧化还原状态亦是交互影响的，任何一个条件的改变均能导致内质网结构或功能的异常，即内质网病理，主要的特征是内质网应激反应（ER Stress Response）的启动。

内质网应激是细胞重要的防御机制，原核生物和真核生物均存在而且相似，进化上非常守旧。

氧化应激也是细胞信号转导系统和重要的防御机制，与内质网应激有着千丝万缕的联系，两者均对整个细胞的生理及病理有重要的“贡献”。

关键词：内质网应激（Endoplasmic Reticulum Stress, ER Stress）；粗面内质网（rough ER）滑面内质网（smooth ER）；钙库把持型通道(Store Operated Channel, SOC) ；ryanodine 受体 (RYR)；InsP3受体 (InsP3R)；Ca++引起的Ca++释放（CICR）；伴侣蛋白（chaperone）；钙网织蛋白（calreticulin）；钙联接蛋白（calnexin）；GRP78/BiP；肌浆（内质）网Ca++-ATP酶（SERCA）；NADPH氧化酶（NADPH oxidase）；未折叠蛋白反应（unfolded-protein response, UPR）；内质网相关性降解（ER associated degradation, ERAD）；内质网过载反应（ER overload response, EOR）；PERK（PKR-like ER kinase;）；Ire（inositol regulating）；ATF （activating transcription factor）；CHOP（C/EBP homologous protein）；Nrf-2（nuclear factorerythroid 2-related factor 2）；bZIP（basic-leucine zipper）；ARE（antioxidant response element）；ERSE（ER stress response element）；UPRE（unfolded protein response element）内质网是细胞内最大的膜网络结构，其两个主要功能是：1.合成、加工蛋白介入代谢；2.细胞信号处理。

内质网应激内质网应激是指由于内质网稳态受到破坏后的一系列分子、生化改变。

内质网应激包括:内质网未折叠蛋白质反应( unfolded p rotein response, UPR) [ 5, 7 ]、内质网超负荷反应和固醇调节级联反应[ 8 ]。

内质网是细胞内完成蛋白质折叠修饰的主要场所, 目前研究报道主要集中在UPR 过程。

UPR是真核细胞对于各种原因引収的内质网未折叠蛋白质积累的生存适应性反应,可通过多种从内质网腔到细胞浆或胞核的信号传导实现。

当内质网应激过度，稳态重建失败时, UPR则可以导致収生内质网负荷过度的细胞凋亡。

各种内质网应激伴侣分子在此过程中収挥了重要调控作用,是内质网应激过程中,复杂存亡控制的关键因素。

内质网伴侣主要包括Calnexin、钙网蛋白、Bip、Grp94、CHOP等。

生理情况下,内质网伴侣分子主要有以下功能:参与并监控蛋白质折叠,如Bip, Calnexin等;识别降解不能正确折叠的蛋白质,如泛素;通过钙泵贮存细胞内的钙;反馈性地调节内质网伴侣的表达量。

应激过程中内质网伴侣分子是一柄双刃剑,具有双重作用。

如Bip可以结合内质网上具有酶活性的跨膜蛋白,起到保护作用; CHOP则可以抑制Bip和抗凋亡基因Bcl22的表达,耗竭谷胱甘肽,诱导氧自由基,促进损伤、凋亡。

当损伤超过修复能力时, 内质网应激将引収细胞凋亡。

内质网有其特异的凋亡机制,在鼠类的研究结果显示,与其他凋亡机制不同,内质网収出的凋亡信号在进入凋亡的共同通路激活Caspase23 之前, 可特异性地激活Caspase212。

Caspase212位于内质网胞浆面,以前体形式存在,仅特异性地被内质网信号通路水解活化,内质网的钙离子异常可直接激活Caspase212。

激活的Caspase212进一步激活Caspase29, Caspase29激活下游的Caspase23,进入细胞凋亡的最终通路;Caspase29还可以正反馈地激活Caspase212,放大细胞凋亡作用。

内质网应激信号通路及其与细胞凋亡的关系细胞内的内质网（Endoplasmic Reticulum，ER）是一种管状的细胞器，负责蛋白质合成、修饰和折叠的过程。

然而在细胞发生某些不利的环境或病理因素时，内质网中的蛋白质质量会发生异常，导致内质网应激（Endoplasmic Reticulum Stress, ERS）的产生。

为了应对内质网应激的影响，细胞会通过内质网应激信号通路来调节内质网的功能以及启动不同的反应途径。

这些途径中包括了细胞适应性反应、细胞凋亡等，其中内源性免疫反应和肿瘤发生有着极其密切的关系。

本文将会详细讲述内质网应激信号通路及其与细胞凋亡的关系。

1. 内质网应激信号通路的调节1.1 内质网应激的主要信号通路内质网应激过程主要涉及三条信号通路：IRE1、PERK和 ATF6。

当内质网中的蛋白质质量发生异常时，IRE1、PERK和 ATF6会分别受到调节，并产生不同的效应。

IRE1主要启动的是非常重要的XBP1 途径，这个途径可以增加细胞的反应性，并且促进蛋白质合成的过程。

PERK 的激活则会抑制细胞的翻译作用，而 ATF6 的激活则可以负责修复内质网。

它们相互干扰并且形成一条复杂的信号通路。

1.2 可以调节内质网应激信号通路的因素近年来的研究表明，一些因素可以调节内质网应激信号通路。

比如说，一种必需元素硒（Se）可以抑制内质网应激通路并且缓解其伴随的炎症反应。

同时，它也能够调节氧化还原状态，增加细胞的免疫反应和肿瘤治疗的效果。

1.3 其他可调节的信号通路内质网应激信号通路的研究仍在不断深入，许多其他因素也被发现可以影响这一通路的信号传递。

例如，IDH1的不同表达与内质网应激通路有关联，而KLF4这一转录因子则可以促进内质网应激的启动，并调节肿瘤干细胞的功能和表达。

2. 细胞凋亡细胞凋亡和内质网应激密切相关，很多情况下内质网应激会导致凋亡的发生。

因为细胞凋亡特别是内质网应激诱导的凋亡在许多诸如肝癌、肺癌等肿瘤病理上扮演着重要的角色。

分子伴侣的功能和应用（天水师范学院生命科学与化学学院甘肃天水 741001）班级：09生技学号：292020123 姓名：南莉摘要：本文综述了分子伴侣的分类、功能、作用机理、研究现状及应用前景。

