大鼠缺血模型

phenol reagent[J].J Boil Chem,1951,193:265.[4]　Chandan K S,Lester P.Antioxidant and redoxregulation ofgenetranscription[J].FASE B J,1996,10(2):109-120. [5]　Reiter R J,T ang L,G arcia JJ,et al.Pharmacological actionsof melatonin in oxygen radical pharmacology[J].Life Sci, 1997,60(25):2255-2271.[6]　Fernando A,Barclay LRC,Ing old K U,et al.On the antiox2idant activity of melatonin[J].Free Rad Bio Med,1999,36(1/2):117-128.[7]　S iesjo BK,Zhao Q,Pahlmark K,et al.G lutamate,calcium,and free radicals as mediators of ischemia brain damage[J].Ann Thorac Surg,1995,59(5):1316-1320.[8]　K otler M,R odriquez C,Sainz RM,et al.Melatonon increas2es gene expression for antioxidant enzymes in rat brain cortex [J].J Pineal Res,1998,24(2):83-89.[9]　Bettahi I,P ozo D,Osuna C,et al.Physiological concentra2tions of melatonin inhibit nitric oxide synthase activity in rat hypothalamus[J].J Pineal Res,1996,20(4):205-210.收稿日期:2000-10-26　修回日期:2001-02-15本文编辑:程春开3种大鼠全脑缺血模型定量脑电图的实验研究Ξ吴克俭,花　放,孙景玲(徐州医学院附属医院神经内科,江苏徐州221002) 摘要:目的　比较正常大鼠不同电极联接方式的脑电图的差异,并以脑电图作为判定指标,评价3种全脑缺血大鼠模型的缺血效果。

大鼠大脑中动脉缺血模型
大鼠大脑中动脉缺血模型是一种用于研究脑血管疾病的实验动物模型。

该模型通过阻塞大鼠大脑中动脉，使特定区域的脑组织缺氧，从而模拟脑卒中等脑血管疾病的病理过程。

该模型的建立常用的方法有两种：颅骨开窗法和线栓法。

颅骨开窗法是通过手术在大鼠头部挖取窗口，暴露出脑表面的动脉，然后用丝线或微疏松的阻塞物将动脉堵塞，造成脑缺血。

线栓法则是将一根细线或者硬化的凝血物插入大鼠颈动脉，将其推进至前大脑动脉分支处，从而阻塞动脉血流。

这种模型可以模拟脑血管疾病引起的脑缺血损伤，包括缺血区域的神经元死亡、神经胶质细胞激活、炎症反应等。

研究人员可以通过该模型观察脑缺血后的病理变化和分子机制，评估各种药物或治疗方法对脑缺血的治疗效果。

需要注意的是，动物实验必须符合伦理规范和相关法律法规，研究人员应尽量减少动物的痛苦和不适。

同时，在进行实验前需要仔细设计实验方案，选择适当的动物模型和操作方法，以确保实验结果的可靠性和准确性。

大鼠脑缺血模型制作大鼠脑缺血是一种神经病理学状态，常用于研究脑缺血和再灌注相关的疾病，如中风和心脑血管疾病。

制作大鼠脑缺血模型可以帮助研究者深入了解脑缺血的机制，并探索治疗方法。

下面将介绍一种常用的大鼠脑缺血模型制作方法。

材料准备：1.正常健康的大鼠（约250-300g）2.异氟醚（用于麻醉大鼠）3.氧化氮（用于麻醉大鼠）4.0.9%氯化钠溶液（生理盐水，用于预先裂解血栓）5.弹簧夹（用于阻断大脑供血）6.血管夹（用于再灌注）7.生理盐水或PBS（用于清洗伤口和冲洗大脑）操作步骤：1.麻醉大鼠-以适当的浓度向氧化氮罩中送气，让大鼠吸入异氟醚麻醉。

