显微镜及制片技术

实验一微生物制片及形态观察一、显微镜油镜的使用显微技术是微生物检验技术中最常用的技术之一。

显微镜的种类很多，在实验室中常用的有：普通光学显微镜、暗视野显微镜、相差显微镜、荧光显微镜和电子显微镜等。

1. 结构光学显微镜是由光学放大系统和机械装置两部分组成。

光学系统一般包括目镜、物镜、聚光器、光源等；机械系统一般包括镜筒、物镜转换器、镜台、镜臂和底座等（图1－1）。

图1－1 光学显微镜结构图标本的放大主要由物镜完成，物镜放大倍数越大，它的焦距越短。

焦距越小，物镜的透镜和玻片间距离（工作距离）也小。

油镜的工作距离很短，使用时需格外注意。

目镜只起放大作用，不能提高分辨率，标准目镜的放大倍数是十倍。

聚光镜能使光线照射标本后进入物镜，形成一个大角度的锥形光柱，因而对提高物镜分辨率是很重要的。

聚光镜可以上下移动，以调节光的明暗，可变光栏可以调节入射光束的大小。

显微镜用光源，自然光和灯光都可以，以灯光较好，因光色和强度都容易控制。

一般的显微镜可用普通的灯光，质量高的显微镜要用显微镜灯，才能充分发挥其性能。

有些需要很强照明，如暗视野照明、摄影等，常常使用卤素灯作为光源。

2. 原理显微镜的放大效能（分辨率）是由所用光波长短和物镜数值口径决定，缩短使用的光波波长或增加数值口径可以提高分辨率，可见光的光波幅度比较窄，紫外光波长短可以提高分辨率，但不能用肉眼直接观察。

所以利用减小光波长来提高光学显微镜分辨率是有限的，提高数值口径是提高分辨率的理想措施。

要增加数值口径，可以提高介质折射率，当空气为介质时折射率为1，而香柏油的折射率为1.51，和载片玻璃的折射率（1.52）相近，这样光线可以不发生折射而直接通过载片、香柏油进入物镜，从而提高分辨率。

显微镜总的放大倍数是目镜和物镜放大倍数的乘积，而物镜的放大倍数越高，分辨率越高。

3. 使用方法1）低倍镜观察先将低倍物镜的位置固定好，然后放置标本片，转动反光镜，调好光线，将物镜提高，向下调至看到标本，再用细调对准焦距进行观察。

显微制片技巧显微制片技巧一、粉末制片法1．粉末的制备选取有代表性的样品适量，剪成长约0.1cm的小段，置50~60℃的烘箱中干燥（含挥发油的药材温度应更低，把持在30~40℃），然后用粉碎器粉碎，常用的粉碎器有冲窝、铁碾、微型粉碎机等。

粉碎后的粉末过50~60目筛，成药则应过100目筛，置清洁的瓶中备用。

制备粉末时应注意不得有其它的杂物混入，样品应全体过筛，不得留有残渣弃取，过筛后的粉末需充足混匀方可装片。

2．制片方法依据须要不同，可作成临时或永久制片。

（1）临时制片：作临时观察用，随用随作，通常仅能保留1~2周。

直接封片法不经任何处理，直接用于封藏液装片后即可视察。

常用的封躲液有如下几种：a．水：常用蒸馏水。

用于观察淀粉粒等多糖类物质，但易引起淀粉粒膨胀变形，欲测定粉粒大小时不宜用水作封藏剂。

b．稀甘油：用于观察糊粉粒、淀粉粒及其它多糖类物质，为显微制片中最常用的封藏剂。

经水合氯醛透化的电影多加稀甘油一滴，还可防止水合氯醛结晶的析出。

配制时应注意冬气象温低，粘度小，装片时易产赌气泡，可适当配浓一点，而夏天则相反，可配稀一点。

c． 50%甘油酒精：适用范畴同上，透明度较上者强。

d．甘油醋酸液：专用于观察淀粉粒的形态，是目前观察淀粉粒最幻想的封藏剂，可使淀粉粒坚持本来的状况而不膨胀变形，便于测定其大小。

e．乙醇：主要用于观察菊糖及橙皮柑结晶。

因乙醇易挥发，故装片后应立即观察，放置稍久则乙醇挥发产生大批汽泡。

f．水合氯醛：一般作为透明剂，在观察菊糖时，用其作为封藏液，不加热，装片后立即观察，往往能得到比乙醇装片更为幻想的后果。

方法：取干净载玻片，滴加封藏剂1～2滴，用解剖针或火柴杆挑取粉末少许与封藏剂混匀，然后用镊子夹住盖玻片的边沿中部或用食指及拇指拿住盖玻片的边沿，将其一侧边缘压在封藏液旁的载玻片上，慢慢放下至程度地位，用滤纸屑干净载片即可。