分子伴侣是在生物大分子的折叠、组装、转运及降解等过程中起协助作用，参与协助抗原的呈递和遗传物质的复制、转录及构象的确立，但自身并不发生任何变化的一大类广泛存在于生物体内的蛋白质分子。

随着对分子伴侣的进一步研究和相关知识的不断深入，分子伴侣在生物产品开发、物种改良、抗衰老，疾病预防、诊断和治疗以及环境监测方面具有广阔的前景。

关键词：分子伴侣；蛋白质折叠；热休克蛋白；信号传导；凋亡The function and application of molecular chaperoneAbstract: This paper discussed the classification, function, mechanism, current research progress and the appication prospect of the molecular chaperone. Molecular chaperones are a serial group of proteins which are found in all living organism, helping in the process of the folding, assembly, transportation and degradation of huge biological molecule, and participating in antigen presentation, in replication, transcription and conforma- tional decision of genetic substance. But molecular chaperones dont’t change th emselves at all when they work. With the further development of research and the associated knowledge of molecular chaperone, there will be extensive prospects of the application in exploiting bio-products, improving species, anti-aging, diagnosing and treating disease, monitoring environment and so on.Key words: molecular chaperone; protein folding; heat shock proteins; signal transduction; apoptosis第一个分子伴侣(molecular chaperone)——核质蛋白(nucleoplasmin)是Laskey 等于1978 年在非洲爪蟾(Xenopus laevis) 卵的浸出液中发现的给分子伴侣的定义是功能意义上的定义：帮助其他含多肽结构的物质在体内进行正确的组装，并且不是组装后的结构发挥其正常的生物功能的组分，它们是结构可以完全相同，也可以完全不同的蛋白质的总称。

解剖科学进展　Progress of Anatomical Sciences　2014 Jul, 20(4): 381~384内质网应激反应与相关分子伴侣12*徐 盟，王 涛（1. 中国医科大学09级临床医学；2. 东北大学生命科学与健康学院，辽宁 沈阳 110001）Endoplasmic reticulum stress and related molecular chaperones12*XU Meng ，WANG Tao （1. 2009 Clinical Medicine of China Medical University, 2. Department of Life Science and Health of North East University,Liaoning Shenyang 110001，China）【Abstract】　Many physiological or pathological conditions can cause the collection of unfolded proteins or wrong-folded proteins in endoplasmic reticulum, and cause the injury of endoplasmic reticulum's physiological functions. This phenomenon is called endoplasmic reticulum stress(ERS). During ERS, many molecular chaperones have higher expression, such as glucose-regulated proteins(GRPs), Calnexin(CNX) and calreticulin(CRT). The molecular chaperones overexpressed in some diseases such as alcoholic liver disease and Alzheimer's disease. This article aims to review basic structures and controlling processes of molecular chaperones participating in ERS and pathological mechanism of related diseases.【摘要】　多种生理或病理条件会引起未折叠蛋白或错误折叠蛋白在内质网的聚集，损伤内质网的正常生理功能，此现象称为内质网应激（endoplasmic reticulum stress, ERS）。

内质网应激和细胞衰老的分子机制研究随着现代医学和生物学的发展，人们对于细胞内部的生化过程有了更加深入的理解。

内质网应激和细胞衰老是现代生物学中的热门领域，其研究对于我们了解细胞的生命过程和疾病的发生机理都具有重要的意义。

一、内质网应激内质网是一种主要负责蛋白质合成、折叠和修饰的细胞器。

当细胞受到某些变化如氧化应激或不同的化学物质的作用时，内质网可能会受到干扰或被过载，从而导致内质网应激的发生。

内质网应激对于细胞的影响主要表现在两个方面，一是会导致蛋白质折叠的失灵，二是会激活一种细胞保护机制——不同寻常的解折叠质(response to unfolded protein)。

这种保护机制主要是通过UPR信号通路来实现的，同时还会促进凋亡和细胞存活策略的平衡。

如果UPR信号通路无法发挥作用，内质网应激会继续发展，从而导致细胞死亡。

内质网应激与多种疾病的发生密切相关，如癌症、心血管疾病、神经退行性疾病等。

二、内质网应激和细胞衰老的联系内质网应激对于细胞衰老的影响主要是通过分子机制实现的。

在内质网应激的时候，UPR信号通路会发生改变，导致细胞的生理状态发生改变，一些与衰老相关的生物分子(如ROS，炎性因子等)会被激活，从而导致细胞衰老。

同时，UPR信号通路也会直接或间接影响到细胞对基因的调控，从而影响到细胞的功能和存活。

对于细胞的衰老，内质网应激中包含的ER stress和UPR信号通路对于维持细胞的稳态也有着特殊的作用。

多位研究人员证实，短暂的内质网应激可以提高细胞的抗氧化能力、细胞凋亡和恶性转化的抵御能力、改善质量控制系统中的蛋白质折叠，从而保持细胞的正常功能。

然而，长时间、高强度的内质网应激则会导致细胞过早地衰老。

三、内质网应激与细胞衰老的分子机制研究目前，对于内质网应激与细胞衰老的相关研究仍然处于初级阶段。

然而，一些研究已经证明，在这些分子机制中，经常参与的有硫化物、ER贮存蛋白和统3。

近年来，有一些研究表明，硫化物在内质网应激和细胞衰老中扮演着重要的角色。

研究内质网应激相关蛋白质的结构和功能内质网是细胞内一种重要的膜系统，它负责合成、折叠、修饰和运输蛋白质。

通过完成这些任务，内质网有助于保持细胞的内外环境平衡，并发挥多个细胞生理学功能。

然而，内质网也面临着各种压力和挑战，例如病原体感染、药物毒性和代谢异常等因素，这些因素都可能导致内质网的应激反应，促使内质网产生一系列的结构和功能改变，从而影响细胞和个体的健康状态。