-确定大鼠是否处于麻醉状态，如失去帕金森反射。

-为了确保大鼠的安全性和麻醉质量，要定期监测大鼠的许多生理参数，如呼吸频率、血氧饱和度和体温。

2.颅窗手术-将大鼠固定在手术台上，用5%碘伏消毒实验区域的皮肤。

-在头部进行剃发和消毒。

- 用手术刀在头部切开皮肤，在颅骨上切开一个直径约 1 cm的圆洞。

-清除头骨上的组织，暴露出颅骨。

-用电动开骨钻在颅骨上进行微抖动，直到打开一个圆洞。

通过控制速度和钻头的压力来避免损伤脑组织。

-用细钳将头皮撕开，暴露出脑膜。

3.制作脑缺血-用生理盐水或PBS洗涤脑膜，以确保大脑的清洁。

-用弹簧夹仔细阻断大脑的供血。

通常选择大脑的前动脉（MCA）或双侧MCA，使大脑区域发生缺血。

-检查大鼠是否出现神经功能缺陷，如软瘫、不对称性和意识丧失等。

-记录缺血时间，通常在20-30分钟之间。

-选择再灌注时间，通常是60分钟。

4.再灌注-在再灌注前，用生理盐水或PBS冲洗大脑。

通过防止缺血时间和再灌注时间的太长，以减少实验操作引起的伤害。

-用血管夹将阻断的血管解除，实现再灌注。

-观察大鼠是否恢复神经功能，例如排尿、动作和体位等。

-保持大鼠体温适宜，定期监测大鼠身体参数。

5.实验后处理-在实验结束后，用生理盐水或PBS冲洗伤口。

-给大鼠提供足够的水和食物，让其恢复。

大鼠肝脏缺血再灌注损伤模型缺血再灌注损伤，即缺血器官、组织重新获得血液供应，不仅不能使组织、器官功能恢复，反而加重了功能代谢障碍及结构破坏。

对麻醉动物的肝中叶和肝左叶的门静脉和肝动脉进行阻断和再通，由于肝脏中叶和左叶血流的阻断和再通，引起肝脏中叶和左叶明显的再灌注损伤。

肝脏缺血过程中由于肝细胞内ATP迅速耗尽，导致乳酸酮体等的堆积，及线粒体氧化磷酸化功能低下，引发代谢性酸中毒，缺血过程中细胞缺氧使ATP含量下降，导致肝细胞内外Ca2 +重新分布，即Ca2 +内流，引起线粒体的损伤。

再灌注过程中由于氧自由基的爆发性增多，中性粒细胞的聚集，kupffer细胞的激活，细胞凋亡及其他多种细胞因子的作用，使得肝细胞膜损伤，内皮细胞损伤及肝脏微循环障碍等导致肝脏功能代谢障碍及结构破坏。

1.实验动物SPF级Wistar大鼠，健康，雄性，体重为250g-300g。

2.实验分组实验分六组：正常对照组、模型组、阳性药组、受试药组三个剂量组，每组15只动物。

3.实验周期0h、3h、6h、12h、24h、72h4.建模方法1.选取体重250g-300g大鼠，行术前12 h禁食，自由饮水。

2. 15%水合氯醛350mg/kg腹腔注射麻醉，麻醉成功后将大鼠平躺在手术台上胶带固定四肢，将大鼠腹部至剑突术区剃毛，用10％碘酒和75％乙醇术区消毒。

3.取腹正中切口1cm，打开腹腔，小心分离出肝脏左、中叶之肝蒂（左、中叶肝脏供血的门静脉和肝动脉）。

4. 用无创血管夹夹闭中叶和左叶的门静脉和肝动脉,使约70%的肝脏缺血,以防止发生严重肠系膜静脉淤血。

0.5min后,与非阻断的右叶相比，肉眼可见阻断叶明显变白，说明阻断成功，用止血钳夹闭皮肤切口临时关闭腹腔，同时将大鼠放在37℃恒温加热垫上保温。

5. 完成持续缺血60min后，重新打开腹腔，迅速取出血管夹，恢复缺血肝血流，0.5min左右可见缺血区肝脏由白色逐渐恢复为鲜红色表明再灌注成功，逐层缝合腹腔肌肉和皮肤关闭腹腔，完成手术。

