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Ｂｏｘ－Ｂｅｈｎｋｅｎ响应面法优化超声提取皱皮木瓜总黄酮工艺刘岩，吕宗凯，刘连芬，钱关泽∗㊀（聊城大学生命科学学院，山东聊城２５２０５９）摘要㊀以蔷薇科中的皱皮木瓜为研究对象，以其叶片为试验材料，分别进行料液比㊁提取时间㊁提取温度㊁乙醇浓度单因素试验探究总黄酮提取最适范围，通过响应面法（ＲＳＭ）和Ｂｏｘ－Ｂｅｈｎｋｅｎ试验设计结合二次回流优化超声辅助提取总黄酮工艺㊂结果表明，不同因素对木瓜叶片总黄酮提取率的影响顺序为提取时间＞乙醇浓度＞料液比；最佳工艺条件为提取时间５２ｍｉｎ㊁乙醇浓度７４％㊁料液比１ʒ４１（ｇʒｍＬ）时，总黄酮为１５６．６５ｍｇ／ｇ，提取率达到１５．６７％㊂关键词㊀皱皮木瓜；总黄酮；响应面法；提取工艺优化中图分类号㊀Ｒ２８４．２㊀㊀文献标识码㊀Ａ㊀㊀文章编号㊀０５１７－６６１１（２０２３）１０－０１４４－０５ｄｏｉ：１０．３９６９／ｊ．ｉｓｓｎ．０５１７－６６１１．２０２３．１０．０３２㊀㊀㊀㊀㊀开放科学（资源服务）标识码（ＯＳＩＤ）：ＯｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎｏｆＵｌｔｒａｓｏｎｉｃＥｘｔｒａｃｔｉｏｎｏｆＴｏｔａｌＦｌａｖｏｎｏｉｄｓｆｒｏｍＣｈａｅｎｏｍｅｌｅｓｓｐｅｃｉｏｓａｂｙＢｏｘ⁃ＢｅｈｎｋｅｎＲｅｓｐｏｎｓｅＳｕｒｆａｃｅＭｅｔｈｏｄｏｌｏｇｙＬＩＵＹａｎ，ＬÜＺｏｎｇ⁃ｋａｉ，ＬＩＵＬｉａｎ⁃ｆｅｎｅｔａｌ㊀（ＳｃｈｏｏｌｏｆＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅ，ＬｉａｏｃｈｅｎｇＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｌｉａｏｃｈｅｎｇ，Ｓｈａｎｄｏｎｇ２５２０５９）Ａｂｓｔｒａｃｔ㊀ＴａｋｉｎｇＣｈａｅｎｏｍｅｌｅｓｓｐｅｃｉｏｓａｉｎｔｈｅＲｏｓａｃｅａｅａｓｔｈｅｒｅｓｅａｒｃｈｏｂｊｅｃｔａｎｄｉｔｓｌｅａｖｅｓａｓｔｈｅｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌｍａｔｅｒｉａｌ，ｔｈｅｓｉｎｇｌｅｆａｃｔｏｒｅｘｐｅｒ⁃ｉｍｅｎｔｓｗｅｒｅｃｏｎｄｕｃｔｅｄｔｏｅｘｐｌｏｒｅｔｈｅｏｐｔｉｍａｌｒａｎｇｅｏｆｔｏｔａｌｆｌａｖｏｎｏｉｄｓｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ，ｉｎｃｌｕｄｉｎｇｓｏｌｉｄ⁃ｌｉｑｕｉｄｒａｔｉｏ，ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎｔｉｍｅ，ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎｔｅｍｐｅｒａ⁃ｔｕｒｅａｎｄｅｔｈａｎｏｌｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ．Ｒｅｓｐｏｎｓｅｓｕｒｆａｃｅｍｅｔｈｏｄｏｌｏｇｙ（ＲＳＭ）ａｎｄＢｏｘ⁃Ｂｅｈｎｋｅｎｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌｄｅｓｉｇｎｗｅｒｅｃｏｍｂｉｎｅｄｗｉｔｈｓｅｃｏｎｄａｒｙｒｅ⁃ｆｌｕｘｔｏｏｐｔｉｍｉｚｅｔｈｅｕｌｔｒａｓｏｎｉｃａｓｓｉｓｔｅｄｅｘｔｒａｃｔｉｏｎｐｒｏｃｅｓｓｏｆｔｏｔａｌｆｌａｖｏｎｏｉｄｓ．Ｔｈｅｒｅｓｕｌｔｓｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｔｈｅｏｒｄｅｒｏｆｉｎｆｌｕｅｎｃｅｏｆｄｉｆｆｅｒｅｎｔｆａｃｔｏｒｓｏｎｔｈｅｅｘｔｒａｃｔｉｏｎｒａｔｅｏｆｔｏｔａｌｆｌａｖｏｎｏｉｄｓｆｒｏｍｐａｐａｙａｌｅａｖｅｓｗａｓｅｘｔｒａｃｔｉｏｎｔｉｍｅ＞ｅｔｈａｎｏｌｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ＞ｓｏｌｉｄ⁃ｌｉｑｕｉｄｒａｔｉｏ；ｔｈｅｏｐｔｉｍａｌｐｒｏｃｅｓｓｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓｗｅｒｅｅｘｔｒａｃｔｉｏｎｔｉｍｅ５２ｍｉｎｕｔｅｓ，ｅｔｈａｎｏｌｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ７４％ａｎｄｓｏｌｉｄ⁃ｌｉｑｕｉｄｒａｔｉｏ１ʒ４１（ｇʒｍＬ），ｔｈｅｔｏｔａｌｆｌａｖｏｎｏｉｄｓｗｅｒｅ１５６．６５ｍｇ／ｇ，ａｎｄｔｈｅｅｘｔｒａｃｔｉｏｎｒａｔｅｒｅａｃｈｅｄ１５．６７％．Ｋｅｙｗｏｒｄｓ㊀Ｃｈａｅｎｏｍｅｌｅｓｓｐｅｃｉｏｓａ；Ｔｏｔａｌｆｌａｖｏｎｏｉｄｓ；Ｒｅｓｐｏｎｓｅｓｕｒｆａｃｅｍｅｔｈｏｄｏｌｏｇｙ（ＲＳＭ）；Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎｏｆｅｘｔｒａｃｔｉｏｎｐｒｏｃｅｓｓ基金项目㊀国家自然科学基金项目（３１０７０６１９，３１１７０１７８）；山东省自然科学基金项目（ＺＲ２０１１ＣＭ０４５）㊂作者简介㊀刘岩（１９９８ ），女，河北唐山人，硕士研究生，研究方向：植物学㊂∗通信作者，教授，博士，硕士生导师，从事种子植物分类及资源利用研究㊂收稿日期㊀２０２２－０７－０６；修回日期㊀２０２２－０７－１８㊀㊀皱皮木瓜（Ｃｈａｅｎｏｍｅｌｅｓｓｐｅｃｉｏｓａ（ｓｗｅｅｔ）Ｎａｋａｉ）又称楙㊁贴梗木瓜㊁贴梗海棠㊁铁脚梨等，是蔷薇科木瓜属植物，在安徽㊁浙江㊁陕西㊁甘肃㊁广东㊁云贵川及缅甸等均有分布，为常见的栽培及药用植物，花色有乳白色㊁粉红色㊁大红色且有重瓣及半重瓣品种，早春先花后叶［１］㊂皱皮木瓜含有大量的有机酸㊁三萜类㊁黄酮类化合物㊁熊果酸㊁多糖及超氧化物歧化酶（ＳＯＤ）等成分，被称为 百益之果 ，是一种药食同源的植物［２］㊂中医认为木瓜味酸性温，入肝㊁脾经，有健脾开胃㊁去湿舒筋之功效，药理学上认为这些物质具有抗癌㊁抑制肿瘤㊁抗炎杀菌㊁抗氧化等功效［３］㊂目前对于皱皮木瓜的研究多集中在栽培技术［４］和药用价值［５］方面，对其活性物质的研究包括对皂苷㊁熊果酸㊁齐墩果酸及有机酸等物质的提纯技术及功能效果方面［６－７］；仅少量学者报道了皱皮木瓜中黄酮类物质的提纯方法及总黄酮含量，指出了由于皱皮木瓜分布区的差异，其含有的总黄酮含量也不尽相同［８－９］，对木瓜中黄酮类物质的提取工艺优化的研究还鲜见报道㊂黄酮类化合物的传统提取方法主要包括水提法㊁溶剂萃取法㊁树脂吸附法等，近年来国内外新开发的提取方法有超声辅助提取法［１０］㊁超临界流体萃取法［１１］㊁微波萃取法［１２］㊁酶提取法［１３］等，其中超声辅助提取法具有用时短㊁成本低㊁提取率高㊁无试剂残留污染环境等优点［１４］，它亦可结合其他提取方式共同使用，是一种广泛应用的有极大发展前景的物质提取方式㊂为发掘皱皮木瓜叶片的潜在利用价值，减少枯枝败叶对环境造成的污染和压力，该试验采用Ｂｏｘ－Ｂｅｈｎｋｅｎ响应面法研究料液比㊁乙醇浓度㊁提取温度㊁提取时间４个因素对总黄酮提取效果的影响，优化超声冷凝回流法提取皱皮木瓜叶片中总黄酮的工艺参数，以期为皱皮木瓜叶片的深度开发利用及其中活性物质的研究提供理论和技术支持㊂１㊀材料与方法１．１㊀试验材料１．１．１㊀试材㊂皱皮木瓜春季４月新鲜幼嫩叶片，采自山东省聊城大学植物园，挑选大小㊁幼嫩程度相似㊁无病虫害㊁完整新鲜的叶片㊂１．１．２㊀试剂㊂亚硝酸钠㊁氢氧化钠㊁九水硝酸铝㊁芦丁标准品（纯度ȡ９８％），购自天津市大茂化学试剂厂；无水乙醇购自国药集团化学试剂有限公司；所有试剂均为分析纯（ＡＲ）㊂１．１．３㊀仪器与设备㊂ＤＧＸ－９０５３Ｂ－１型电热鼓风干燥箱，上海优浦科学仪器有限公司；仙桃ｘｔ－２００型高速多功能粉碎机，浙江省永康市红太阳机电有限公司；ＦＡ１００４电子分析天平，上海越平科学仪器有限公司；ＳＢ－４２００ＤＴＤ数控加热超声波清洗机，宁波新芝生物科技股份有限公司；ＳＨＫ－Ⅲ循环水式多用真空泵，郑州科泰实验设备有限公司；ＵＶ紫外可见分光光度计，上海佑科仪器仪表有限公司㊂１．