本文将介绍内质网应激相关蛋白质的结构和功能，探讨它们对细胞应激的响应机制及其在多个疾病中的作用。

一、内质网应激反应机制内质网应激反应是一种由多个信号通路和蛋白质调节器所调控的生物学过程。

在正常情况下，内质网中的蛋白质会经过正确的折叠和修饰，并在内质网内被运输到它们要去的地方。

但是，当内质网处于应激状态时，细胞会启动多个应激反应通路，以增强或恢复内质网的正常功能。

其中，IRO1（inhibitor of RNA polymerase I）和PERK（PKR-like ER kinase）通路是比较典型的内质网应激反应通路。

内质网应激反应的信号传导机制包括如下几个步骤：①由IRE1、PERK或ATF6等膜蛋白感受内质网应激信号，②感受到应激信号的膜蛋白自我磷酸化，激活相应的内生性激酶活性，③磷酸化的IRE1和PERK可以分别调节XBP1和ATF4等转录因子，促使它们在核内启动基因表达，并促进细胞存活。

这些通路的成熟度和细胞内信号转导机制，是内质网应激机制的重要组成部分。

二、内质网应激相关蛋白质的结构和功能为了更好地适应压力环境，内质网在多个不同的性质下都会形成一些新的蛋白质，这些蛋白质被称为内质网应激相关蛋白质。

内质网应激相关蛋白质大多是转录因子、分子伴侣、酶和调节蛋白等，这些蛋白质在应激反应机制中具有十分重要的功能。

1. XBP1XBP1是内质网应激反应中最为著名的转录因子之一，它的发现和研究也为内质网应激反应的理解提供了很多的帮助。

XBP1基因编码的蛋白质可以分为XBP1u 和s两种类型，在进行应激反应后，XBP1的切割酶IRE1会切割s和XBP1u两种转录因子中的一个，切割后的XBP1s能够转录大量抗应激蛋白，并在细胞内调节直接参与应激反应的一系列靶基因。

内质网应答反应在心脏疾病中的作用心脏是人体重要的器官之一，它不仅负责将氧气和营养物质输送到身体各个部分，同时还需要不断地进行自身代谢和维修。

然而，心脏疾病是影响世界上最常见的死亡原因之一，其病因机制一直备受研究者关注。

近年来，越来越多的证据表明，内质网应答反应对心脏疾病的发展和进展起到了至关重要的作用。

内质网是细胞质核心的一个复杂的膜系统，是合成蛋白质和其他生物分子的主要场所，同时还是储存钙离子的重要仓库。

内质网调节机制中的应答反应是指当内质网的功能出现异常时，细胞会通过一系列的信号通路来调节其内部稳态，避免细胞因蛋白质积累和不稳定性而出现损伤，同时也可以发生代偿性增生以恢复其正常结构和功能。

