转基因动物方法简介
动物转基因办法简介
转基因动物就是基因组中含有外源基因的动物。它是根据预先的设计，通过细胞融合、细胞重组、遗传物质转移、染色体工程和基因工程技术将外源基因导入精子、卵细胞或受精卵，再以生殖工程技术，有可能育成转基因动物。
原核显微注射法（原核期细胞：受精卵的两个核未融合时期的细胞）目前最常用的转基因动物生产办法，又称DNA显微注射法，即通过显微操作仪将外源基因直接用注射器注入受精卵，利用外源基因整合到DNA中，发育成转基因动物。其创始人是Jaenisch和Mintz 等。Gordon等和Palmiter等先后通过此办法获得转基因动物。此办法目前应用较普遍，现在的转基因动物讨论大都是在Palmiter等办法的基础上有所改进而举行的。王敏华(1996)报道用显微注射法转移抗瘟病毒核酸酶基因，获得了转基因兔。KrimPenfort运用体外培养胚胎再施用显微注射法获得了转基因牛
这种办法的特点是外源基因的导入整合效率较高，不需要载体，直接转移目的基因。它可以直接获得纯系（应当也不一定，如上述鱼的状况），所以试验周期短。但需要贵重精密仪器，技术操作较难，并且外源基因的整合位点和整合的拷贝数都无法控制，易造成宿主动物基因组的插入突变，引起相应的性状转变，重则致死
外源基因整合到受体基因组的时机，将打算转基因动物是否发育成嵌合体，如整合发生在第一次卵裂前，即发生在DNA合成的S期，外源基因将随染色体的分别匀称的分布到每一个细胞，得到的转基因动物是纯合体，反之，得到的将是嵌合体。显微注射转基因的实践证实，受精卵DNA合成的S期是显微注射的相宜时机。但因为整合需要一段时光，等目的基因整合至染色体后，受精卵早已分裂多次，故很难得到纯合体。如鱼类在原肠胚早期才开头整合，而此时细胞已多值几千，此时转植基因在每个细胞内的整合状况不行能全都，所以第
一代转基因鱼总是嵌合体。哺乳动物受精卵的单细胞期阶段较长，还有可能得到纯合体的转基因动物。
也可在囊胚期举行，得到的是嵌合体转基因动物
胚胎干细胞（Embryonic Stem Cell，简称ES细胞）介导法
是将基因导入胚胎干细胞；然后将转基因的胚胎干细胞注射于动物囊胚后可参加宿主的胚胎构成，形成嵌合体，直至达到种系嵌合。因此，可以将其作为一种载体，导入外源基因，获得转基因动物。即从早期胚胎的内细胞团经过体外培养建立起来的多潜能细胞系
其优点是：在将胚胎干细胞植入胚胎前，可以在体外挑选一个特别的基因型：用外源DNA转染以后，胚胎干细胞可以被克隆，继而可以筛选含有整合外源DNA的细胞用于细胞融合，由此可以得到无数遗传上相同的转基因动物。缺点就是许多嵌合体转基因动物生殖细胞内不含有转基因;
目前，胚胎于细胞介导法在小鼠上应用比较成熟，在大动物上应用较晚。Evans等（1981）用不同培养系统从小鼠囊胚的内细胞团分别并建立了多潜能干细胞克隆系；Stice和
Strelchenko等（1996）获得了牛的胚胎干细胞。
注重：DNA显微注射和胚胎显微注射的区分
1 胚胎显微注射得到嵌合体小鼠。
DNA显微注射得到转基因小鼠。
2 胚胎显微注射是把是把转化/转导了目的基因的胚胎干注射到囊胚
DNA显微注射是把DNA注射到原核期细胞
逆转录病毒载体法
将目的基因重组到逆转录病毒载体上，制成高浓度的病毒颗粒，人为感染着床前或着床后的胚胎，也可以直接将胚胎与能释放逆转录病毒的单层培养细胞共孵育以达到感染的目的，通过病毒将外源目的基因插入整合到宿主基因组DNA 中去。通过此办法，Slater等得到
了转基因鸡，Haskell得到了转基因牛。
这种逆转录病毒被用重组DNA技术修饰后作为基因载体在应用中优于微注射法之处为：无需要重排，可在整合点整合转移基因的单个拷贝；将胚胎置于高浓度病毒容器中，或者与被感染的细胞体外共同培养，或微注射鸡胚盘里，整合有逆转录病毒的DNA的胚胎率高。缺点是：需要生产带有转基因的逆转录病毒；插入逆转录病毒的基因有一定的大小限度；所得转基因家畜的嵌合性很高，而需要广泛的杂交，以建立转基因系；转基因的表达问题尚未解决。