２㊀试验方法１．２．１㊀试验材料的处理㊂将采摘的新鲜皱皮木瓜叶片洗净晾干，放于７０ħ烘干箱中恒温烘干至恒重，后用粉碎机粉碎㊁过筛得粉末，储存于干燥袋中于４ħ冰箱密封保存备用㊂１．２．２㊀芦丁标准曲线建立㊂根据卞京军等［１５］的方法稍作改良建立标准曲线㊂以芦丁作为标准品，精确称取１ｇ样品，６０％乙醇５００ｍＬ溶解，并用６０％乙醇定容至１０００ｍＬ，得浓㊀㊀㊀安徽农业科学，Ｊ．ＡｎｈｕｉＡｇｒｉｃ．Ｓｃｉ．２０２３，５１（１０）：１４４－１４８度为１ｍｇ／ｍＬ的芦丁标准溶液㊂取６支试管，分别加入０㊁０．２㊁０．４㊁０．６㊁０．８㊁１．０ｍＬ标准溶液，之后加入６０％乙醇至体积为１ｍＬ，先加入１０％亚硝酸钠溶液０．５ｍＬ，振荡摇匀并静置５ｍｉｎ，之后加入１０％硝酸铝溶液０．５ｍＬ，振荡并摇匀，静置５ｍｉｎ，最后加入４％氢氧化钠溶液４ｍＬ，振荡并摇匀，静置１０ｍｉｎ，以第一管为空白对照，测定５１０ｎｍ处的吸光度，以吸光度为纵坐标（ｙ）㊁芦丁质量浓度为横坐标（ｘ）建立芦丁标准曲线㊂１．２．３㊀总黄酮提取及含量测定㊂准确称量木瓜粉末１ｇ于圆底烧瓶中，分别在不同料液比㊁乙醇浓度㊁提取时间㊁提取温度条件下，遵循单一变量原则进行超声冷凝回流提取㊂考虑到高温溶剂易挥发导致提取不充分等问题，该研究根据宋璇等［１６］的方法稍作改良，在第一次提取结束后，另加入同等体积乙醇进行二次回流提取，合并提取液，定容于１００ｍＬ容量瓶，后转移至１２５ｍＬ棕色广口瓶保存㊂采用硝酸铝比色法对总黄酮含量进行测定㊂取２００μＬ样品至试管中，对照中加入同体积蒸馏水，各加入８００μＬ对应体积的乙醇，加１０％ＮａＮＯ２溶液１ｍＬ，振荡摇匀后反应５ｍｉｎ；加１０％Ａｌ（ＮＯ３）３溶液１ｍＬ，振荡摇匀反应５ｍｉｎ；加入４％ＮａＯＨ溶液５ｍＬ，振荡摇匀反应１０ｍｉｎ，测５１０ｎｍ处的ＯＤ值㊂参照芦丁标准品计算皱皮木瓜中总黄酮含量，求得总黄酮的提取率，计算公式如下：Ｅ＝ＣˑＶˑｎｍˑ１００％（１）式中，Ｅ为总黄酮提取率（％）；Ｃ为含有的总黄酮质量浓度（ｇ／ｍＬ）；Ｖ为加入的提取液体积（ｍＬ）；ｎ为稀释倍数；ｍ为木瓜粉末的质量（ｇ）㊂１．２．４㊀单因素试验㊂１．２．４．１㊀提取温度对总黄酮提取率的影响㊂精确称取皱皮木瓜叶片粉末１ｇ，以料液比１ʒ５０（ｇʒｍＬ）㊁乙醇浓度６０％㊁提取时间４０ｍｉｎ条件下，提取温度分别为室温（３０）㊁４０㊁５０㊁６０㊁７０ħ进行回流提取，计算总黄酮提取率，重复３次㊂１．２．４．２㊀提取时间对总黄酮提取率的影响㊂精确称取皱皮木瓜叶片粉末１ｇ，以料液比１ʒ５０㊁乙醇浓度６０％㊁提取温度５０ħ条件下，提取时间分别为２０㊁３０㊁４０㊁５０㊁６０ｍｉｎ进行回流提取，计算总黄酮提取率，重复３次㊂１．２．４．３㊀料液比对总黄酮提取率的影响㊂精确称取皱皮木瓜叶片粉末１ｇ，以乙醇浓度６０％㊁提取时间４０ｍｉｎ㊁提取温度５０ħ条件下，料液比分别为１ʒ３０㊁１ʒ４０㊁１ʒ５０㊁１ʒ６０㊁１ʒ７０进行回流提取，计算总黄酮提取率，重复３次㊂１．２．４．４㊀乙醇浓度对总黄酮提取率的影响㊂精确称取皱皮木瓜叶片粉末１ｇ，以料液比１ʒ５０㊁提取时间４０ｍｉｎ㊁提取温度５０ħ条件下，乙醇浓度分别为５０％㊁６０％㊁７０％㊁８０％㊁９０％进行回流提取，计算总黄酮提取率，重复３次㊂１．２．５㊀响应面优化试验设计㊂根据单因素试验的结果，且由于试验材料采集时间原因，选取３因素３水平的响应面分析法对超声辅助提取工艺进行优化，以料液比㊁乙醇浓度㊁提取时间３个因素为自变量，以总黄酮提取率为响应值，将获得数据导入软件Ｄｅｓｉｇｎ－Ｅｘｐｅｒｔ，以其中的Ｂｏｘ－Ｂｅｈｎｋｅｎ设计原理得到１７组试验设计，分析多因素交互作用，优化提取条件，建立回归模型，最后确定最佳提取参数及验证试验分析㊂２㊀结果与分析２．１㊀建立芦丁标准曲线㊀以吸光度为纵坐标（ｙ）㊁芦丁质量浓度（ｍｇ／ｍＬ）为横坐标（ｘ）建立芦丁标准曲线（图１），得出芦丁标准曲线的回归方程为ｙ＝１．４４５ｘ－０．０１７６（Ｒ２＝０．９９９９），表明芦丁在０ １．５ｍｇ／ｍＬ表现出良好的线性关系㊂图１㊀芦丁标准曲线Ｆｉｇ．１㊀Ｒｕｔｉｎｓｔａｎｄａｒｄｃｕｒｖｅ２．２㊀单因素试验２．２．１㊀乙醇浓度对总黄酮提取率的影响㊂由图２可知，在提取温度㊁提取时间㊁料液比一定的条件下，乙醇浓度在５０％ ７０％总黄酮提取率呈上升趋势，在乙醇浓度７０％时提取率达到最大值（１５．１６％）；乙醇浓度大于７０％，总黄酮提取率呈显著下降趋势，到９０％时总黄酮提取率为１３．７３％，同比最大值下降了９．４３％，说明皱皮木瓜总黄酮在７０％乙醇中溶解度最大，由此选取７０％为皱皮木瓜叶片总黄酮提取的乙醇浓度㊂图２㊀乙醇浓度对总黄酮提取率的影响Ｆｉｇ．２㊀Ｅｆｆｅｃｔｏｆｅｔｈａｎｏｌｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｏｎｔｈｅｅｘｔｒａｃｔｉｏｎｒａｔｅｏｆｔｏｔａｌｆｌａｖｏｎｏｉｄｓ２．２．２㊀料液比对总黄酮提取率的影响㊂由图３可知，在提取温度㊁提取时间㊁乙醇浓度一定的条件下，总黄酮提取率随着料液比减少呈先上升后下降的趋势，料液比１ʒ３０时总黄酮提取率为１３．０２％，１ʒ４０时总黄酮提取率为１４．２９％，提取率增长了９．７５％，达到最大值；之后总黄酮提取率呈下降趋势㊂因此选择１ʒ４０为皱皮木瓜叶片总黄酮提取的料液比㊂２．２．３㊀提取时间对总黄酮提取率的影响㊂由图４可知，在提取温度㊁乙醇浓度㊁料液比一定的条件下，提取时间在２０５４１５１卷１０期㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀刘岩等㊀Ｂｏｘ－Ｂｅｈｎｋｅｎ响应面法优化超声提取皱皮木瓜总黄酮工艺图３㊀料液比对总黄酮提取率的影响Ｆｉｇ．３㊀Ｅｆｆｅｃｔｏｆｓｏｌｉｄ⁃ｌｉｑｕｉｄｒａｔｉｏｏｎｔｈｅｅｘｔｒａｃｔｉｏｎｒａｔｅｏｆｔｏｔａｌｆｌａｖｏｎｏｉｄｓ５０ｍｉｎ，总黄酮提取率先平缓后急剧增加，提取时间５０ｍｉｎ时总黄酮提取率达到最高值，为１５．５５％；随着提取时间延长，总黄酮提取率急剧下降，６０ｍｉｎ时，总黄酮提取率为１４．０９％㊂结果表明随着提取时间的增加，总黄酮提取率提高，当时间超过一定限值后总黄酮提取率下降，在工业生产中延长提取时间会增加生产成本和消耗，为节约时间和经济成本，选择５０ｍｉｎ为皱皮木瓜叶片总黄酮提取时间㊂图４㊀提取时间对总黄酮提取率的影响Ｆｉｇ．４㊀Ｅｆｆｅｃｔｏｆｅｘｔｒａｃｔｉｏｎｔｉｍｅｏｎｔｈｅｅｘｔｒａｃｔｉｏｎｒａｔｅｏｆｔｏｔａｌｆｌａｖｏｎｏｉｄｓ２．２．４㊀提取温度对总黄酮提取率的影响㊂由图５可知，在乙醇浓度㊁提取时间㊁料液比一定的条件下，提取温度低于４０ħ，随着提取温度的增加总黄酮提取率逐渐增加；提取温度４０ħ时总黄酮提取率达到峰值，为１６．０１％；高于４０ħ后总黄酮提取率呈急速下降趋势㊂结果表明随着提取温度的增加，总黄酮提取率提高，而当温度超过一定限值后总黄酮提取率下降，可能是由于温度过高导致部分黄酮类化合物结构遭到破坏或是达到溶剂沸点后溶剂挥发损失，最终导致总黄酮提取率降低，因此选取４０ħ为皱皮木瓜叶片总黄酮提取温度㊂２．３㊀响应面试验㊀根据单因素试验结果，对影响皱皮木瓜叶片总黄酮提取率的不同因素（料液比㊁提取时间㊁乙醇浓度）进行Ｂｏｘ－Ｂｅｈｎｋｅｎ试验设计，表１为不同因素及水平组合条件下皱皮木瓜叶片总黄酮提取率，结果表明，提取时间５０ｍｉｎ㊁乙醇浓度７０％㊁料液比１ʒ４０时，皱皮木瓜叶片总黄酮提取率最高，为１５．７７％㊂㊀㊀以ＤｅｓｉｇｎＥｘｐｅｒｔ８．０５软件对表１数据进行统计分析，建图５㊀提取温度对总黄酮提取率的影响Ｆｉｇ．５㊀Ｅｆｆｅｃｔｏｆｅｘｔｒａｃｔｉｏｎｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅｏｎｔｈｅｅｘｔｒａｃｔｉｏｎｒａｔｅｏｆｔｏｔａｌｆｌａｖｏｎｏｉｄｓ立料液比（Ａ）㊁提取时间（Ｂ）㊁乙醇浓度（Ｃ）３个因素与皱皮木瓜叶片总黄酮提取率（Ｙ）的二次回归方程：Ｙ＝１５．７４＋０．０３６Ａ＋０．０５９Ｂ＋０．０４５Ｃ－０．