在心脏疾病中，内质网应答反应的异常活化被认为是一个重要的因素。

其中最为突出的例子就是心肌细胞增生和纤维化过程中的作用。

正常情况下，心脏病变的发生会激活内质网应答反应来保护心脏细胞免受炎症刺激和氧化损伤。

通过上调内质网内的立体构型和分子机制，心肌细胞可以极大地增强其对外界环境的适应性，从而提高心肌细胞的抵抗能力和生存力。

然而，在心脏病理生理状态下，持续的内质网应答反应的异常激活却可能引发危险的应答途径，如细胞凋亡、氧化应激和炎症反应等。

这些途径可能与深刻的心肌细胞损伤、心肌纤维化和细胞死亡有关，导致心肌重构和心脏结构的进一步恶化。

尤其是在缺氧缺血状态下，内质网应答反应会进一步增加，加速心肌细胞的死亡和心室重构，从而严重损害体内的正常生理过程。

除了心脏结构的影响，内质网应答反应的异常激活还会导致心律失常和高血压的发生。

大量研究表明，内质网中的钙离子释放和不平衡可能与肾脏修复和血管平滑肌细胞的增生有关，从而影响血管内膜的稳定性和心脏的血液供应。

这些异常可导致高血压和动脉粥样硬化等心血管疾病的发生。

因此，了解内质网应答反应在心脏疾病中的作用至关重要，并且这方面的研究正在不断展开。

一方面，我们需要开发新的干预手段和治疗方法，以恢复心脏的正常结构和功能。

苯妥英抑制心脏Cav1.2通道合成与转运的机制研究罗超迪,闫 炀,郑幸龙,韩 丹摘要 目的:探讨抗癫痫药物苯妥英(PHT )对心肌细胞(CMs )中L 型钙通道(Cav1.2)蛋白合成和转运的影响㊂方法:对无特定病原体(SPF )级雄性Sprague -Dawley (SD )乳鼠的原代CMs 分别使用不同浓度的PHT (0μg/mL ㊁0.0001μg/mL ㊁0.001μg/mL ㊁0.01μg/mL ㊁0.1μg/mL ㊁1μg/mL ㊁10μg/mL ㊁100μg/mL )干预24h 和48h ,采用CellTiter -Glo 法检测细胞活性㊂采用蛋白免疫印迹法(Western Blot )和激光扫描共聚焦显微镜分别观察PHT 对原代CMs 中Cav1.2通道蛋白合成和转运的影响㊂结果:在CellTiter -Glo 细胞活性检测中,随着苯妥英浓度的增加,除100μg/mL 组干预48h 后细胞存活率降低至85.23%(P <0.05)外,其余各组间细胞活性比较,差异均无统计学意义(P >0.05)㊂Western Blot 结果显示,100μg/mL 苯妥英干预原代CMs 时Cav1.2合成明显受到抑制,然而激光扫描共聚焦显微镜结果提示在10μg/mL 苯妥英干预原代CMs 时已出现Cav1.2转运障碍㊂结论:苯妥英可抑制心脏Cav1.2的合成和转运,可能与其可致心律失常作用相关,临床上在应用苯妥英时应仔细评估病人情况,尽可能减少副作用的产生㊂关键词 心律失常;L 型钙通道蛋白,Cav1.2;苯妥英;合成;转运d o i :10.12102/j.i s s n .1672-1349.2023.07.013 抗癫痫药物苯妥英(phenytoin ,PHT )是一种ⅠB 类抗心律失常药物,主要作用于心肌细胞的电压依赖性钠离子通道(Nav1.5)[1]㊂苯妥英用作抗心律失常药物的典型剂量为每天200~400mg ,目标血药浓度为40~70μmol/L [2]㊂然而,苯妥英引起的一些严重心脏不良反应已有报道,特别是在心律失常方面,包括心动过缓㊁窦性停搏㊁Ⅰ型Brugada 型心电图模式和心源性猝死(sudden cardiac death ,SCD )[3-6]㊂体外研究表明,苯妥英引起的心律失常可能是由于其阻断了快速激活的延迟整流钾(IKr )通道而引起的[7]㊂苯妥英通过阻断IKr 通道导致心脏复极时间延长,进而导致QT 间期延长,早期后除极(early after depolarization ,EAD )㊁延迟后除极(delayed after depolarization ,DAD )和触发活动,增加了室性复极的透壁分散,最终导致尖端扭转型室性心动过速(torsades de pointes ,TdP )甚至心室颤动(ventricular fibrillation ,VF )[8]㊂钙电流是由广泛分布于心脏组织的L 型钙通道(Cav1.2)介导的,该通道在心脏组织中发挥重要的生理作用㊂心脏Cav1.2通道参与触发兴奋-收缩耦联(excitation -contraction coupling ,EC ),控制动作电位时程(action potential duration ,APD )并且调节基因表达[9]㊂研究表明,当内向电流增加和/或外向电流减少基金项目 陕西省自然科学基础研究计划(No.2021JQ -394)作者单位 西安交通大学第一附属医院(西安710061)通讯作者 韩丹,E -mail :******************引用信息 罗超迪,闫炀,郑幸龙,等.苯妥英抑制心脏Cav1.2通道合成与转运的机制研究[J ].中西医结合心脑血管病杂志,2023,21(7):1239-1242.时会发生EADs ,导致心脏APD 延长,其中钙离子(Ca 2+)内流发挥重要作用,在这种条件下,动作电位平台期Cav 1.2通道可能重新激活并反向复极化[10]㊂研究还表明,细胞内Ca 2+循环,特别是自发Ca 2+释放是导致EADs 的原因之一[11]㊂ Cav1.2通道在心脏的起搏㊁心率㊁心律和收缩活动中发挥着关键作用[12]㊂苯妥英诱发的心律失常可能与其干扰心脏Cav1.2通道有关㊂苯妥英对胰高血糖素分泌肿瘤细胞中的Cav1.2通道的影响已有研究,但苯妥英对心肌细胞(CMs )中Cav1.2通道的作用机制尚不清楚[13]㊂本研究采用CellTiter -Glo 法探讨苯妥英对CMs 活性的影响,采用蛋白免疫印迹法(Western Blot )和激光扫描共聚焦显微镜探讨苯妥英对SD 大鼠CMs 中Cav1.2通道的合成和转运的影响㊂1 材料与方法1.1 心肌原代细胞提取 无特定病原体(SPF )级雄性Sprague -Dawley (SD )乳鼠(1~3d ,购于西安交通大学医学部动物实验中心)10只,乙醇消毒后将心脏剪下并将心室肌组织剪碎成约1mm 3组织块,在不含钙离子和镁离子的磷酸盐缓冲液(phosphate buffer saline ,PBS )(Hyclone )中冲洗2次,向组织块中加入2mL 胰蛋白酶(索莱宝,T1300)和Ⅱ型胶原酶(索莱宝,C8150),37ħ水浴锅中轻微震荡,取出上清,并在上清中加入含有10%胎牛血清和1%青霉素-链霉素(Hyclone )的DMEM/F -12培养基(Corning ),重复7次,前4次每次振荡5min ,后3次每次振荡7min ㊂用铁筛将消化后的液体过滤,将收集到的液体以800r/min 离心5min ㊂弃上清液,然后用DMEM -F12完全培养基重悬细胞并培养㊂培养45min后,心肌成纤维细胞贴壁,取上清液,同时在上清液中加入抑制剂,上清液即为原代心肌细胞㊂1.2苯妥英配制苯妥英(S2525,Selleck)溶解于二甲基亚砜(DMSO)(碧云天,ST038)中,储存液浓度为20mg/mL,-20ħ保存,每次实验前用生理盐水连续稀释至最终使用浓度㊂实验过程中DMSO的最终含量不超过0.05%㊂1.3细胞干预及CellTiter-Glo法测定细胞活力CellTiter-Glo法是基于ATP检测的快速细胞活力检测法[14]㊂将原代CMs接种于96孔板(100μL,5ˑ104个/mL细胞,5000个/孔细胞),待细胞充分贴壁后换用无血清培养基饥饿12h后,分别使用含0μg/mL㊁0.0001μg/mL㊁0.001μg/mL㊁0.01μg/mL㊁0.1μg/mL㊁1μg/mL㊁10μg/mL㊁100μg/mL㊁100μg/mL苯妥英的完全培养基干预细胞并进行分组,然后在37ħ㊁5% CO2环境中分别孵育24h和48h(1μg/mL苯妥英ʈ3.96μmol/L苯妥英)㊂每孔加入CellTiter-Glo试剂和DMEM(Corning)各50μmol/L,在避光条件下于培养箱中孵育10min㊂使用Tecan Infinite M1000酶标仪(Tecan Austria GmbH,Grödig,Austria)记录结果㊂重复该实验至少3遍至结果保持稳定㊂1.4Western Blot测定Cav1.2蛋白水平将原代CMs(n=1250)接种于直径35mm的培养皿(中国香港NEST