装片过程中应注意封藏液要适量，若不足则封藏液不能充斥盖片；过多则溢出盖片，使盖玻片浮动，并易将封藏液溢到盖玻片上面。

实验3 减数分裂制片技术和显微镜观察一、实验目的1. 学习花粉母细胞涂抹制片技术，观察细胞减数分裂时期染色体变化规律及特征并绘图。

2.观察花蕾或花药长度与减数分裂时期的关系。

二、实验原理减数分裂是生物在性母细胞成熟形成配子过程中发生的一种特殊有丝分裂，它包括连续两次的细胞分裂阶段，最终分裂为染色体数目减半的四个子细胞，从而发育为雌性或雄性配子（n）。

由于植物花药取材容易，操作和鉴定比较方便，故一般都取用花粉母细胞作为减数分裂制片材料。

在生物发育的适宜时期取样、固定、涂片等程序，便可在显微镜下观察到减数分裂过程中染色体的行为变化。

三、实验材料lily百合（2n=24）四、实验步骤（一）取材lily百合：通常花蕾长度18mm（花药长度8mm）时为花粉母细胞分裂始期。

花蕾约40mm（花药长17mm）时为减数分裂终期。

采集18-40mm不同长度的花蕾，固定，保存。

（二）制片从小花中取出花药1~3 枚置于载玻片 滴一滴醋酸洋红溶液 用镊子按压花药 去尽肉眼可见残渣 染色2分钟 盖上盖玻片 在低倍镜下寻找花粉母细胞 高倍镜下观察各分裂相细胞染色体的特征及变化规律.选择典型分裂相的临时片1~2张 在酒精灯火焰上缓缓烘干（不能沸腾！） 将玻片放入液氮罐，在液氮表面冷冻1分钟 取出玻片放在白纸上，手按盖玻片一边，用刀片从另一边将盖玻片揭开置于白纸上（有材料的一面朝上） 滴一滴中性树胶在载玻片上的材料处 原位盖上盖玻片→树胶凝固后镜检。

1. 取花药1枚（截）置载玻片中央2. 加1滴染色液3.用镊子按压，并镊除可见残渣4.放上盖玻片（三）显微镜观察先在低倍镜下寻找具分裂相的花粉母细胞，然后依次转换到高倍镜观察减数分裂各个时期染色体的行为和形态特征。

区分4 类细胞：1 形状较大，圆形，核大，着色较浅的是花粉母细胞。

2 形状较小、着色较深的是花药壁体细胞。

3 形状居中略呈扇形的是四分体的小孢子。

4 形状较大，内部透明并有明显外壳的是成熟的花粉粒。

实验一组织制片技术（一）【实验原理】显微鉴定法就是利用显微镜、显微技术及显微化学方法等对中药进行分析鉴定的方法。

可以确定中药的真伪、纯度、品质以及建立鉴别标准。

目前多数用于品种鉴定，部分用于定量分析。

在鉴定过程中，以采用显微镜观察动、植物的组织构造、细胞形状、内含物的特征以及矿物的光学特性等为主要内容。

按照鉴定的方法可分为组织鉴定、粉末鉴定、显微常数测定和显微定量等。

组织鉴定是粉末鉴定的基础，以粉末鉴定应用最为广泛。

显微鉴定是一项专门技术，需要有植物(动物)解剖学、矿物学的晶体光学、植物显微化学等基本知识，并掌握显微制片、显微观察和描述、显微摄影和绘图、显微测量等基本技术。

显微鉴定的主要仪器有各类光学显微镜和电子显微镜等，通常使用光学显微镜。

【目的要求】1.掌握显微制片方法2.掌握显微测量的方法和放大倍数的使用3.掌握显微特征的观察与描述方法和显微绘图技术4.熟悉掌握显微测定尺的使用方法5.了解显微摄影技术与方法【仪器、试剂、材料】1.仪器生物显微镜，目镜测微尺，镜台测微尺，显微描绘器，镊子，解剖针，载玻片，盖玻片，酒精灯，单面刀片，粉碎机，绘图板，铅笔等。