０１０ＡＢ＋０．０１８ＡＣ－０．０１２ＢＣ－０．２２０Ａ２－０．１３０Ｂ２－０．０６０Ｃ２（Ｒ２＝０．９９９４）㊂方差分析（表２）显示，模型显著而失拟项不显著，说明试验误差小，具有统计学意义；决定系数（Ｒ２）大于０．９，说明模型具有较高的拟合度，可用于皱皮木瓜叶片总黄酮提取的条件优化㊂表１㊀响应面试验设计与结果Ｔａｂｌｅ１㊀Ｒｅｓｐｏｎｓｅｓｕｒｆａｃｅｔｅｓｔｄｅｓｉｇｎａｎｄｒｅｓｕｌｔｓ试验序号ＴｅｓｔＮｏ．Ａ（料液比Ｓｏｌｉｄ⁃ｌｉｑｕｉｄｒａｔｉｏ）Ｂ（提取时间Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎｔｉｍｅʊｍｉｎ）Ｃ（乙醇浓度Ｅｔｈａｎｏｌｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ％）总黄酮提取率Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎｒａｔｅｏｆｔｏｔａｌｆｌａｖｏｎｏｉｄｓʊ％１１ʒ４０６０６０１５．５４２１ʒ３０５０８０１５．４６３１ʒ３０４０７０１５．２４４１ʒ４０５０７０１５．６９５１ʒ５０４０７０１５．３３６１ʒ４０４０８０１５．５７７１ʒ４０４０６０１５．４８８１ʒ４０５０７０１５．７４９１ʒ４０５０７０１５．７７１０１ʒ４０６０８０１５．５８１１１ʒ４０５０７０１５．７６１２１ʒ５０６０７０１５．５１１３１ʒ５０５０８０１５．５７１４１ʒ３０６０７０１５．４６１５１ʒ３０５０６０１５．３８１６１ʒ４０５０７０１５．７２１７１ʒ５０５０６０１５．４２㊀㊀回归模型显著性检验结果（表２）表明，模型中料液比（Ａ）不显著（Ｐ＞０．０５），提取时间（Ｂ）㊁乙醇浓度（Ｃ）均显著（Ｐ＜０．０５），表明料液比对皱皮木瓜叶片总黄酮提取率的影响不显著，提取时间㊁乙醇浓度对提取率的影响显著；Ａ２㊁Ｂ２表现为极显著（Ｐ＜０．０１），Ｃ２表现为显著（Ｐ＜０．０５），说明乙醇浓度㊁料液比㊁提取时间对皱皮木瓜叶片总黄酮提取率的影响是较为复杂的二次关系，影响顺序为提取时间＞乙醇浓度＞料液比㊂６４１㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀安徽农业科学㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀２０２３年表２㊀响应面回归模型方差分析Ｔａｂｌｅ２㊀Ａｎａｌｙｓｉｓｏｆｖａｒｉａｎｃｅｏｆｒｅｓｐｏｎｓｅｓｕｒｆａｃｅｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎｍｏｄｅｌ方差来源Ｓｏｕｒｃｅｏｆｖａｒｉａｔｉｏｎ平方和ＳＳ自由度ｄｆ均方ＭＳＦ值ＦｖａｌｕｅＰ值Ｐｖａｌｕｅ模型Ｍｏｄｅｌ０．３７９０．０４１１５．２３０．０００８Ａ０．０１１１０．０１１３．８７０．０８９７Ｂ０．０２８１０．０２８１０．１８０．０１５３Ｃ０．０１６１０．０１６５．９７０．０４４５ＡＢ４．０００Ｅ－００４１４．０００Ｅ－００４０．１５０．７１２４ＡＣ１．２２５Ｅ－００３１１．２２５Ｅ－００３０．４５０．５２３２ＢＣ６．２５０Ｅ－００４１６．２５０Ｅ－００４０．２３０．６４５９Ａ２０．２００１０．２００７３．７４＜０．０００１Ｂ２０．０７４１０．０７４２７．４５０．００１２Ｃ２０．０１５１０．０１５５．６８０．０４８７残差Ｒｅｓｉｄｕａｌ０．０１９７２．７１４Ｅ－００３失拟项Ｍｉｓｆｉｔｔｉｎｇｔｅｒｍ０．０１５３４．９５８Ｅ－００３４．８１０．０８１５纯误差Ｐｕｒｅｅｒｒｏｒ４．１２０Ｅ－００３４１．０３０Ｅ－００３总误差Ｔｏｔａｌｅｒｒｏｒ０．３９０１６２．４㊀响应面多因素交互作用分析㊀由图６ ８可知，在料液比㊁提取时间㊁乙醇浓度两两因素一定的条件下，总黄酮提取率都随着第３个因素的增大而先上升后下降㊂料液比和提取时间的等高线形状偏圆形，说明两者交互作用较缓和；乙醇浓度与料液比的等高线呈椭圆形，表明两者交互作用显著；乙醇浓度和提取时间的等高线呈椭圆形，表明两者交互作用显著㊂从响应面的３Ｄ图可知，料液比和提取时间㊁料液比和乙醇浓度㊁乙醇浓度和提取时间的曲线均较陡，说明两图６㊀料液比与提取时间对木瓜叶片总黄酮提取率交互影响的等高线和响应面Ｆｉｇ．６㊀Ｃｏｎｔｏｕｒａｎｄｒｅｓｐｏｎｓｅｓｕｒｆａｃｅｏｆｔｈｅｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｂｅｔｗｅｅｎｓｏｌｉｄ⁃ｌｉｑｕｉｄｒａｔｉｏａｎｄｅｘｔｒａｃｔｉｏｎｔｉｍｅｏｎｔｈｅｅｘｔｒａｃｔｉｏｎｒａｔｅｏｆｔｏｔａｌｆｌａｖｏｎｏｉｄｓｆｒｏｍｐａｐａｙａｌｅａｖｅｓ图７㊀料液比与乙醇浓度对木瓜叶片总黄酮提取率交互影响的等高线和响应面Ｆｉｇ．７㊀Ｃｏｎｔｏｕｒａｎｄｒｅｓｐｏｎｓｅｓｕｒｆａｃｅｏｆｔｈｅｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｂｅｔｗｅｅｎｓｏｌｉｄ⁃ｌｉｑｕｉｄｒａｔｉｏａｎｄｅｔｈａｎｏｌｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｏｎｔｈｅｅｘｔｒａｃｔｉｏｎｒａｔｅｏｆｔｏｔａｌｆｌａ⁃ｖｏｎｏｉｄｓｆｒｏｍｐａｐａｙａｌｅａｖｅｓ７４１５１卷１０期㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀刘岩等㊀Ｂｏｘ－Ｂｅｈｎｋｅｎ响应面法优化超声提取皱皮木瓜总黄酮工艺图８㊀乙醇浓度与提取时间对木瓜叶片总黄酮提取率交互影响的等高线和响应面Ｆｉｇ．８㊀Ｃｏｎｔｏｕｒａｎｄｒｅｓｐｏｎｓｅｓｕｒｆａｃｅｏｆｔｈｅｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｂｅｔｗｅｅｎｅｔｈａｎｏｌｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎａｎｄｅｘｔｒａｃｔｉｏｎｔｉｍｅｏｎｔｈｅｅｘｔｒａｃｔｉｏｎｒａｔｅｏｆｔｏｔａｌｆｌａ⁃ｖｏｎｏｉｄｓｆｒｏｍｐａｐａｙａｌｅａｖｅｓ者的交互作用对总黄酮提取率的影响较大㊂２．５㊀总黄酮最佳提取参数的确定及验证性试验㊀经过分析回归方程，选择Ｍａｘｉｍｉｚｅ模式对总黄酮提取工艺进行参数优化，得到最优提取总黄酮的条件为提取时间５２ｍｉｎ㊁乙醇浓度７３．６４％㊁料液比１ʒ４０．９４，此时，皱皮木瓜叶片总黄酮提取率的理论值为１５．７５％㊂为验证回归方程，以提取时间５２ｍｉｎ㊁乙醇浓度７４％㊁料液比１ʒ４１进行皱皮木瓜叶片总黄酮提取率验证试验，进行３组平行试验，回流提取２次，结果发现总黄酮提取率实际均值为１５．６７％，ＲＳＤ小于５％，与理论值基本一致，说明Ｂｏｘ－Ｂｅｈｎｋｅｎ响应面优化设计得到的各因素水平条件组合比较可靠，可以用于实际操作以及优化提取参数㊂３㊀结论与讨论前人研究报道，一般皱皮木瓜果实总黄酮含量在６ ４０ｍｇ／ｇ［１７］，皱皮木瓜皮渣总黄酮得率为０．２％ ０．５％［１５］㊂唐浩国［１８］研究表明，超声波具有空化作用，该作用可加速植物有效成分溶解出来，进而提高活性成分的提取率㊂该研究利用超声冷凝回流提取法提取皱皮木瓜叶片中总黄酮，结合二次回流提取并利用Ｂｏｘ－Ｂｅｈｎｋｅｎ响应面试验设计对提取条件进行优化，结果表明在提取时间５２ｍｉｎ㊁乙醇浓度７４％㊁料液比１ʒ４１条件下总黄酮得率最高，总黄酮提取率达到１５．６７％，总黄酮含量为１５６．６５ｍｇ／ｇ，比文献报道的总黄酮得率显著提高［１９－２２］㊂究其原因，或是由于采样时间处于春季，叶片较嫩，总黄酮含量更高，且一次提取后又加入溶剂进行了二次回流，补充了溶剂，保证总黄酮的大部分能够提取出来㊂由此可见，Ｂｏｘ－Ｂｅｈｎｋｅｎ响应面法优化及二次回流的应用使得总黄酮提取率更高㊂该研究结果最大程度提高了皱皮木瓜叶片总黄酮得率，证明了以响应面法优化提取皱皮木瓜叶片总黄酮工艺的可行性，充分挖掘出木瓜的潜在利用价值，在控制成本㊁提高效率㊁保护环境㊁减少污染方面有着巨大的优势，从而实现了皱皮木瓜原料更为高效利用，为扩大皱皮木瓜工业生产及产品的开发利用提供了可靠依据㊂参考文献［１］中国科学院中国植物志编辑委员会．