Biotechnology公司)内,待细胞充分贴壁后换用无血清培养基饥饿12h后,分别使用含0μg/mL㊁10μg/mL㊁30μg/mL㊁100μg/mL苯妥英的完全培养基干预细胞48h后提取蛋白㊂每1mL蛋白裂解液RIPA(碧云天,P0013B)中加入20μL(50ˑ)蛋白酶抑制剂储存液(碧云天,P1005),使抑制剂的最终浓度为1mmol/L㊂吸去上清液后,用PBS清洗培养皿3次,加入100μL蛋白裂解液,在冰上用细胞刮刀轻刮细胞,每次5min,3次后将液体转移至1mL EP管中,冰上孵育30min,旋涡振荡3次,于4ħ,半径12cm, 12000r/min离心30min,将上清液转移至干净EP管内,用蛋白定量试剂盒(中晖赫彩,PQ003)测定各组样本蛋白质浓度,分装后置于-80ħ冰箱保存㊂取蛋白样品40g进行聚丙烯酰胺凝胶电泳,然后转移至硝酸纤维膜(碧云天,FFP39),室温下使用50g/L牛血清清蛋白的TBST封闭硝酸纤维膜2h,再加入羊抗鼠Cav1.2抗体(Abcam,ab58552)中4ħ孵育过夜㊂TBST缓冲液洗涤3次后加入辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG二抗(博奥森,bs-80295G-HRP)孵育1h,将膜用TBST缓冲液洗涤3次后加入超敏化学发光试剂(碧云天,P0018FS),曝光㊁成像㊂用Quantity One 分析软件测定各条带灰度值,结果用目的条带的灰度值/β-actin条带的灰度值表示㊂1.5Cav1.2蛋白的表达定位将原代CMs(1250个)接种于直径35mm的培养皿(香港NEST Biotechnology公司)内,待细胞充分贴壁后换用无血清培养基饥饿12h后,分别使用含0μg/mL和10μg/mL 苯妥英的完全培养基干预细胞48h后连续孵育抗CACNA1C抗体(Abcam,ab58552),抗Calnexin抗体(Invitrogen,MA3-027),Hoechest(Sangon,E607329)㊂洗涤后与辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG二抗(Invitrogen,1832035)孵育,细胞图像采用FV1000激光扫描显微镜(德国Leica,DM2500)获取㊂1.6统计学处理采用SPSS22.0软件进行数据分析㊂符合正态分布的定量资料以均数ʃ标准差(xʃs)表示,方差齐性检验采用Levene检验㊂两组间比较采用Dunnett't检验和独立样本t检验㊂以P<0.05为差异有统计学意义㊂2结果2.1CellTiter-Glo法检测苯妥英对细胞活力的影响随着苯妥英浓度的增加,除100μg/mL组在干预48h 时的细胞存活率降低到85.23%(P<0.05)外,其余各组间细胞存活率比较,差异均无统计学意义(P> 0.05)㊂详见图1㊂2.2Western Blot检测苯妥英对Cav1.2蛋白合成的影响根据CellTiter-Glo实验和前期实验结果[7],本研究选择了不同浓度的苯妥英(0μg/mL㊁10μg/mL㊁30μg/mL㊁100μg/mL)干预原代CMs48h后提取细胞蛋白㊂采用Western Blot评价不同浓度苯妥英对原代CMs中Cav1.2通道蛋白合成的影响㊂结果显示,100μg/mL苯妥英组明显降低了原代CMs中Cav1.2蛋白的合成,与0μg/mL组细胞比较,差异有统计学意义(P<0.05)(见图2㊁图3)㊂因此,认为苯妥英在超过治疗水平的较高浓度下可能导致Cav1.2通道蛋白合成异常㊂与0μg/mL苯妥英组比较,*P<0.05㊂图1不同浓度苯妥英干预后细胞活力比较图2Cav1.2及β-actin 蛋白免疫印迹与0μg/mL苯妥英组比较,*P<0.05㊂图3Cav1.2蛋白表达定量图2.3激光扫描共聚焦显微镜观察苯妥英对Cav1.2蛋白转运的影响为确定苯妥英对Cav1.2蛋白转运的影响,使用激光扫描共聚焦显微镜评估0μg/mL和10μg/mL苯妥英干预组原代CMs染色图像(见图4),对照组抗CACNA1C抗体荧光(红色)主要出现在细胞表面,表明Cav1.2蛋白从内质网正常转运到细胞膜㊂然而,10μg/mL干预组细胞图像显示,Cav1.2通道蛋白从内质网转运至细胞膜受阻,红色荧光从膜上消失, Calnexin是内质网膜上作为分子伴侣参与新生肽链的折叠㊁加工的蛋白质,抗Calnexin抗体荧光(绿色)集中分布在内质网膜上,说明10μg/mL苯妥英干预后Cav1.2蛋白由内质网转运至细胞膜受阻㊂尽管苯妥英在100μg/mL水平开始抑制Cav1.2通道蛋白的合成,但在治疗剂量范围内可诱导蛋白转运功能障碍㊂以上结果表明,苯妥英易导致Cav1.2通道蛋白转运异常㊂图4原代CMs亚细胞水平Cav1.2蛋白定位图像(A㊁B㊁C㊁D为无苯妥英干预的原代CMs的图像,E㊁F㊁G㊁H为10μg/mL苯妥英干预的原代CMs的图像㊂蓝色标记细胞核,绿色标记Calnexin,红色标记Cav1.2)3讨论苯妥英于1938年作为一种抗癫痫药物引入临床,后来又作为抗心律失常药物被用于心血管领域[15]㊂近年来,心电生理领域对苯妥英不良反应的认识逐渐深入㊂苯妥英的致心律失常作用是由于其阻断了心肌细胞离子通道,其中Cav1.2通道在调节心率和心律方面发挥重要作用[16]㊂本研究评估了苯妥英对原代CMs中Cav1.2蛋白合成和转运的影响,结果显示,苯妥英对心脏Cav1.2通道蛋白表达的抑制具有浓度依赖性;Western Blot显示,100μg/mL苯妥英导致Cav1.2通道蛋白合成显著降低;苯妥英干预后的细胞荧光照片显示,Cav1.2通道蛋白从内质网转运到细胞膜表面的过程出现异常㊂苯妥英虽然仅在大于治疗剂量上抑制了Cav1.2的合成,但仍可在治疗剂量范围内诱导蛋白转运功能障碍,这或许可以部分解释苯妥英的致心律失常作用;也有可能是由于苯妥英对Nav1.5通道的抑制作用使Na+电流降低,抑制Ca2+/钙调蛋白依赖性蛋白激酶Ⅱ(Ca2+/calmodulin-dependent protein kinasesⅡ,CaMKⅡ)的活性,进而导致Cav1.2通道蛋白表达降低㊂因此,苯妥英对CMs Cav1.2蛋白的影响也可通过Na+和Ca2+阻滞剂干预进一步探究㊂Abrahamsson等[17]研究发现,较低水平的苯妥英导致心动过缓,而随着苯妥英浓度的增加,逐渐出现室性心律失常㊁其他严重的心脏不良反应,如致命性室性心律失常,Ⅰ型Brugada型心电图㊁低血压㊁窦性停搏和SCD也有报道[5-6,18]㊂苯妥英抑制Cav1.2蛋白的合成和转运,可能导致Ca2+电流降低,从而导致内质网偶联功能障碍,从而阻碍相邻心肌细胞电活动的传导㊂随着Ca2+电流的降低,IKr相对增加,促进APD 明显缩短,心室复极跨壁离散度增加,导致ST段抬高,J波形成,甚至 R on T ,最终导致心室颤动[19-20]㊂这些级联反应在一定程度上可以解释苯妥英引起的心律失常㊂另有研究显示,苯妥英成功纠正了用传统治疗方法难以纠正的TdP病人的心律失常[21-22]㊂苯妥英的抗心律失常作用包括降低心室自律性㊁交感放电和增加房室传导速度[21]㊂由于苯妥英对Cav1.2通道的抑制作用,本研究结果显示,苯妥英在不同的个体中表现出促心律失常作用或抗心律失常作用㊂因此,苯妥英的用药是一把双刃剑,在选择用药中应综合评价苯妥英的个体风险获益比,以减少不良反应的发生㊂综上所述,本研究验证了苯妥英对心脏Cav1.2通道的影响,苯妥英以浓度依赖性的方式抑制Cav1.2通道,改变Cav1.2蛋白合成并干扰通道蛋白运输,这可能是苯妥英促心律失常作用的原因㊂参考文献:[1]GALLOP K.Review article:phenytoin use and efficacy in the ED[J].Emergency Medicine Australasia:EMA,2010,22(2):108-118.[2]KOWEY P R.Pharmacological effects of antiarrhythmic drugs.Review and update[J].Archives of Internal Medicine,1998,158(4):325-332.[3]ZONERAICH S,ZONERAICH O,SIEGEL J.Sudden death followingintravenous sodium 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内质网内的泛素化机制当蛋白质经过内质网（endoplasmic reticulum，ER）的时候，会有一套―质控‖系统暂时将那些新合成的蛋白质―扣留‖下来，帮助它们成熟。