冠脉结扎法制作大鼠心肌缺血模型1.1实验材料1.1.1实验动物清洁级Wistar近交系大鼠100只(购自中国科学院上海实验动物中心)，均为雄性，体重245～320g(平均278.2±22.2g)，饲养环境为清洁级。

1.1.2试剂3%戊巴比妥钠，1%肝素钠，Evans蓝和N-BT磷酸缓冲液(Sigma公司)。

1.1.3实验仪器心电图机，动物呼吸机(浙江医科大学医疗仪器设备厂，DH150型动物呼吸机)，Buxco系统(Buxco公司)。

1.2模型制作1.2.1动物分组根据研究目的，实验动物共分六组；其中五个组需手术制作模型，合称手术组，另一个组为假手术组。

为满足每组12只的要求，先后有100只动物随机进入手术组(85只)与假手术组(15只)。

1.2.2制作方法1.2.2.1手术组用3%戊巴比妥钠(30mg/kg)行腹腔注射麻醉，麻醉满意后置于手术台，四肢及头部仰卧固定于手术台上，四肢皮下连接心电图电极，记录标准Ⅱ导联心电图，颈部皮肤备皮消毒，胸骨上窝上正中切开皮肤0.5cm，向上钝性分离推开下颌下腺，剪除气管前肌肉，使气管在没有任何拉钩牵引的情况下能充分显露，彻底止血后于第2～3气管环间行气管横行切开，注意不要切断气管软骨环，切口长度不超过气管周径的1/3，擦干其内分泌物后插入气管插管(用小儿吸痰管自制)，深度为0.5～1cm。

连接空气呼吸机进行人工控制呼吸，呼吸频率90次/分，潮气量10～12ml，吸呼比设为1﹕1。

左前胸去毛，消毒铺巾，顺肋间隙方向于胸骨左旁第3～4肋间切开皮肤，长约1cm，逐层分离皮下组织、肌肉，于2～3肋骨间撑开进胸，向右上方推开胸腺，可暴露心脏及大血管根部，切开心包，轻挤大鼠胸廓，将心脏挤出，有部分动物在左心耳下缘与肺动脉圆锥间可以看见左冠脉前降支起始部，用6-0Prolene线缝针，进针深度控制在0.1cm，宽度为0.1～0.2cm(图1)；回纳心脏入胸廓，待动物的数十次心动周期后，收线打结；观察数分钟后，彻底止血后逐层关胸。

大鼠脑缺血模型大脑中动脉阻塞 (middle cerebral artery occlusion，MCAO) 是目前最常用的局灶性脑缺血模型,MCAO 模型先阻断颈外动脉（ECA）及其分支，且阻断翼腭动脉（PPA），以切断颅外来源的侧副循环血流。

从ECA插入尼龙线，经颈内动脉（ICA）到大脑前动脉（ACA），机械性阻断大脑中动脉（MCA）发出处的血供来建立大脑中动脉缺血模型。

此模型可在无麻醉状态下拔出尼龙线，恢复血流，实现再灌注。

线栓法具有不开颅、效果肯定、可准确控制缺血及再灌注时间的优点，用于研究神经元对缺血的敏感性、耐受性，药物疗效观察以及再灌注损害和治疗时间窗较为理想，同时也具有对全身影响小、动物存活时间长的特点，适于慢性脑损伤的研究。

控制好易变因素，可避免实验结果的不稳定性。

1.实验动物SPF级Wistar大鼠，健康，雄性，体重为250g-300g。

2.实验分组实验分六组：正常对照组、模型组、阳性药组、受试药组三个剂量组，每组15只动物。

3.主要试剂2，3，5-Triphenyltetrazolium chloride（sigma）4.建模方法1.15%水合氯醛麻醉大鼠，颈部备皮，消毒，插入肛温探头，保持体温在37±0.5℃。