中国植物志：第３６卷［Ｍ］．北京：科学出版社，１９７４：４００－４０２．［２］陈红，王关祥，郑林，等．木瓜属（贴梗海棠）品种分类的研究历史与现状［Ｊ］．山东林业科技，２００６，３６（５）：７０－７１，７８．［３］国家中医药管理局‘中华本草“编辑委员会．中华本草：第４卷［Ｍ］．上海：上海科学技术出版社，１９９９：１１１．［４］郭建全，刘春华，黄金铭，等．皱皮木瓜栽培技术要点［Ｊ］．江西农业，２０１９（１２）：１５．［５］程翔．皱皮木瓜均一多糖的分离纯化㊁结构鉴定及抗肿瘤活性研究［Ｄ］．上海：上海中医药大学，２０１９［６］刘世尧．不同产区皱皮木瓜有机酸组成及主要活性成分分离纯化研究［Ｄ］．重庆：西南大学，２０１２．［７］王志芳．皱皮木瓜中齐墩果酸和熊果酸测定㊁提取及抗肿瘤活性研究［Ｄ］．武汉：华中农业大学，２００６．［８］王文平，蒋朝晖．木瓜中总黄酮的提取分离及含量测定［Ｊ］．食品工业科技，２００４，２５（３）：８１－８２．［９］李娜，姜洪芳，金敬宏，等．不同采收期的宣木瓜总黄酮含量分析［Ｊ］．食品研究与开发，２０１１，３２（２）：１１２－１１４．［１０］周胜男，褚翠翠，陆宁．食用仙人掌中黄酮类物质的提取研究［Ｊ］．食品工业科技，２００８，２９（２）：２２８－２３０．［１１］ＤＵＧＯＰ，ＭＯＮＤＥＬＬＯＬ，ＤＵＧＯＧ，ｅｔａｌ．Ｒａｐｉｄａｎａｌｙｓｉｓｏｆｐｏｌｙｍｅｔｈｏｘｙ⁃ｌａｔｅｄｆｌａｖｏｎｅｓｆｒｏｍｃｉｔｒｕｓｏｉｌｓｂｙｓｕｐｅｒｃｒｉｔｉｃａｌｆｌｕｉｄｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ［Ｊ］．Ｊｏｕｒｎａｌｏｆａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌａｎｄｆｏｏｄｃｈｅｍｉｓｒｙ，１９９６，４４（１２）：３９００－３９０５．［１２］孙萍，李艳，成玉怀．甘草总黄酮的微波提取及含量测定［Ｊ］．时珍国医国药，２００３，１４（５）：２６６－２６７．［１３］ＷＵＭＬ，ＺＨＯＵＣＳ，ＣＨＥＮＬＳ，ｅｔａｌ．Ｓｔｕｄｙｏｎｔｈｅｅｘｔｒａｃｔｉｏｎｏｆｔｏｔａｌｆｌａ⁃ｖｏｎｏｉｄｓｆｒｏｍＧｉｎｇｏｌｅａｖｅｓｂｙｅｎｚｙｍｅｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ［Ｊ］．Ｎａｔｕｒａｌｐｒｏｄｕｃｔｒｅ⁃ｓｅａｒｃｈａｎｄｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，２００４，１６（６）：５５７－５６０．［１４］代彩玲，王萍，王静，等．籽瓜瓜皮果胶提取方法的优化与评价［Ｊ］．中国瓜菜，２０１８，３１（１０）：１３－１８．［１５］卞京军，程密密，刘世尧，等．皱皮木瓜皮渣齐墩果酸㊁熊果酸和总黄酮连续提取工艺研究［Ｊ］．西南大学学报（自然科学版），２０１５，３７（３）：１５８－１６５．［１６］宋璇，王汝华，于建丽，等．山楂叶黄酮分离纯化及抗氧化活性［Ｊ］．食品研究与开发，２０２２，４３（４）：５７－６３．［１７］郑璇，申国明，高林，等．不同产区皱皮木瓜总黄酮含量与土壤主要化学指标的关系［Ｊ］．江苏农业科学，２０１８，４６（１７）：２０２－２０５．［１８］唐浩国．黄酮类化合物研究［Ｍ］．北京：科学出版社，２００９：６４－６５．［１９］王有为，何敬胜，范建伟，等．木瓜道地起源与道地产区形成研究［Ｃ］／／中国中西医结合学会中药专业委员会．２００９年全国中药学术研讨会论文集．北京：中国中西医结合学会，２００９：１６３－１６８．［２０］郭锡勇，唐修静，郭莉莉．木瓜不同炮制品中总黄酮含量测定［Ｊ］．贵阳中医学院学报，２０００，２２（４）：６１－６２．［２１］陈翠，熊德琴，李春晖．木瓜中总黄酮提取最佳工艺的研究［Ｊ］．广东石油化工学院学报，２０１２，２２（１）：１５－１７，２５．［２２］严睿文，丁毅．宣木瓜中黄酮的提取分离及含量的测定［Ｊ］．生物学杂志，２００８，２５（３）：６２－６４．８４１㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀安徽农业科学㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀２０２３年。
皱皮木瓜多糖的分离纯化及结构表征刘捷;王文;张体祥【摘要】研究从皱皮木瓜中提取的水溶性多糖的分离、纯化、单糖组成及结构,为木瓜的开发利用提供依据.采用Sevag法除蛋白、透析法除小分子杂质后,经Sephadex G-100葡聚糖凝胶柱分离得到了皱皮木瓜多糖CSP1.通过高效凝胶渗透色谱、气相色谱、紫外光谱、红外光谱和核磁共振氢谱等分析手段初步确定了其组成和结构.皱皮木瓜多糖CSP1为均一组分,重均相对分子质量为27 622,由鼠李糖、木糖、葡萄糖、半乳糖4种单糖组成,摩尔比为0.042∶0.067∶0.860∶0.031,葡萄糖是主要成分,木瓜多糖CSP1结构中存在α-糖苷键.【期刊名称】《河南工程学院学报（自然科学版）》【年(卷),期】2017(029)004【总页数】5页(P30-34)【关键词】皱皮木瓜;多糖;分离纯化;单糖组成;结构【作者】刘捷;王文;张体祥【作者单位】河南工业大学化学化工与环境学院,河南郑州450001;河南工业大学化学化工与环境学院,河南郑州450001;河南工业大学化学化工与环境学院,河南郑州450001【正文语种】中文【中图分类】O69木瓜的种类很多，主要分为三类：一类是蔷薇科木瓜，如光皮木瓜、皱皮木瓜；一类是番木瓜科木瓜，如番木瓜；还有一类是木通科木瓜，如野木瓜.作为一味常用的中药，木瓜具有平肝舒筋、和胃化湿的功效[2]，文献[3]研究还发现木瓜有抗菌消炎、抗衰老、抗肿瘤的作用.皱皮木瓜(Chaenomeles Speciosa (Sweet.) Nakai)为木瓜中正品[1]，是一种药食同源植物，果实中富含糖类、有机酸、蛋白质、多种维生素、矿物元素等，营养价值很高.多糖是木瓜果实中重要的生物活性物质，国内外仅有为数不多的几篇文献对光皮木瓜、野木瓜多糖的提取及其抗氧化活性进行了研究[4-7]，关于皱皮木瓜多糖的研究报道更不多见.为了进一步提高皱皮木瓜的经济价值，课题组在前期对皱皮木瓜多糖的提取、化学改性及其抗氧化活性工作的基础上[8]，对提取的水溶性木瓜多糖进行分离纯化和结构分析，为深入研究皱皮木瓜多糖的理化性质、组成结构、生物活性及应用提供了实验依据.1.1.1 原料新鲜皱皮木瓜采摘于郑州市黄河游览区植物园，粉碎后，将粉末储存于冰箱备用.皱皮木瓜粗多糖由本实验室提取，多糖质量分数63%.1.1.2 试剂葡萄糖(天津市科密欧化学试剂开发中心)，D-半乳糖(上海市国药集团化学试剂有限公司)，D-甘露糖(上海市国药集团化学试剂有限公司)，D-木糖(上海伯奥生物科技有限公司)，L-鼠李糖(美国Sigma公司)，葡聚糖凝胶(Sephadex G-100，Sephadex G-200)(美国Sigma公司)，透析袋(Sigma 公司)，无水乙醇、氯仿、苯酚(A.R.，洛阳市化学仪器厂)，三氟乙酸、吡啶、正丁醇(A.R.，天津市瑞金特化学品有限公司)，盐酸羟胺(A.R.，洛阳化学试剂厂)，醋酸酐、萘酚(A.R.，天津市科密欧化学试剂开发中心).1.1.3 仪器微型高速万能试样粉碎机(北京市永光明医疗仪器厂)，JJ-1型定时电动搅拌器(金坛市华峰仪器有限公司)，RE-52c型旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂)，SZ-93型自动双重纯水蒸馏器(上海亚荣生化仪器厂)，BSZ-100型自动部分收集器(上海和勤分析仪器有限公司)，SHA-B恒温水浴振荡器(金坛市华峰仪器有限公司)，真空冷冻干燥机(上海比朗仪器制造有限公司)，凝胶分离柱(上海亚荣生化仪器厂)，BL-3205型电子天平(精度≥0.000 1 g，日本岛津公司)，UV-2450型紫外-可见分光光度计(北京普析通用仪器有限责任公司)，GC-9790型气相色谱仪(浙江温岭福立分析仪器有限公司)，AVANCE 400型核磁共振谱仪(布鲁克北京科技有限公司)，Prestige-21型傅里叶变换红外光谱仪(日本岛津公司)，LC-10AVP型高效液相色谱仪(日本岛津公司).1.2.1 多糖的分离纯化采用 Sevag法去除蛋白质，将一定量的多糖溶液中加入氯仿和正丁醇(V(氯仿)∶V(正丁醇)= 5∶1)的混合溶剂，离心20 min，去除多糖溶液层与有机溶液层交界处的变性蛋白质，重复数次直至中间无混浊沉淀为止.