只有折叠正确的蛋白质才会被―释放‖，而那些不能成熟的蛋白质则会被继续―关押‖，但是这样会损害内质网的功能。

因此，为了维持内环境的稳态，蛋白质质控系统会将这些―不合格产品‖移交到胞质溶胶当中，在那里，被蛋白酶体降解掉。

随着在越来越多的病理过程当中发现了内质网质控系统功能缺陷的现象，我们也开始逐渐意识到细胞内这条作用机制的重要性。

在所有人类基因组编码的蛋白质当中，大约有20%的蛋白质被认为是分泌性蛋白质。

这些分泌性蛋白质在到达它们的最终的目的地之前都需要先经过内质网的处理，这些目的地广泛分布在细胞各种，例如细胞膜上，各种胞内或胞外的腔室（Exocytotic and endocytotic compartments），以及细胞外表面等等。

内质网不仅仅只是提供了一个―容器‖，它同时还提供了众多的分子伴侣，帮助蛋白质折叠、成熟。

不过虽然细胞提供了这些帮助，蛋白质在合成过程当中仍然非常容易出错。

大约有1/3的新生蛋白质会在翻译过程中或者在翻译后数分钟之内被降解掉。

这些蛋白质是因为在转录过程、翻译过程、成熟过程或折叠过程中出现了某些错误，或者各个亚基之间的合成不平衡，从而不能形成正确的构象而被降解的。

即使是成熟的蛋白质也会因为各种诸如高能辐射、化学损伤、代谢产物等等环境因素而被损伤。

这些损伤蛋白会聚集在一起，也会出现功能障碍，这都会影响到内质网以及细胞内环境的稳态。

因此，进化机制赋予了内质网控制蛋白质质量的功能，这套质控系统可以在好几个层面对蛋白质进行监控，维持内质网的完好性。

在蛋白质刚刚合成时它们会通过一个特异性的N连接聚糖（N-linked glycan structure）结构被保护起来，可以免遭降解。

随后，那些可能发生错误折叠的蛋白质会被内质网中甘露糖苷酶（mannosidase）生成的一种―聚糖密码（glycan code）‖所标记（图1）。

细胞生物学论文细胞凋亡与内质网的研究进展内质网细胞凋亡与内质网的研究进展生物技术10-2 李大云摘要：内质网是细胞凋亡信号传导途径中起重要作用的细胞器;细胞凋亡，是生物体细胞的主动消亡过程，是多细胞生物体调控机体发育、控制细胞衰老、维持内环境更稳定的重要仍然维持机制。

细胞凋亡发生过程的启动和进行受到精确调控，具有独特而复杂的信号系统。

各种凋亡信号通过信号通路传至细胞内，激活靶分子底物而产生蛋白效应，引发细胞凋亡。

一般认为，细胞凋亡存在三条主要通路：线粒体通路、内质网谢利谢通路和死亡受体通路，各通路间有互相联系，共同动态平衡细胞凋亡。

关键词：内质网、细胞凋亡细胞凋亡是细胞的程序性死亡，重要环节是生物体孕期的一个重要环节，我们非常有必要学术研究促使细胞凋亡的因子，现在，让调节我们看下内质网是如何调节蛋白质凋亡的。