2.颈部正中切口，暴露右侧颈总动脉，颈内动脉和颈外动脉。

使用6-0丝线在距离颈总动脉分叉4mm 处结扎颈外动脉远心端，在颈外动脉穿入另一根6-0丝线，在靠近颈总动脉分叉处打一个活结。

3.使用动脉夹夹闭颈总动脉。

在距离颈总动脉分叉处3mm处的颈外动脉上剪一个小口，将一根头端处理过的0.33mm直径的尼龙线从小口中插入，进入颈内动脉，并向内插入大脑中动脉，尼龙线的插入深度距离颈总动脉分叉处约16±1mm。

4.缺血后90min拔掉线栓，用6-0丝线结扎外动脉近心端，用3-0丝线缝合颈部伤口，活力碘消毒伤口，将大鼠放在加热垫上，待清醒后放入恒温抚养箱饲养。

线栓法大鼠脑缺血再灌注模型制备方法Pipilulu目录：第一部分线栓模型制备理论及经验1插线法局灶性脑缺血模型简介2大鼠颈部及颅内动脉解剖及常用插线位置3大鼠大脑中动脉阻断实验的总结和心得（zhuqing0506战友）4 也谈大鼠MCAO模型的实验体会（bladeflyer战友）5 我的做MCAO模型的一些体会（intelligentwang战友）6 线栓法大鼠脑缺血再灌注模型（MCAO）制备技巧（ysf2k战友）第二部分线拴模型制作过程（雨后天晴战友）第三部分灌注取脑（pipilulu战友）第四部分 TTC染色（pipilulu战友）前 言相信不少神经内科的研究生都作过或将要作大鼠线栓模型，都有一个从查文献了解方法到跟师兄、师姐学习再到自己体会摸索直至熟练的过程，在模型制作的过程中可能的经历了从模型不成功的郁闷到熟练后成功的喜悦（我们是有这样的感觉）。

为了缩短各位将要作或刚开始作MCAO 模型的战友的摸索过程，提高模型制作的成功率，我们愿意将自己的经验与大家分享，相信各位战友看过后将对制作大鼠线栓模型有更深的认识，并以其为乐趣，同时欢迎各位熟练的战友与我们交流经验。

第一部分线栓模型制备理论及经验⒈插线法局灶性脑缺血模型简介八十年代Koizumi和Longa创用了不开颅的大鼠MCA可逆性脑梗塞模型，此后，应用插线法制备大鼠局灶性脑缺血再灌注模型的方法不断改进和完善，已渐趋成熟，目前该法已逐渐取代开颅法而成为最流行的方法。

该模型先阻断颈外动脉（ECA）及其分支，且阻断翼腭动脉（PPA），以切断颅外来源的侧副循环血流。

从ECA插入尼龙线，经颈内动脉（ICA）到大脑前动脉（ACA），机械性阻断大脑中动脉（MCA）发出处的血供来建立大脑中动脉缺血模型。

此模型可在无麻醉状态下拔出尼龙线，恢复血流，实现再灌注。

1994年Huang等[55]首次将线栓技术应用于小鼠局部永久性脑缺血模型。

1997年Hara 等[56]将线栓技术改进后应用于小鼠局部暂时性脑缺血模型。

大鼠脑缺血动物模型，死亡原因主要有以下几个方面：
1）动物体重的选择：预实验发现，体重越小，死亡率越高，动物体重<250g，由于血管长度和粗细程度的限制，线栓不易进入大脑中动脉；动物体重＞320g，血管变粗，线栓不能完全阻断大脑中动脉，模型复制成功率不是太高；大鼠体重在280～310g时，发现模型成功率上升，模型复制效果理想。