然后，用透析法去除小分子杂质.取5.0 mg 纯化后的多糖，1 mL 蒸馏水溶解后，离心20 min，上清液立即装入Sephadex G-100葡聚糖凝胶柱，用0.1 mol/L的NaCl溶液进行洗脱，控制流速为1 mL/min，洗脱液由分布收集器收集，每管5 mL，苯酚-硫酸法跟踪检测，合并流出液浓缩至一定体积，乙醇沉淀、过滤、干燥，得到精制的皱皮木瓜多糖. 1.2.2 多糖纯度鉴定将Sephadex G-100装柱，用0.05 mol/L的NaCl溶液平衡一天.将精制的木瓜多糖溶解后，用0.05 mol/L的NaCl溶液进行洗脱，按每管4 mL 分部收集，用苯酚-硫酸法检测.1.2.3 多糖的相对分子质量的测定采用高效凝胶渗透色谱法测定木瓜多糖的相对分子质量，相对分子质量与多糖在凝胶柱上的洗脱体积Ve、分配系数Kav 存在如下关系：式中：a，b，K1，K2为常数；V0为标准物的洗脱体积；Vt为葡萄糖的洗脱体积.根据公式(3)，用已知分子质量的标准物绘制标准曲线，然后根据木瓜多糖的洗脱体积计算木瓜多糖的相对分子质量[9].色谱条件如下：GPC柱为Shim-pack GPC 803 300 mm×4.6 mm；柱温为40 ℃；流动相为0.7%的Na2SO4加0.05%的NaN3；流量为1.0 mL/min；检测器为示差折光检测器；样品质量浓度为10 mg/mL；进样量为100 μL.1.2.4 单糖组成的测定(1)多糖糖腈乙酸酯衍生化于10 mg 多糖中加入浓度为2 mol/L的三氟乙酸5 mL，在100 ℃下密闭水解6 h.将水解液减压浓缩至干，60 ℃烘箱中干燥后，加入10 mg 盐酸羟胺和0.5 mL 吡啶，将反应液水浴加热30 min.冷却至室温，加入0.5 mL 醋酸酐继续反应30 min，所得的反应液可直接进行气相色谱分析[10].(2)标准单糖衍生物的制备分别称取葡萄糖、木糖、半乳糖、甘露糖、鼠李糖各10 mg，按照上述多糖水解液制备多糖糖腈乙酸酯衍生物的方法进行乙酰化反应.GC分析过程如下：150 ℃下保持4 min，然后以10 ℃/min升温至160 ℃，保持8 min，再以5 ℃/min升温至180 ℃，保持2 min，最后以20 ℃/min升温至250 ℃，保持5 min.进样口温度为250 ℃，检测器温度为240 ℃，载气压力为0.1 MPa.将样品图谱与标准单糖图谱对照，确定皱皮木瓜多糖的单糖组成.1.2.5 理化性质(1)碘-碘化钾反应将木瓜多糖样品制成1 mg/mL的溶液，取1 mL加入碘-碘化钾溶液，观察颜色变化.(2)茚三酮反应取1 mL质量浓度1 mg/mL的木瓜多糖溶液，加入0.5 mL 0.1%的茚三酮乙醇溶液，混匀，煮沸1～2 min，冷却，观察颜色变化.(3)Molish反应分别取1 mL质量浓度为1 mg/mL的木瓜多糖溶液，各加入2滴Molish试剂(即10%的α-萘酚的乙醇溶液)，混合均匀后将试管倾斜45°，沿试管壁慢慢加入1mL浓硫酸(勿摇动)，竖立试管，观察浓硫酸和糖交界面颜色的变化.1.2.6 红外光谱取2.0 g纯化后的皱皮木瓜多糖粉末，KBr压片，在4 000～400 cm-1处扫描. 1.2.7 紫外光谱将纯化后的皱皮木瓜多糖溶于水，以蒸馏水为参比，在200～400 nm处扫描.1.2.8 核磁共振氢谱将10 mg 纯化后的皱皮木瓜多糖溶于0.5 mL的D2O中，加入TMS，在核磁共振仪上测定1H NMR谱.皱皮木瓜粗多糖经Sevag法脱蛋白、透析除小分子杂质后，由棕色粉末变为灰白色粉末，苯酚-硫酸法测定多糖质量分数为80.92%.木瓜多糖的Sephadex G-100柱层析的洗脱曲线见图1.从图1可以看到，木瓜多糖样品经Sephadex G-100柱层析洗脱，分离得到3个峰，分别出现在第6管、第23管和第29管，其中第6管的含糖量最高且峰形尖锐对称，与另外两个小峰分离效果好.收集第6管的流出液，减压浓缩至一定体积，经醇沉、过滤、干燥，得精制木瓜多糖，命名为CSP1.这说明利用葡聚糖凝胶柱可以完全分离木瓜多糖.经苯酚-硫酸法测定，多糖质量分数为96.29%.对Sephadex G-100柱层析分离得到的CSP1进行纯度鉴定，凝胶柱层析图谱中出现单一峰且峰形对称，说明CSP1为均一组分，如图2所示.图3是标准葡聚糖的标准曲线，回归方程为Y=7.218 7-1.441 5X，R2=0.992 9.根据洗脱体积回归方法计算，木瓜多糖CSP1的重均相对分子质量为27 622.标准单糖混合物水解的衍生物和木瓜多糖CSP1水解衍生物的气相色谱图如图4所示，气相色谱保留时间数据见表1.分离纯化后的皱皮木瓜多糖CSP1为白色粉末，溶于水，不溶于乙醇、丙酮、乙醚、氯仿等有机溶剂.理化性质测定显示：苯酚-硫酸反应呈阳性，碘-碘化钾反应和茚三酮反应均呈阴性，说明多糖中不含淀粉、氨基酸和蛋白质，属于非淀粉糖.CSP1的紫外吸收光谱结果显示在260 nm处和280 nm处无吸收，表明CSP1不含核酸、多肽和蛋白质.CSP1的红外光谱具有典型的多糖特征吸收峰[11]，如图5所示.各吸收峰的归属见表2.从图5和表2可知，红外光谱显示皱皮木瓜多糖在3 400 cm-1处、2 900 cm-1处、1 640 cm-1处和1 100～1 000 cm-1处有多糖的特征吸收峰.1 021 cm-1处出现的强吸收峰是葡萄糖的特征吸收峰,850 cm-1处的吸收峰表明多糖结构中存在α-糖苷键[12].890 cm-1处无吸收峰，可以确定不含有β-糖苷键.770 cm-1处附近的吸收峰为D-葡萄吡喃糖环的吸收.同时，在810 cm-1处和870 cm-1处无吸收峰表明无甘露糖的特征吸收，这也与GC结果相符.因此，通过IR光谱可以初步确定皱皮木瓜多糖属于α-吡喃糖.从1H-NMR(图6)结果分析，异头氢质子在4.5×10-6～5.5×10-6时出现一个明显的质子信号(δ4.721)，说明木瓜多糖的主要单糖种类有一种,δ5.204 证实多糖中存在α-型糖苷键[13-14]，这与木瓜多糖的红外光谱图、GC 结果是相符的，δ3.769、δ3.647和δ3.452为非异头氢质子.采用水煮醇沉工艺提取的水溶性皱皮木瓜粗多糖经过Sevag法脱蛋白、透析法除小分子化合物、Sephadex G-100色谱技术分离纯化得到精制的皱皮木瓜多糖CSP1，多糖质量分数达到96.29%，说明该工艺适用于纯化木瓜多糖.CSP1的重均相对分子质量为27 622，单糖组成主要有鼠李糖、木糖、葡萄糖、半乳糖，其中葡萄糖是主要的单糖成分.木瓜多糖CSP1具有多糖的典型特征吸收峰，属于α-吡喃糖，核磁共振氢谱进一步证实了皱皮木瓜多糖中存在α-糖苷键.多糖是结构复杂的生物大分子，糖的绝对构型、单糖的连接方式、羟基被取代情况等结构信息还有待进一步的深入研究.【相关文献】[1] 中华人民共和国药典委员会.中华人民共和国药典一部[M].北京：化学工业出版社，2000:45.[2] 郭学敏，洪永福，章玲，等.皱皮木瓜化学成分的研究[J].中草药，1997,28(10)：584-585.[3] 张冬松，高慧媛，吴立军.光皮木瓜的化学成分药理成分及临床研究进展[J].沈阳药科大学学报，2007,24(11):721-725.[4] 王文平，郭祀远，李琳，等.野木瓜水溶性多糖的分离纯化及抗补体活性研究[J].食品科学，2008,29(5):120-124.[5] 李才国，刘睿.木瓜多糖的提取、分离和鉴定[J].现代商贸工业，2007,19(2):172-174.[6] 黄锁义，刘胜利，郭立强，等.正交设计优化木瓜多糖的超声提取工艺[J].