细胞凋亡的概念及其生物学意义细胞凋亡是一个主动的由基因决定的自动结束生命的过程。

由于细胞凋亡遭到受到严格的由遗传机制决定的程序性调控，所以也常常被称为细胞编程性死亡。

在生物的生长发育过程中，细胞凋亡是不可或缺的一个重要方面。

细胞凋亡对于多细胞生物个体发育的正常进行，自稳平衡的保持以及抵御外界各种因素的干扰方面都起着非常关键的作用。

通过细胞凋亡，母体得以清除不再需要的细胞，而不引起发炎反应。

在发育过程中，幼体的缩小和退化如蝌蚪尾的消失等，都是通过细胞的清除也是通过细胞凋亡来实现的。

在成熟个体的组织中，细胞的自然更新，被病原体感染呼吸道细胞的封堵也是通过PCD来完成的。

是所有多细胞组织的重要的基本功能。

凋亡发生的生物化学和形态变化在从线虫到人类的种属不同问高度保守，对于胚胎发育和正常细胞稳态的维持有非常重要的。

凋亡证明细胞现已功能的丧失可以促进肿瘤和自身免疫疾病的频发；而凋亡过度又可以引发退行性扭曲，肾病如免疫缺陷和神经系统退行性慢性等。

所以凋亡过程的正确调控有著对机体具有极其重要的意义。

多种因素可以触发增生。

内质网应激和细胞自噬研究进展近年来，内质网应激和细胞自噬研究成为细胞生物学领域的热点，相关研究不仅在细胞本质上有很大的意义，也对多种疾病的治疗产生了重要的影响。

本文将从内质网应激和细胞自噬的基本概念开始，分别介绍这两种现象的基本过程和相关研究进展，并探讨其在疾病治疗中的应用前景。

一、内质网应激及其研究进展内质网是细胞内的一种特殊的细胞器，存在于细胞质中，对于细胞的正常生理功能扮演着重要的作用。

内质网主要负责蛋白质的合成和修饰，同时也参与了其他多个细胞功效的调节。

然而，当细胞遭遇各种不良刺激，如化学毒性、紫外线辐射等，会导致内质网的正常结构和功效被破坏，这种情况被称为内质网应激。

内质网应激引起了许多生理学家和生物学家的关注，他们尝试通过研究发现内质网应激的相关分子机制，以及内质网应激对细胞和生物体的影响。

关于内质网应激的发生和作用机制，一般认为有两种基本模型: 第一种是蛋白质合成和修饰的失衡模型，即应激情况下导致内质网内蛋白质的数量大大增加，导致内质网无法正常处理这些蛋白质的情况，最终诱导内质网应激；第二种是残解应激模型，即一些蛋白质分子会因应激情况而在细胞内出现残解情况，导致内质网的正常功能被破坏所造成的应激状况。

研究表明，内质网应激与多种疾病密切相关。

例如，糖尿病、哮喘、阿尔茨海默病等疾病都存在着内质网应激的情况，理解内质网应激对于这些疾病的治疗和预防非常重要。

目前的研究成果表明，蛋白质折叠及其相关病理机制、炎症反应、自噬、杂交、细胞死亡等多个因素涉及了内质网应激的发生过程。

二、细胞自噬的基本概念和研究进展细胞自噬是细胞内的另一种重要生理现象，它是细胞自身垃圾循环利用的过程。

细胞自噬具有高度的保守性，其基本过程包括物质在胞浆中的包涵、延伸、成熟、合并至细胞质质膜形成自噬体、消化降解而成小分子物质等多个过程。

细胞自噬可以被划分为三种基本类型，分别是微型自噬、自噬体外质膜自噬和细胞器自噬。

细胞自噬是细胞内环境平衡的保障机制，它对于生物体通过代谢作用维持稳定的内部环境具有重要的作用。

一、实验背景内质网是真核生物细胞内的重要细胞器，负责蛋白质的合成、折叠、修饰和运输等功能。

在正常生理条件下，内质网能够有效处理和折叠蛋白质，维持细胞内环境的稳定。

然而，在特定条件下，如蛋白质合成过多、蛋白质折叠错误或内质网功能异常等，会导致内质网内未折叠或错误折叠蛋白质的积累，从而引发内质网应激（endoplasmic reticulum stress，ERS）。

本研究旨在通过观察内质网应激现象，探讨其与细胞损伤、疾病发生的关系。

二、实验材料与方法1. 实验材料细胞系：HEK293细胞试剂：内质网应激相关抗体（如GRP78、IRE1α、PERK等）、细胞裂解液、Western blot试剂盒等2. 实验方法（1）细胞培养：将HEK293细胞接种于培养瓶中，在37℃、5%CO2的细胞培养箱中培养至对数生长期。

（2）处理细胞：将细胞分为正常对照组和内质网应激组。

内质网应激组采用化学诱导剂（如氧化剂、糖基化剂等）或基因沉默等方法诱导内质网应激。

（3）细胞裂解：收集细胞，用细胞裂解液裂解细胞，提取细胞总蛋白。

（4）Western blot检测：将提取的细胞总蛋白进行SDS-PAGE电泳，转膜后用内质网应激相关抗体进行免疫印迹检测。

（5）数据分析：采用ImageJ软件对Western blot结果进行分析，计算目的蛋白与内参蛋白的灰度值比值，进行定量分析。

三、实验结果1. 内质网应激诱导蛋白表达变化Western blot结果显示，内质网应激组细胞中GRP78、IRE1α、PERK等内质网应激相关蛋白的表达水平显著高于正常对照组（P<0.05）。

2. 内质网应激与细胞损伤通过观察细胞形态变化，发现内质网应激组细胞出现细胞膜皱缩、细胞核变形等损伤现象，提示内质网应激可导致细胞损伤。

3. 内质网应激与疾病发生进一步研究发现，内质网应激与多种疾病的发生密切相关。

如糖尿病、心血管疾病、神经退行性疾病等。

在疾病模型中，内质网应激现象普遍存在，提示内质网应激可能成为疾病治疗的新靶点。

网络出版时间：２０２２－０５－２８１７：２６　网络出版地址：ｈｔｔｐｓ：／／ｋｎｓ．ｃｎｋｉ．ｎｅｔ／ｋｃｍｓ／ｄｅｔａｉｌ／３４．１０６５．Ｒ．２０２２０５２６．１０１５．００２．ｈｔｍｌ高糖环境下肾小管上皮细胞来源外泌体诱导巨噬细胞向肌成纤维细胞转化王　东１，２，吴永贵１，齐向明１２０２２－０３－１５接收基金项目：国家自然科学基金（编号：８１７７０７２２）作者单位：１安徽医科大学第一附属医院肾脏内科，合肥　２３００２２２随州市中心医院肾脏内科，随州　４４１３００作者简介：王　东，女，硕士研究生；齐向明，男，教授，博士生导师，责任作者，Ｅ ｍａｉｌ：ｑｘｍ１１９＠１２６．ｃｏｍ摘要　目的　探讨高糖环境下肾小管上皮细胞来源外泌体诱导巨噬细胞向肌成纤维细胞转化的作用与机制。