2）线栓质量：线栓头部的光滑程度决定了线栓能否保护血管的完整性，头部越光滑，越不易刺破血管，造成颅内出血。

我们将2.0号鱼线头部轻轻沾上玻璃胶，使头部大小均匀，既不刺破血管又可减小变异度。

3）手术方法的选择：我们选择阻断大鼠左侧脑血管的方法复制模型。

以此分离颈外动脉，经总动脉，颈内动脉，不分离翼腭动脉。

结扎颈外动脉，经总动脉，三血管分叉处剪2mm左右的小口，调整线栓进入方向，沿颈内动脉，避开翼腭动脉进入大脑中动脉。

4）术后围手术期间的护理：动物在术后48 h内的死亡率最高，如果能度过这段危险期则多能长期存活。

术后采取了以下护理措施：将动物安置在温暖的环境中（24℃左右），头部尽量保持平展，拔线后直至动物苏醒。

5）手术的熟练程度：动物长时间固定在手术台上，也会对成活率产生影响，提高手术的熟练程度，缩短手术时间，从而减少动物的损伤，手术时间一般保持在5min/只左右。

大鼠脑缺血再灌注模型的建立首席医学网2009年10月27日16:34:55 Tuesday医师杂志征稿急救医师学术年会冠心病诊疗研讨会网站运营核心论文年内发表泌尿外科主任研讨世界神经内镜大会内蒙中医药超值牙科管理课程世界糖尿病大会神经病学国际论坛心血管介入研讨会欧洲放射学年会美国骨科年会中医药学术大会作者：先雄斌杨朝鲜作者单位：(泸州医学院神经生物学研究室，四川泸州646000)【关键词】脑缺血/再灌注;模型脑血管病具有发病率高、致残率高、死亡率高、复发率高和并发症多的特点，是中、老年人致死和致残的主要疾病。

缺血性脑血管病约占全部脑血管病人的70%～80%。

因此建立稳定的、可重复、损伤小的大鼠脑缺血再灌注模型具有极其重要的价值。

以往模型的建立〔1，2〕均缺乏详细操作过程及各操作细节的注意要点，因而建模的重复性和成功率相对较低。

本文成功制备了大量SD大鼠局灶性脑缺血再灌注模型，现介绍如下。

1 对象与材料1.1 实验动物的选择由于SD大鼠具有成本低、种系纯合性好、抗感染能力较强，与人类的脑血管解剖相似,以及与Wistar大鼠比较,SD大鼠可见恒定的顶颞皮质梗死灶，梗死体积大于Wistar大鼠，变异较小，周边不完全坏死区(半暗带)所占体积明显小于Wistar大鼠等优点〔3〕,因此本文采用成年SD大鼠(第三军医大学实验动物中心),清洁级，体重250～320 g，雌雄不限。

1.2 器械和药品线剪1把、眼外科剪2把、弯镊4把、4#手术缝线、6×17三角形缝针、0.2 mm直径的尼龙线、游标卡尺1把、持针钳1把。

多聚 L 赖氨酸、戊巴比妥钠、速尿(20 mg/支)、硫酸庆大霉素(80 mg/支)等。

1.3 阻塞线的制备把0.2 mm直径的尼龙盘线剪成6 cm每段，一端靠近酒精灯火焰加热，并放于显微镜下观察，要求末端成光滑球面且直径不要大于0.30 mm。

过大者可能造成较难通过颈静脉孔，不光滑者可能刺破血管，导致蛛网膜下腔出血，且可引起血小板聚集和血栓形成，导致微血管循环的逐渐恶化。

局灶性脑缺血动物模型制作步骤及方法大脑中动脉(Middle cerebral artery, MCA)是人类脑卒中的多发部位，大脑中动脉闭塞(Middle cerebral artery occlusion, MCAO)模型被普遍认为是局灶性脑缺血的标准动物模型，主要方法有线栓法、电凝法、光化学法和血栓栓塞法。

1线栓法(thread occlusion of the middle cerebral artery)(1)复制方法雄性SD大鼠，体重为250～300g。

经腹腔注射水合氯醛(350～400mg/kg体重的剂量)或戊丨巴丨比丨妥丨钠(50～60mg/kg体重的剂量)麻醉，仰卧位固定，剃除颈部毛发，手术区域皮肤常规消毒。