2.试剂水合氯醛试剂，苏丹Ⅲ试液，稀甘油试剂，盐酸，硝酸，碘化铋钾试剂，氯化锌碘试液，硫酸，α-萘酚浓硫酸试液，碘试液，间苯三酚试液，钌红试液，硝酸汞试液，乙醚，石油醚，90%乙醇，70%乙醇，α-萘酚乙醇溶液，稀盐酸，稀醋酸等。

3.药材样品：牛膝、薄荷4.药材粉末：大黄、肉桂、山药【实验内容】一、显微鉴定1.组织鉴定组织鉴定是通过观察中药的组织构造特征来达到鉴定目的，主要用于个体较小的完整药材鉴别。

通常用以鉴别药材性状特征不明显或外形相似而组织构造不同的类似品、混淆品、代用品、伪品，或用于多来源药材的对比鉴别，也可用于确定某种化学成分的存在部位，以考查质量。

一般地说，组织鉴定对不同科属来源的药材鉴别比较容易，对于相同科属来源的药材鉴别比较困难。

明视野显微镜的原理及使用1、定义：通过聚焦镜汇聚到样品上，因而形成一个锥形的明亮光束并通过样品进入物镜的显微镜。

用于观察经染色或本身具备颜色的细胞、组织片等标本。

明视野显微镜是最通用的一种光学显微镜。

2、组成部件⑴机械系统部分①镜座显微镜的基本支架，由底座和镜臂组成。

②载物台支持被检标本的平台。

③镜筒空心的圆筒，装置于镜臂上端，上接目镜，下接转换器。

目前，显微镜多见斜筒式，特别是双镜斜筒的，使观察时眼睛不易疲劳，用起来方便。

④转换器位于镜筒的下端，是一个可以旋转的圆盘，用于装物镜。

镜检时，转动转换器转换物镜。

⑤调焦装置包括粗细调焦旋钮，是调节载物台上下移动的装置。

它是获得清晰图像的关键。

粗调只做粗略的调焦，对低倍观察仅用粗调就能获得清晰图像，在采用高倍镜和油镜时，粗调获得模糊物象后，还需细调才能看清物象。

⑵光学系统部分①物镜分为干燥系物镜（放大60倍以下的物镜）和油浸系物镜（放大100被的物镜）。

干燥系物镜和标本之间的介质是空气；油浸系物镜与标本之间必须加入香柏油才能观察到清晰物象。

物镜的放大倍数常有8×、10×、20×、40×、60×、100×。

一般光学显微镜仅有其中的3-4种。

②目镜插入镜筒上端，供眼睛观察物象用。

一般目镜镜筒越长，放大倍数越小。

常有3×、5×、8×、10×、15×等种数。

③集光器可以上下移动，以调节最适光度，附有的虹彩光圈，用于调节光线的强弱。

3、使用方法及注意事项。

⑴观察任何需要镜检的标本都可以先用低倍镜观察，找到目标物，然后旋动转化器转换成高倍镜观察，再适度旋转细调焦旋钮，就能观察到目的物象。

⑵油镜的使用镜检细菌及真菌菌体形态时需采用放大100被的油镜。

需要在标本与镜头之间滴加香柏油。

镜检完毕后，先用插镜纸将镜头上的香柏油擦去，再用擦镜纸蘸少许二甲苯，将镜头上残留的香柏油擦去，并将二甲苯擦去。

光学显微标本的制作技术【实验目的】了解光学显微镜切片制作技术的基本方法步骤。

【实验原理】采用光学显微镜研究一般生物体的内部结构，在自然状态下是无法观察清楚的，多数动、植物材料都必须经过某种处理，将组织别离成单个细胞或薄片，光线才能通过细胞。

