阻塞性睡眠呼吸暂停低通气综合征患者缺氧激活通路的研究

因两转录因子均有 ２ 个以上的亚基组成，故测 定活性亚基 ＮＦ鄄κＢ ｐ６５ 和 ＨＩＦ鄄１α 的基因和蛋白表 达水平。 １．２．２ Ｒｅａｌ鄄ｔｉｍｅ ＰＣＲ 检 测 ＮＦ鄄κＢ ｐ６５ｍＲＮＡ、 ＨＩＦ鄄１αｍＲＮＡ： 取 １ ｍL 以上浓度细胞，ＴＲＩＺＯＬ 法 提取总 ＲＮＡ。 逆转录反应按照试剂盒说明书进行 （ＴａＫａＲａ，日本）ｃＤＮＡ 合成条件：３７ ℃ ３０ ｍｉｎ，８５ ℃ ６ ｓ，１２ ℃。 Ｒｅａｌ ｔｉｍｅ ＰＣＲ 反应采用 ＴａＫａＲａ ＳＹＢＲ 试剂盒，构建 １０ μL 反应体系（引物设计为：β鄄ａｃｔｉｎ： 上游 ５′鄄ＴＧＧＣＡＣＣＣＡＧＣＡＣＡＡＴＧＡＡ鄄３′，下游 ５′鄄ＣＴ ＡＡＧＴＣＡＴＡＧＴＣＣＧＣＣＴＡＧＡＡＧＣＡ鄄３′；ＮＦ鄄κＢｐ６５：上 游 ５′ 鄄ＧＧＧＡＴＧＧＣＴＴＣＴＡＴＧＡＧＧＣＴＧＡ鄄３′ 下 游 ５′ 鄄 ＧＧＴＣＴＧＧＡＴＧＣＧＣＴＧＡＣＴＧＡ鄄３′ ；ＨＩＦ鄄１α： 上 游 ５′ 鄄 ＴＣＴＧＧＧＴＴＧＡＡＡＣＴＣＡＡＧＣＡＡＣＴＧ鄄３′下游 ５′鄄ＣＡＡ ＣＣＧＧＴＴＴＡＡＧＧＡＣＡＣＡＴＴＣＴＧ鄄３′），Ｒｅａｌ ｔｉｍｅ ＰＣＲ反 应条件：９５ ℃变性 １０ ｓ，６０ ℃退火 ２０ ｓ，７２ ℃延伸 ３０ ｓ， 共 ３９ 个循环，７２ ℃终末延伸 ５ ｍｉｎ。 １．２．３ Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ 检测 ＮＦ鄄κＢｐ６５ 与 ＨＩＦ鄄１α 蛋 白： 取 ２ ｍL 以上浓度细胞， 按核蛋白提取试剂盒 （ＭＥＲＣＫ，美国）说明书提取核蛋白，ＢＣＡ 法测定蛋 白浓度， 变性后每孔上样量为 ２０μｇ，８％聚丙烯酰
关键词 阻塞性睡眠呼吸暂停低通气综合征； 缺氧诱导因子－１； 核因子－κＢ
Ｔｈｅ ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｐａｔｈｗａｙｓ ｂｙ ｈｙｐｏｘｉａ ｉｎ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ Ｏｂｓｔｒｕｃｔｉｖｅ ｓｌｅｅｐ ａｐｎｅａ ｈｙｐｏｐｎｅａ ｓｙｎｄｒｏｍｅ ＬＵＯ Ｌｉｎｇ鄢， ＧＡＯ Ｘｉｎｇ鄄ｌｉｎ， ＬＩ Ｄｏｎｇ鄄ｆｅｎｇ， ＬＵＯ Ｓｈａｏ鄄ｈｕａ， ＷＵ Ｊｉａｎ， ＬＩＮ Ｑｉ， ＯＵ Ｑｉｏｎｇ， ＣＥＮ Ｒｕｉ鄄ｊｉｎ． 鄢 Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ， Ｇｕａｎｇｄｏｎｇ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｈｏｓｐｉｔａｌ， Ｇｕａｎｇｚｈｏｕ ５１００８０， Ｃｈｉｎａ Ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇ ａｕｔｈｏｒ： ＧＡＯ Ｘｉｎｇ鄄ｌｉｎ Ｅ鄄ｍａｉｌ： ｘｉｎｇｌｉｎｇａｏ＠ｈｏｔｍａｉｌ．ｃｏｍ