安徽农业科学，2012，40(5):2618-2620.[7] 王文平，郭祀远，李琳，等.野木瓜水溶性多糖的提取、分离及结构分析[J].华南理工大学学报(自然科学版)，2008,36(7):128-133.[8] 刘捷，王文，卢奎，等.皱皮木瓜多糖的提取及其抗氧化活性研究[J].河南工业大学学报(自然科学版)，2011,30(1):48-52.[9] 聂少平，谢明勇，申明月,等.应用高效液相色谱法测定茶叶多糖[J].食品科学,2006,27(4):178-181.[10]PITKANEN E. 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皱皮木瓜组分含量测定及药理作用研究进展齐红;秦华;郭庆梅【期刊名称】《中国执业药师》【年(卷),期】2016(0)8【摘要】There are many chemical constituents with functions of protecting liver , anti-tumor , anti-inflammation and easing pain in Fructus chaenomelis , such as triterpenes , organic acids , and saccharides , etc . In order to further control the quality , ensure the clinical effectiveness as well as develop and utilize this resource , this paper reviews the progress in research on determination of constituent content and pharmacological action of Fructus chaenomelis .%皱皮木瓜的化学成分主要有三萜类、有机酸类、糖类等，具有保肝、抗肿瘤、抗炎镇痛等功效，为更好地控制木瓜药材的质量，保证药效，进一步开发利用木瓜资源，本文对皱皮木瓜相关组分含量测定及药理作用的研究进展进行了综述。
【总页数】4页(P39-42)【作者】齐红;秦华;郭庆梅【作者单位】济南市食品药品检验检测中心，山东济南250102;济南市食品药品检验检测中心，山东济南250102;山东中医药大学，250355【正文语种】中文【相关文献】1.麻黄素药理作用及含量测定的研究进展 [J], 杨林萍2.盐酸表柔比星药理作用及含量测定研究进展 [J], 刘超;张萍3.麻黄药理作用及含量测定的研究进展 [J], 陆燕萍;刘佳丽;巩晓宇;苏雪媚;邱凤邹4.皱皮木瓜化学成分与药理作用研究进展 [J], 李云志;江洪波5.薯蓣皂苷提取方法、含量测定及药理作用的研究进展 [J], 米未因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
摘要木瓜(Fructus Chaenomelis)是临床常用中草药之一，药理实验研究表明，木瓜具有保肝、抗菌等作用。
木瓜中含有黄酮、齐墩果酸等多种有效药用成分，还被认为是良好的植物超氧化物歧化酶(SOD)来源，本文对其综合利用进行了研究。
由于目前尚未有文献对木瓜中SOD含量测定或提取的报道，本文首先对新鲜木瓜进行SOD的提取和活力测定，并与其他几种常见蔬菜包括青椒、豌豆、大蒜黄豆进行比较。
采用邻苯三酚自氧化法和氮蓝四唑(NBT)光还原法分别对它们进行活力的测定，讨论了两种测定方法的优缺点，最后确定NBT光还原法更适合本课题中酶活力的测定，根据两种不同方法对SOD酶活力测定结果进行换算，确定了两种方法测定结果之间的转换系数为3.5～3.98，并测定出木瓜中SOD的活力为55.9U/g(FW)·h。
低于其他被测的几种常见蔬菜。
根据上述结果，指出木瓜不是工业提取植物SOD的合适原料。
其次，用提取SOD后晾干的木瓜渣联合提取黄酮和齐墩果酸。
提出了综合提取工艺流程：木瓜以95％乙醇渗漉，渗漉液浓缩、水洗、多次酸碱沉淀，获得齐墩果酸，采用紫外分光光度法测得其得率为0.0146%；渗漉后残渣用70％乙醇回流提取，聚酰胺柱层析分离，获得黄酮，采用硝酸铝络合分光光度法测得其得率为0.307%。
上述结果表明黄酮提取工艺基本可行，齐墩果酸提取工艺有待改进。
关键词：超氧化物歧化酶，黄酮，齐墩果酸，提取AbstractPapaya (Fructus Chaenomelis) is one of the commonly used traditional Chinese herbal medicines. Pharmacological studies indicate that papayas have liver protection and antibacterial effects. Papaya contains flavonoids, oleanolic acid and other active ingredients, it is also considered to be a good source of botanic superoxide dismutase (SOD). In this thesis, the comprehensive utilization of papayas was studied.There is no report about the method for determination or extraction of SOD from papaya, in this paper, first, SOD was extracted from fresh papayas and the activity of SOD was determined, the result was compared with those of several other common vegetables, including green peppers, peas, garlic and soybeans. The activity of SOD was determined by using pyrogallol autoxidation method and NBT-reduction method, respectively, and found that NBT-reduction method is more suitable for SOD detection in the extraction of papayas. According to the results of two different methods, the transfer coefficient of the results of two SOD detection methods was found to be 3.50～3.98. It was found that the activity of SOD in papaya is only 55.9 U/g (FW) •h, which is lower than that of above mentioned plants. This result means that papaya is not a suitable raw material for industrial extraction of botanic SOD.Second, dried residue of the papaya after SOD extraction is used for extracting flavonoids and oleanolic acid. The comprehensive extraction method was suggested. Dry papaya was percolated with 95% ethanol and percolate was condensed, washed with