切开右侧颈部皮肤，钝性分离胸锁乳突肌和胸骨舌骨肌，显露右侧OCA及迷走神经。

结扎CCA、颈外动脉(exterial cerebral artery, ECA)及其分支动脉。

分离右侧颈内动脉(interial cerebral artery, ICA)，至鼓泡处可见其颅外分支翼腭动脉，于根部结扎该分支。

在ICA 近端备线、远端放置动脉夹，在ECA结扎点(距颈内、颈外动脉分叉5mm处)剪一小口，将一直径为0.22～0.249mm(4-0号)的尼龙线经ECA上剪口插入。

插入前加热处理使插入端变钝(也可在尼龙线头端用L-多聚赖氨酸涂抹后置肝素中浸泡，使成功率增高，梗塞面积恒定)，并做好进入线长度标记。

扎紧备线，松开动脉夹，将尼龙线经ECA、ICA分叉处送入ICA，向前进入17～19mm时会有阻挡感，说明栓线已穿过MCA，到达大脑前动脉的起始部，堵塞MCA开口，造成脑组织局部缺血。

1～3h后可缓慢退出尼龙线实施再灌注。

(2)模型特点线栓法的优点为：无须开颅，动物损伤小，MCA闭塞效果较为理想，目前该模型被认为是惟一能观察到再灌流的局灶性脑缺血模型，近年来较为常用。

注意点：线选择极为重要，较细时不容易穿到MCA，且缺血不明显；较粗时缺血重，容易造成实验动物的死亡。

模型的背景，心肌缺血模型分全心缺血和左心室缺血两种，全心缺血主要靠注射药物（如异丙肾上腺素等），左心室缺血主要靠手术对动物的冠状动脉左降支进行紧扎实现。

由于左心室缺血对临床的意义更大，所以研究心肌缺血药物时这个模型是必须的。

（1）术前12小时给动物禁食（2）将动物注射10%水合氯醛（0.4mL/100g）麻醉后固定在手术台上（3）用笔型静脉置留针进行气管插管，插好后可用手术刀柄靠近气管，如果见气雾，就证明成功，连接动物呼吸机，参数为：呼吸频率85；呼吸比1：1；潮气量为18ml（4）胸部被毛、酒精棉消毒，在胸部左侧3~4肋间剪开皮肤，如图1（5）分离肌肉露出肋骨，切口位置有两块肌肉，胸浅肌和胸深肌，注意按照肌肉的纹路分离可以避免将肌肉扯烂，如图2（6）在第三根肋骨下用止血钳将肌肉分离开，然后左手用止血钳挑住肋骨，右手持剪刀剪开第三根肋骨，如图3（7）用止血钳将剪断的肋骨夹住掰开，放入开睑器，用止血钳剥离心包膜，如图4（8）用止血钳将胸腺（心脏上面白的像脂肪一样的东西）夹住拉出，如图5（9）在左心耳与肺动脉圆锥间穿6~0号线，拉紧丝线，形成心肌缺血，观察线扎紧的部位上下大约2mm范围的心肌是发白色的，如图6（10）闭合胸腔，注意将胸腔内的空气挤出（这点非常关键，这个模型最容易失败导致大鼠死亡的就是这个地方），对肌肉和皮进行缝合，挤空气的手法如图7（11）结扎术后6小时可进行TTC染色：将大鼠脱颈处死，打开胸腔，将心脏剪下，用生理盐水将心脏清洗干净并排出心脏内的淤血，沿冠状沟将心房切除留下心室，用刀片将心脏切成1mm厚的切片，放入0.1%的TTC磷酸盐缓冲液（pH 7.4）37℃水浴7~10分钟，取出切片用生理盐水冲洗数次，观察结果。

非梗死区因脱氢酶还原TTC而呈红色，梗死区因脱氢酶流失而呈白色，将梗死区和非梗死区分离并分别称重，梗死范围以梗死心肌占缺血心肌重量的百分比表示。

下图是染色的结果，图8结扎位置，梗死的地方其实肉眼大致能看出，和其他地方相比发白，图9：下面再发正常大鼠和梗死大鼠的心电图区别，是用的PowerLab做的，正常的如下22小时后的心电。