【Ａｂｓｔｒａｃｔ】 Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ Ｔｏ ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅ ｔｈｅ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ ｎｕｃｌｅａｒ ｆａｃｔｏｒ鄄Ｂ （ＮＦ鄄Ｂ）ａｎｄ ｈｙｐｏｘｉａ鄄ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ ｆａｃｔｏｒ鄄１ （ＨＩＦ鄄１）ｉｎ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｏｂｓｔｒｕｃｔｉｖｅ ｓｌｅｅｐ ａｐｎｅａ鄄ｈｙｐｏｐｎｅａ ｓｙｎｄｒｏｍｅ （ＯＳＡＨＳ）． Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｓｕｂｊｅｃｔｓ ｗｅｒｅ ｃｌａｓｓｉｆｉｅｄ ｉｎｔｏ ｍｉｌｄ鄄ｔｏ鄄ｍｏｄｅｒａｔｅ ＯＳＨＡＳ ｇｒｏｕｐ （ｎ ＝ １６）， ｓｅｖｅｒｅ ＯＳＡＨＳ ｇｒｏｕｐ （ｎ ＝ １４） ａｎｄ ｔｈｅ ｍａｔｃｈｅｄ ｃｏｎｔｒｏｌ ｇｒｏｕｐ （ｎ ＝ ３０）． Ｇｅｎｅ ａｎｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｓ ｏｆ ＮＦ鄄Ｂ ａｎｄ ＨＩＦ鄄１ ｗｅｒｅ ｍｅａｓｕｒｅｄ ｂｙ ＲＴ鄄ＰＣＲ， Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ ｉｎ ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｂｌｏｏｄ ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ ｃｅｌｌｓ （ＰＢＭＣ）． Ｒｅｓｕｌｔｓ ＮＦ鄄κＢ ｐ６５ ｍＲＮＡ ａｎｄ ＮＦ鄄κＢ ｐ６５ ｐｒｏｔｅｉｎ，ＨＩＦ鄄１α ｍＲＮＡ ａｎｄ ＨＩＦ鄄１α ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｎ ＰＢＭＣ ｗｅｒｅ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ ｈｉｇｈｅｒ ｉｎ ｓｅｖｅｒｅ ＯＳＡＨＳ ｇｒｏｕｐ ｔｈａｎ ｔｈｏｓｅ ｉｎ ｍｉｌｄ – ｔｏ鄄ｍｏｄｅｒａｔｅ ｇｒｏｕｐ ａｎｄ ｃｏｎｔｒｏｌ ｇｒｏｕｐ （Ｐ ＜ ０．０１）． Ｂｕｔ ｔｈｅｒｅ ｗｅｒｅ ｎｏ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ ｉｎ ＮＦ鄄κＢ ｐ６５ ｍＲＮＡ ａｎｄ ＮＦ鄄κＢ ｐ６５ ｐｒｏｔｅｉｎ ｂｅｔｗｅｅｎ ｍｉｌｄ鄄ｔｏ鄄ｍｏｄｅｒａｔｅ ｇｒｏｕｐ ａｎｄ ｃｏｎｔｒｏｌ ｇｒｏｕｐ （Ｐ ＝ ０．０６８， Ｐ ＝ ０．２５４ ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ）． Ｏｎｌｙ ｇｅｎｅ （Ｐ ＜ ０．０５） ｎｏｔ ｔｈｅ ｐｒｏｔｅｉｎ （Ｐ ＝ ０．７７７） ｏｆ ＨＩＦ鄄１α ｗａｓ ｈｉｇｈｅｒ ｉｎ ｍｉｌｄ鄄ｔｏ鄄ｍｏｄｅｒａｔｅ ａｓ ｃｏｍｐａｒｅｄ ｗｉｔｈ ｃｏｎｔｒｏｌ ｇｒｏｕｐ． Ｂｏｔｈ ＮＦ鄄κＢ ｐ６５ ｍＲＮＡ ａｎｄ ＨＩＦ鄄１α ｍＲＮＡ ｗｅｒｅ ｐｏｓｉｔｉｖｅｌｙ ｃｏｒｒｅｌａｔｅｄ ｗｉｔｈ ＡＨＩ （ｒ ＝ ０．４９３， Ｐ ＝ ０．００６， ｒ ＝ ０．５０８， Ｐ ＝ ０．