方法　正常糖（５ ５ｍｍｏｌ／Ｌ）及高糖（３０ ０ｍｍｏｌ／Ｌ）分别处理人肾小管上皮细胞（ＨＫ２）４８ｈ，收集上清液提取并鉴定外泌体；观察人急性单核细胞白血病细胞株（ＴＨＰ １）巨噬细胞是否吞噬ＰＫＨ６７标记的外泌体；通过检测诱导性氮氧化物合酶（ｉＮＯＳ）、α 平滑肌肌动蛋白（α ＳＭＡ）、甘露醇受体（ＣＤ２０６）的表达，以确定分化为Ｍ１和Ｍ２型巨噬细胞的最佳浓度及时间点；激光共聚焦检测ＣＤ２０６与α ＳＭＡ、ＩＶ型胶原（Ｃｏｌ ＩＶ）、纤维连接蛋白（ＦＮ）的荧光共表达。

ｑＲＴ ＰＣＲ与ＥＬＩＳＡ法测定转化生长因子受体 β１（ＴＧＦ β１）、白细胞介素（ＩＬ） １０、ＩＬ ６水平。

Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ测定ＴＧＦ β１、Ｓｍａｄ３和ｐ Ｓｍａｄ３蛋白表达。

结果　上清液离心获取标本后检测到白细胞分化抗原群６３（ＣＤ６３）和肿瘤易感基因１０１蛋白（ＴＳＧ１０１）阳性、内质网分子伴侣蛋白（Ｃａｌｎｅｘｉｎ）阴性，确认为外泌体并且纯度较高；ＴＨＰ １巨噬细胞能够吞噬各组外泌体；各组外泌体刺激的最佳浓度为４０ｍｇ／Ｌ、最佳时间为９６ｈ。

高糖外泌体刺激２４ｈ巨噬细胞以Ｍ１型为主，９６ｈ则以Ｍ２型为主。

DOI: 10.13376/j.cbls/2014144文章编号：1004-0374(2014)10-1004-08∙ 评述与综述∙内质网应激与脂类代谢孟冉1，阮国良1，杨代勤1,2,3*(1 长江大学动物科学学院，荆州434025；2 淡水水产健康养殖湖北省协同创新中心，摘要：内质网应激激活的未折叠蛋白反应(unfol ded protein response, UPR) 是维持机体代谢平衡的重要信号通路。

同时，内质网与脂类合成、转运和分解密切相关。

近来研究发现UPR 对脂类代谢具有调节作用。

主要讨论内质网应激激活的UPR 对脂类合成、转运和分解的影响及其机制。

关键词：内质网应激；脂类合成；脂类转运；脂解中图分类号：Q257 ；Q291文献标志码：AIntersection of ER stress and lipid metabolismMENG Ran1, RUAN Guo-Liang1, Y ANG Da i-Qin1,2,3*(1 College of Animal Science, Y angtze University, Jingzhou 434025, China;2 Hubei Collaborative Innovation Center for Freshwater Aquaculture, Wuhan 430070, China;3 Engineering R esearchCenter of Ecology and Agricultural Use of Wetland, Ministry of Education, Jingzhou 434025, C hina)Abstract: The unfolded protein response (UPR) was identified as a signal transducti on system that i s activated by endoplasmic reticulum (ER) stress. Recent studies revealed a critical role of the UPR in lipid metabolism. This paper focuses on the mechani sm of ER stress-induced signalings on lipogenesis, lipid transport and lipolysis.Key words: endoplasmic reticulum stress; lipogenesi s; lipid transport; lipolysi s机体代谢网络需要对摄入的各种形式的能量( 脂肪、蛋白质和糖) 作出适应性反应[1]。

内质网应激反应机制研究内质网是细胞内的一个复杂系统，它在调节蛋白质折叠过程中发挥着重要的作用。

在这个系统出现问题时，它所造成的应激反应被称为内质网应激（ER stress）。

随着近几年内质网应激研究的诸多进展，它成为了人们关注的热点之一。

内质网应激发生的机理主要是蛋白质合成过程出现异常，而这种异常的表现则是由内质网分泌信号分子开启的信号通路所引发。

目前，已知有3条信号通路与内质网应激有关。

第一条路线即是“内质网应激感知器-内源性抗病毒干扰素（IRE1-Endoplasmic reticulum-to-nucleus signaling 1）”，这是它目前被发现的第一个应激感知途径。

第二条路线即是“糖苷酶端类蛋白X-box结合蛋白1（ATF6-XBP1）”。

它的突然激活是由于其底物ATF6从内质网膜中释放出来。

XBP1则在一个调节启动的内嵌结构区域上修饰自己的mRNA。

第三条通路是“zinc finger protein（ZNF）-protein kinase R-like」（PKRL）这一条路线的初始活动是在Ire1α等含锌结构域蛋白上激活，最后导致了初级细胞死亡过程。

对于细胞而言，内质网应激反应的发生预示着细胞新陈代谢出现了问题。

细胞在内质网应激反应发生的过程中，会定期触发它的自我保护机制。

这对于细胞来说，是一种十分重要的机制，有助于细胞有效地维持了它的正常功能。

内质网应激反应会对细胞发生正面和负面的影响。

在某些疾病发生的过程中，内质网应激会对细胞发挥着保护作用。

例如在肝细胞基因不稳定性的发生过程中，内质网应激可以防止细胞合成DNA产生错误；在贝茵-巴雷症严重损伤的生命体内，内质网应激可以在维持细胞活力的同时，消除瓦解细胞产生的不良后果。

相反，某些疾病的发生与内质网应激也紧密相关。

例如糖尿病、阿尔茨海默氏病、肺部疾病等一系列疾病就与内质网应激有关。

因此，研究内质网应激反应机制对于诊断与治疗疾病都有着极为重要的价值。