water, repeatedly precipitated with acid and base and then oleanolic acid was obtained. The content of oleanolic acid was determined by UV spectrophotometry and found the yield of oleanolic acid was 0.0146%. Residue after percolated was extracted with 70% ethanol and segregated with polyamide column chromatography, and then flavonoids was obtained , the content of total flavonoids was determined using aluminum nitrate complex spectrophotometry method and found the yield of total flavonoids was 0.307%.These results indicate flavonoids extraction process is feasible, however, the oleanolic acid extraction process should be improved.Key words: superoxide dismutase, flavone, oleanolic acid, extraction目录摘要 (I)Abstract (II)1 绪论1.1 木瓜的本草考证 (1)1.2 木瓜的化学成分研究进展 (1)1.3 木瓜生物活性研究进展 (2)1.4 黄酮类化合物及其性质 (4)1.5 黄酮类化合物的提取[27] (5)1.6 黄酮类化合物的生物活性 (6)1.7 齐墩果酸及其性质 (6)1.8 超氧化物歧化酶及其性质 (8)1.9 本文的研究目的及主要内容 (11)2 木瓜中超氧化物歧化酶的提取及活力的测定2.1 引言 (12)2.2 试验试剂及所用的仪器 (12)2.3 SOD的粗提取 (13)2.4 酶活力的测定 (15)2.5 木瓜及其他常见食物中SOD酶的含量比较 (20)2.6 本章小结 (23)3 黄酮和齐墩果酸的综合提取工艺研究及含量的测定3.1 引言 (24)3.2 仪器与试剂 (24)3.3 黄酮和齐墩果酸的联合提取 (24)3.4 黄酮类化合物含量及木瓜总黄酮收率的测定 (27)3.5 齐墩果酸的收率测定 (29)3.6 结果与讨论 (30)3.7 本章小结 (32)４全文总结4.1 主要研究结果 (33)4.2 本文特色与创新之处 (33)致谢 (34)参考文献 (35)1 绪论木瓜正品为皱皮木瓜，又名铁脚梨、宣木瓜、酸木瓜、空儿木瓜、木瓜实。
第 47 卷 第 6 期2018 年 6 月Vol.47 No.6Jun. 2018化工技术与开发Technology & Development of Chemical Industry基金项目：安徽省自然科学基金项目（1808085MH248）作者简介：李云志（1970-），男，汉族，安徽无为人，博士，副教授，从事天然药物化学专业教学科研工作。
E-mail: yun126126@ 收稿日期：2018-03-26皱皮木瓜化学成分与药理作用研究进展李云志1，江洪波2（1.安徽中医药大学药学院，安徽 合肥 230045；2.四川中医药高等专科学校，四川 绵阳 621000）摘 要：皱皮木瓜含有萜类、黄酮类、香豆素类等多类次级代谢产物类型，具有镇痛、抗氧化、抗炎、治疗腹泻、抗癌、松弛胃肠道平滑肌和 β2-肾上腺素受体激动作用等多种药理作用。
本文综述了皱皮木瓜的相关研究成果，旨在为其进一步的开发利用提供参考。
关键词：皱皮木瓜；化学成分；药理作用中图分类号：R 284.1 文献标识码：A 文章编号：1671-9905(2018)06-0035-04综述与进展蔷薇科（Rosaceae）木瓜属（Chaenomeles）植物全世界共有5个种，分别为皱皮木瓜（Chaenomeles speciosa）、木瓜（Chaenomeles sinensis）、毛叶木瓜（Chaenomeles cathayensis）、西藏木瓜（Chaenomeles thibetica） 和日本木瓜（Chaenomeles japonica）。
前4种植物产于我国，日本木瓜不在我国原产，但目前我国已有栽培[1]。
皱皮木瓜为蔷薇科木瓜属植物贴梗海棠[Chaenomeles speciosa (Sweet) Nakai]的干燥成熟果实，又名铁脚梨、宣木瓜、酸木瓜、空儿木瓜、木瓜实，为传统中药，性温味酸，有舒筋、活络、健脾开胃、舒肝止痛、祛风除湿之功效，可用于预防和治疗风湿、霍乱、痢疾、肠炎、脚气病及维生素 C 缺乏症等[2]。
※工艺技术_品龃享2017, Vol.38, No. 10 229皱皮木瓜籽油提取工艺优化及其理化性质和抗氧化活性邓叶俊\黄立新1A H!，张彩虹i谢普军i张琼S丁莎莎1(1.中国林业科学研宄院林产化学工业研究所，生物质化学利用国家工程实验室，国家林业局林产化学工程重点开放性实室, 江苏省生物质能源与材料重点实验室，江苏南京210042; 2.中国林业科学研宄院林业新技术研宄所，北京100091)摘要：以皱皮木瓜籽为原料，研宄洛剂浸提法提取皱皮木瓜籽油的最佳工艺。
在单因素试验的基础上，进行 正交试验优化分析，确定皱皮木瓜籽油的最佳提取工艺条件为：料液比1:4 (g/m L)、提取温度60 °C、提取时间 150 m in。
在该条件下皱皮木瓜籽油的提取率为28.48%。
皱皮木瓜籽油的酸值和过氧化值等指标达到了食用油脂的 标准。
将皱皮木瓜籽油甲酯化后，利用气相色谱-质谱联用法鉴定出12种脂肪酸，主要为油酸（42.69%)、亚油酸(32.46%)、棕榈酸（12.92%)、硬脂酸（4.82%)、花生酸（3.27%),不饱和脂肪酸含量达77.42%^通过测定清除1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（U-diphenyl-2-picrymydrazyl, DPPH)自由基和羟自由基能力来评价皱皮木瓜籽油 的抗氧化活性，结果表明对DPPH自由基和羟自由基的IC5…分别为8.51、0.396mg/mL。
关键词：皱皮木瓜籽油；提取；工艺优化；理化性质；抗氧化活性Optimization of Extraction,Physicochemical Properties and Antioxidant Ability of Chaenomeles speciosa(Sweet)Nakai Seed OilDENG Yejun1, HUANG Lixin1'2'**, ZHANG Caihong1'2, XIE Pujunu, ZHANG Qiong1, DING Shasha1(1. Jiangsu Province Key Laboratory of Biomass Energy and Material, Key and Open Laboratory of Forest Chemical Engineering,State Forestry Administration, National Engineering Laboratory for Biomass Chemical Utilization, Institute of Chemical Industry of Forest Products, Chinese Academy of Forestry, Nanjing 210042, China;2. Research Institute of Forestry New Technology, Chinese Academy of Forestry, Beijing 100091, China)Abstract: The conditions for