为了适应这个需要，就产生了光学显微镜制片技术。

光学显微镜的制片技术方法可分为两大类：一类是非切片法，另一类是切片法。

非切片法，是用物理或化学的方法，使细胞彼此别离，如有别离法、涂布法、压碎法等。

非切片法的操作比较简单，能保侍细胞的完整，但是细胞之间的正常位置往往被更动，无法反映细胞之间的正常联系。

它可以与切片法配合使用，各取其长处。

切片法，是利用锐利的刃具将组织切成极薄的片层，材料须经过一系列特殊的处理，如固定、脱水、包埋、切片、染色等，过程十分繁复。

在制作过程中，还要经过一系列的物理和化学的处理，这些处理方法可根据各种不同材料的性质要求进行合理选择。

切片法虽然工序繁琐，技术复杂，但是，它最能保持细胞间的正常的相互关系，能较好和较长时间地保留细胞的原貌，所以仍然是光学显微镜的主要制片方法。

【实验仪器、材料和试剂】〔一〕仪器：石蜡切片机、恒温蜡箱、载玻片、盖玻片〔二〕材料：洋葱根或小鼠肝〔三〕试剂：乙醚、无水乙醇、甲醛、冰醋酸、苦味酸、重铬酸钾、锇酸、正丁醇、二甲苯、石蜡、甘油、鸡蛋、纱布、加拿大树胶、麝香草酚【方法与步骤】光学显微镜切片制作技术最简单的切片法是徒手切片，但是由于组织块往往十分柔软，18切削很困难，而且无法得到十分菲薄的切片，因此必须先用某些特殊物质渗入组织块的内部起支持作用，并将整个组织块包住，然后再用精密的切片机制作切片，才能获得良好的效果。

这种方法称为包埋法，包埋的物质称为包埋剂。

常用的包埋剂有石蜡、火棉胶、炭蜡、明胶等，水和塑料也可作为包埋剂。

根据包埋剂的不同，分别有石蜡切片、火棉胶切片、冰冻切片等，它们各有长处，可以根据需要选用，但是使用得最多的还是石蜡切片技术。

中药显微鉴定知识总结中药鉴定常用的鉴定方法有：（原植物、动物和矿物）鉴定法、性状鉴定法、显微鉴定法及理化鉴定法等。

显微鉴定法是利用显微技术对中药进行显微分析，以确定其品种和质量的一种鉴定方法。

显微鉴定主要包括组织鉴定和粉末鉴定，利用显微镜来观察药材的组织构造、细胞形状及内含物的特征、矿物的光学特性，和用显微化学方法，确定细胞壁及细胞内含物的性质或某些品种有效成分在组织中的分布等，用以鉴别药材的真伪与纯度甚至品质。

（一）显微制片方法显微鉴定时可根据检品的不同情况制作相应的制片，包括横切片或纵切片、表面制片、粉末制片、解离组织片、花粉粒与孢子制片、磨片制片、含粉末药材的制剂显微纸片等。

制作解离组织片时，解离液选择原则为：如样品中薄壁组织占大部分，木化组织少或分散存在，可用氢氧化钾法；如果样品坚硬，木化组织较多或集成较大群束，可用硝铬酸法或氯酸钾法。

（二）植物细胞壁和内含物的鉴别（1）细胞壁性质的鉴别：①木质化细胞壁加间苯三酚试液显红色或紫红色。

②木栓化或角质化细胞壁加苏丹Ш显橘红色至红色。

③纤堆素细胞壁加氯化锌碘试液显蓝色或紫色。

④硅质化细胞壁加硫酸无变化。

（2）细胞内含物性质的鉴别：①淀粉拉加碘试液显蓝色或紫色。

②糊粉粒加碘试液显棕色或黄棕色。

加硝酸汞试液显砖红色。

③脂肪油、挥发油或树脂加苏丹Ш试液显橘红色、红色或紫红色。

④菊糖加10%α-萘酚乙醇溶液，再加硫酸显紫红色并很快溶解。

⑤黏液加钌红试液显红色。

⑥草酸钙结晶加稀醋酸不溶解，加稀盐酸溶解而无气泡发生。

加硫酸逐渐溶解，析出结晶。

⑦碳酸钙结晶（钟乳体）加稀盐酸溶解，同时有气泡发生。

⑧硅质加硫酸不溶解。

（四）显微临时制片常用封藏试液显微鉴定所用试剂包括水、稀甘油、甘油醋酸试液及水合氯醛试液。

（五）扫描电子显微镜和偏光显微镜的应用扫描电镜已广泛应用于生物样品表面及其断面立体形貌的观察。

偏光显微镜主要用于观察和分析矿物类中药的光学性质。

（六）1、细胞壁性质的鉴别：木质化细胞壁：间苯三酚，显红色或紫红色;木栓化(角质化)细胞壁：苏丹Ⅲ号，加热后显红色;纤维素细胞壁：氯化锌碘试液，显蓝色或紫色;硅质化细胞壁：硫酸无变化 2、细胞内含物的鉴定淀粉粒：加碘试液，蓝色或紫色。