００４）， ｗｈｉｌｅ ｎｅｇａｔｉｖｅｌｙ ｃｏｒｒｅｌａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｎｉｇｈｔｔｉｍｅ ｌｏｗｅｓｔ ｂｌｏｏｄ ｏｘｙｇｅｎ ｓａｔｕｒａｔｉｏｎ （ＬＳａＯ２）（ｒ ＝ －０．４８８， Ｐ ＝ ０．００６， ｒ ＝ －０．４６， Ｐ ＝ ０．０１１）． Ｔｈｅｒｅ ｗａｓ ａ ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ ｂｅｔｗｅｅｎ ＮＦ鄄κＢ ｐ６５ ｐｒｏｔｅｉｎ ｌｅｖｅｌ ａｎｄ ＡＨＩ （ｒ ＝ ０．６６９， Ｐ ＜ ０．００１）． ＨＩＦ鄄１α ｐｒｏｔｅｉｎ ｌｅｖｅｌ ｗａｓ ｐｏｓｉｔｉｖｅｌｙ ｃｏｒｒｅｌａｔｅｄ ｗｉｔｈ ＡＨＩ， ＯＤＩ （ｒ ＝ ０．６２８， Ｐ ＝ ０．００１； ｒ ＝ ０．４８０， Ｐ ＝ ０．０１８）． Ｔｈｅｒｅ ｗｅｒｅ ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎｓ ｂｅｔｗｅｅｎ ＮＦ鄄κＢｐ６５ｍＲＮＡ ａｎｄ ＨＩＦ鄄１αｍＲＮＡ （ｒ ＝ ０．５４３， Ｐ ＝ ０．００２）， ＮＦ鄄κＢｐ６５ ａｎｄ ＨＩＦ鄄 １α ｐｒｏｔｅｉｎ ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ （ｒ ＝ ０．７１６， Ｐ ＜ ０．００１）． Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎｓ Ａｓ ｔｈｅ ｇｅｎｅ ａｎｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｏｆ ＮＦ鄄κＢ ａｎｄ ＨＩＦ鄄１ ｗｅｒｅ ｕｐ鄄ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｉｎ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ＯＳＡＨＳ， ａｎｄ ａｌｓｏ ｐｏｓｉｔｉｖｅｌｙ ｃｏｒｒｅｌａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｓｅｖｅｒｉｔｙ ｏｆ ｓｉｃｋｎｅｓｓ． Ｗｅ ｃｏｎｃｌｕｄｅ ｔｈａｔ ｂｏｔｈ ＮＦ鄄κＢ ａｎｄ ＨＩＦ鄄１ ｗｅｒｅ ｉｎｖｏｌｅｄ ｉｎ ｔｈｅ ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ ｏｆ ＯＳＡＨＳ．
C MY K
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实用医学杂志 ２０１４ 年第 ３０ 卷第 ２４ 期
阻塞性睡眠呼吸暂停低通气综合征患者 缺氧激活通路的研究
罗玲 高兴林 李东风 罗少华 吴健 林琦 欧琼 岑瑞金
摘要 目的：探讨核因子－κＢ（ＮＦ鄄κＢ）与缺氧诱导因子－１（ＨＩＦ鄄１）在阻塞性睡眠呼吸暂停低通气综合征 （ＯＳＡＨＳ）的激活情况。 方法：研究对象分为轻中度 ＯＳＡＨＳ 组（１６ 例）、重度 ＯＳＡＨＳ 组（１４ 例）及对照组（３０ 例）， 通过实时荧光定量 ＰＣＲ 法（Ｒｅａｌ鄄ｔｉｍｅ）及 Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ 法分别测定外周血单个核细胞（ＰＢＭＣ）的 ＮＦ鄄κＢ、 ＨＩＦ鄄１ｍＲＮＡ 水平和 ＮＦ鄄κＢ、ＨＩＦ鄄１ 蛋白水平。 