solvent extraction of Chaenomeles speciosa (Sweet) Nakai seed oil (CSNSO) were optimized using one-factor-at-a-time and orthogonal array design methods. A solid-to-liquid ratio o f 1:4 (g/mL); an extraction temperature o f 60 °C and an extraction time of 150 min were found to be optimal for the maximum oil yield (28.48%). Both the acid value and peroxide value of CSNSO met the quality standard for edible oils and fats. After methyl esterification,12 fatty acids were identified by gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS), and the major fatty acid in the oil wasoleic acid, which accounted for 42.69% of the total fatty acids, followed by linoleic acid (32.46%), palmitic acid (12.92%), stearic acid (4.82%) and arachic acid (3.27%). The relative content of unsaturated fatty acids was as high as 77.42%.The antioxidant activity o f CSNSO was estimated by testing DPPH free radical and 'OH scavenging ability, and the 50% inhibitory concentration (IC50) values were determined to be 8.51 and 0.396 mg/mL, respectively.Key words:Chaenomeles speciosa(Sweet) Nakai seed oil; extraction process; process optimization; physicochemical properties; antioxidant activityD01:10.7506/spkxl002-6630-201710038中图分类号：TS201.1 文献标志码： A 文章编号：1002-6630 (2017) 10-0229-07引文格式：邓叶俊，黄立新，张彩虹，等.皱皮木瓜籽油提取工艺优化及其理化性质和抗氧化活性[J].食品科学，2017, 38(10): 229-235. DOI: 10.7506/spkx1002-6630-201710038. DENG Yejun, HUANG Lixin, ZHANG Caihong, et al. Optimization of extraction, physicochemical properties and antioxidant ability of Chaenomeles speciosa (Sweet) Nakai seed oil[J]. Food Science, 2017, 38(10): 229-235. (in Chinese with English abstract) D01:10.7506/spkxl002-6630-201710038. 收稿日期：2016-06-03基金项目：“十三五”国家重点研发计划重点专项（2016YFD0600800);中国林业科学研究院中央级公益性科研院所基本科研业务费专项（CAFYBB2016QA011)作者简介：邓叶俊（1993—），男，硕士研究生，主要从事天然产物深加工研究。
微波法提取广西凌云特产新鲜川木瓜总酚的优化工艺吴平妹;韦力心;周圆圆;张娥芳;李振中;黄祖良【期刊名称】《安徽农业科学》【年(卷),期】2015(000)024【摘要】[目的]探讨微波法提取广西凌云特产新鲜川木瓜(皱皮木瓜)总酚的最优工艺.[方法]以没食子酸为对照品,用紫外-可见分光光度法,测定广西凌云特产川木瓜总酚含量.采用正交试验纤维素酶辅助提取的方法,考察提取溶剂浓度、微波功率、提取时间、提取次数、料液比等因素对广西凌云特产川木瓜总酚提取率的影响.[结果]以乙醇浓度80％,微波输出功率中高火,微波处理时间90s,提取2次,料液比1∶3 g/ml5个因素水平为最佳提取条件,此条件下凌云特产川木瓜总酚的提取率为0.0443％.[结论]此方法操作简便,重复性、稳定性良好,准确可靠,可为广西凌云特产川木瓜的质量控制及开发利用提供一定的方法和依据.【总页数】4页(P235-237,240)【作者】吴平妹;韦力心;周圆圆;张娥芳;李振中;黄祖良【作者单位】右江民族医学院药学院,广西百色533000;右江民族医学院药学院,广西百色533000;右江民族医学院药学院,广西百色533000;右江民族医学院药学院,广西百色533000;右江民族医学院药学院,广西百色533000;右江民族医学院药学院,广西百色533000【正文语种】中文【中图分类】S661.6【相关文献】1.微波法提取新鲜双孢菇菇柄核酸的工艺研究 [J], 刘丽娜;魏书信;王安建;李静2.微波法提取番木瓜皮果胶工艺研究 [J], 杨明;刘晓辉;何培仪3.广西凌云产川木瓜总黄酮保肝降酶作用的实验研究 [J], 覃洪含;陈壮;肖刚;黎为能;曾海生4.超声波法提取凌云特产川木瓜总黄酮的优化工艺∗ [J], 莫柳艳;肖军;张玉瑛;黄晓雪;李振中5.广西凌云川木瓜的药用价值开发利用 [J], 李振中;李容;黄祖良;冯廷芳;陈翠丽因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
木瓜药材中绿原酸、咖啡酸提取工艺研究陶君彦;熊富良;张琼光;肖飞;李崇明;黄志军【期刊名称】《中成药》【年(卷),期】2007(029)006【摘要】木瓜（fmit of Chaenomeles，or Chinese quince）为蔷薇科植物皱皮木瓜Chaenomeles speciosa（Sweet）Nakai的干燥近成熟果实，为常用中药。
木瓜药材中含有绿原酸和少量咖啡酸，文献报道两种成分具有利胆、升高白细胞的作用；它们对各种急性细菌感染疾病及由放疗、化疗所致的白细胞减少症有显著疗效。
因此本实验主要对木瓜中绿原酸、咖啡酸的提取条件进行考察，【总页数】3页(P904-906)【作者】陶君彦;熊富良;张琼光;肖飞;李崇明;黄志军【作者单位】华中科技大学生命科学与技术学院,湖北,武汉,430074;武汉健民药业集团股份有限公司,湖北,武汉,430052;武汉健民药业集团股份有限公司,湖北,武汉,430052;武汉健民药业集团股份有限公司,湖北,武汉,430052;武汉健民药业集团股份有限公司,湖北,武汉,430052;武汉健民药业集团股份有限公司,湖北,武汉,430052【正文语种】中文【中图分类】R284.2【相关文献】1.正交实验优化微波辅助提取忍冬藤中绿原酸和咖啡酸工艺研究 [J], 李克;吴龙琴;汤淏;王曙东2.HPLC测定蒲公英药材、浸膏、制剂中绿原酸、咖啡酸含量 [J], 李喜凤;孟璐3.绵茵陈药材中绿原酸提取工艺优化 [J], 伍彬;江尚飞;邱妍川;杨宗发4.高效液相色谱法测定金银花连翘提取物中绿原酸、咖啡酸的含量 [J], 金智利;袁文婧5.超声波法提取山楂中咖啡酸的工艺研究 [J], 孙忠思;苏豫梅;魏忠环;李清清;李秉超因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