结果： 重度 ＯＳＡＨＳ 组 ＮＦ鄄κＢｐ６５ｍＲＮＡ 及 ＮＦ鄄κＢｐ６５ 蛋白表达、 ＨＩＦ鄄１αｍＲＮＡ 及 ＨＩＦ鄄１α 蛋白表达均显著高于对照组及轻中度 ＯＳＡＨＳ 组 （均 Ｐ ＜ ０．０１）；ＮＦ鄄κＢｐ６５ ｍＲＮＡ 及 ＮＦ鄄κＢｐ６５ 蛋白表达轻中度 ＯＳＡＨＳ 组与对照组无明显差异 （Ｐ 值分别为 ０．０６８ 及 ０．２５４）， 轻中度 ＯＳＡＨＳ 组 ＨＩＦ鄄１αｍＲＮＡ 明显高于对照组（Ｐ ＜ ０．０５）但 ＨＩＦ鄄１α 蛋白表达无明显差异（Ｐ ＝ ０．７７７）。 ＮＦ鄄κＢｐ６５ｍＲＮＡ 及 ＨＩＦ鄄１αｍＲＮＡ 的表达与呼吸暂停低通气指数（ＡＨＩ）呈正相关（ｒ ＝ ０．４９３， Ｐ ＝ ０．００６， ｒ ＝ ０．５０８， Ｐ ＝ ０．００４），与 夜间最低血氧饱和度（ＬＳａＯ２）呈负相关（ｒ ＝ －０．４８８， Ｐ ＝ ０．００６， ｒ ＝ －０．４６， Ｐ ＝ ０．０１１）。 ＮＦ鄄κＢｐ６５ 蛋白表达与 ＡＨＩ 呈正相关（ｒ ＝ ０．６６９， Ｐ ＜ ０．００１）。ＨＩＦ鄄１α 蛋白表达与 ＡＨＩ、氧减指数（ＯＤＩ）呈正相关（ｒ ＝ ０．６４５， Ｐ ＝ ０．００１； ｒ ＝ ０．４８０，Ｐ ＝ ０．０１８）。 ＮＦ鄄κＢｐ６５ｍＲＮＡ 与 ＨＩＦ鄄１αｍＲＮＡ 呈正相关（ｒ ＝ ０．５４３，Ｐ ＝ ０．００２），ＮＦ鄄κＢｐ６５、ＨＩＦ鄄１α 蛋 白表达呈正相关（ｒ ＝ ０．７１６，Ｐ ＜ ０．００１）。结论：ＯＳＡＨＳ 患者 ＮＦ鄄κＢ 及 ＨＩＦ鄄１ 的基因和蛋白表达均出现上调，且 患者病情越重上调越明显，表明 ＯＳＡＨＳ 的发病与两者均有关。
【Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ】 ｏｂｓｔｒｕｃｔｉｖｅ ｓｌｅｅｐ ａｐｎｅａ鄄ｈｙｐｏｐｎｅａ ｓｙｎｄｒｏｍｅ； ｈｙｐｏｘｉａ鄄ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ ｆａｃｔｏｒ鄄１； ｎｕｃｌｅａｒ ｆａｃｔｏｉｓｓｎ．１００６鄄５７２５.201４.２４．0０８ 作者单位：５１００８０ 广州市，广东省人民医院呼吸科，广东省 老年医学研究所（罗玲现单位：天津市公安医院）；５１００８０ 广东省 人民医院中心实验室，广东省老年医学研究所（李东风） 通信作者：高兴林 Ｅ鄄ｍａｉｌ： ｘｉｎｇｌｉｎｇａｏ＠ｈｏｔｍａｉｌ．ｃｏｍ
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学者认为该炎症通路主要由 ＮＦ鄄κＢ 调控； 也有学 者发现 ＨＩＦ鄄１ 依赖的适应性通路也可被间歇低氧 诱导；两条通路是否参与发病及两条通路的相互关 系等问题尚未完全清楚。本实验通过测定外周血单 个核细胞（ＰＢＭＣ）两转录因子在 ＯＳＡＨＳ 患者中的 表达， 探讨 ＯＳＡＨＳ 患者缺氧通路的激活情况及发 病机制。 １ 对象与方法 １．１ 研究对象 ２０１０ 年 １０ 月 至 ２０１１ 年 ８ 月 在 广 东 省 人 民 医 院 行 ＡＬＩＣＥ ４ 多 导 睡 眠 图 仪 （Ｒｅｓｐｉｒｏｎｉｃｓ， 美 国 ） 检 查 者 ， 分 为 轻 中 度 ＯＳＡＨＳ 组、重度 ＯＳＡＨＳ 组及对照组。 ＯＳＡＨＳ 组按中华医 学会呼吸病学分会睡眠呼吸疾病学组制定的 ＯＳＡＨＳ 诊断标准［３］，其中轻中度组 １６ 例，重度组 １４ 例。 对照组为无 ＯＳＡＨＳ 及 ＣＯＰＤ 者，共 ３０例。 其 中轻中度组 １１ 例，重度组 １３ 例，对照组 １４ 例，进 行了蛋白分析。