精子介导的基因转移
精子介导的基因转移是把精子作适当处理后，使其具有携带外源基因的能力。然后，用携带有外源基因的精子给发情母畜授精。在母畜所生的后代中，就有一定比例的动物是整合外源基因的转基因动物。同显微注射办法相比，精子介导的基因转移有两个优点：首先是它的成本很低，惟独显微注射法成本的1/10。第二，因为它不涉及对动物举行处理，因此，可以用生产牛群或羊群举行试验，以保证每次试验都能够获得胜利。
核移植转基因法
体细胞核移植是近年来新浮现的一种转基因技术。该办法是先把外源基因与供体细胞在培养基中培养，使外源基因整合到供体细胞上，然后将供体细胞细胞核移植到受体细胞——去核卵母细胞，构成重建胚，再把其移植到假孕母体，待其妊娠、分娩，便可得到转基因的克隆动物
体细胞核移植法
先在体外培养的体细胞中举行基因导入，筛选获得带转基因的细胞。然后，将带转基因体细胞核移植到去掉细胞核的卵细胞中，生产重构胚胎。重构胚胎经移植到母体中，产生的仔畜百分之百是转基因动物。
线粒体介导法
因为转基因动物受遗传镶嵌性和杂合性的影响，其有性生殖后代变异较大，
难以形成稳定遗传的转基因品系。因而，尝试从受体动物细胞中分别出线粒体，以外源基因对其举行离体转化，再将转基因线粒体导入受精卵，所发育成的转基因动物雌性个体外培养的卵细胞与任一雄性个体交配或体外人工授精，因为线粒体的细胞质遗传，其有性后代可能一致是转基因个体。
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转基因动物方法简介 动物转基因办法简介 转基因动物就是基因组中含有外源基因的动物。它是根据预先的设计，通过细胞融合、细胞重组、遗传物质转移、染色体工程和基因工程技术将外源基因导入精子、卵细胞或受精卵，再以生殖工程技术，有可能育成转基因动物。 原核显微注射法（原核期细胞：受精卵的两个核未融合时期的细胞）目前最常用的转基因动物生产办法，又称DNA显微注射法，即通过显微操作仪将外源基因直接用注射器注入受精卵，利用外源基因整合到DNA中，发育成转基因动物。其创始人是Jaenisch和Mintz 等。Gordon等和Palmiter等先后通过此办法获得转基因动物。此办法目前应用较普遍，现在的转基因动物讨论大都是在Palmiter等办法的基础上有所改进而举行的。王敏华(1996)报道用显微注射法转移抗瘟病毒核酸酶基因，获得了转基因兔。KrimPenfort运用体外培养胚胎再施用显微注射法获得了转基因牛 这种办法的特点是外源基因的导入整合效率较高，不需要载体，直接转移目的基因。它可以直接获得纯系（应当也不一定，如上述鱼的状况），所以试验周期短。但需要贵重精密仪器，技术操作较难，并且外源基因的整合位点和整合的拷贝数都无法控制，易造成宿主动物基因组的插入突变，引起相应的性状转变，重则致死 外源基因整合到受体基因组的时机，将打算转基因动物是否发育成嵌合体，如整合发生在第一次卵裂前，即发生在DNA合成的S期，外源基因将随染色体的分别匀称的分布到每一个细胞，得到的转基因动物是纯合体，反之，得到的将是嵌合体。显微注射转基因的实践证实，受精卵DNA合成的S期是显微注射的相宜时机。但因为整合需要一段时光，等目的基因整合至染色体后，受精卵早已分裂多次，故很难得到纯合体。如鱼类在原肠胚早期才开头整合，而此时细胞已多值几千，此时转植基因在每个细胞内的整合状况不行能全都，所以第
转基因小鼠的应用及其制 备法 学院：动物科技学院 专业班级： 学生姓名： 学号： 指导老师： 时间：2015年12月17日
老师，这篇文章是在图书馆《分子生物技术——重组DNA的原理与应用》书上整理下来的，没有参考文献，但是，这一万多字都是自己亲手打下来的，图也是自己用软件画的，其中的原理也都 弄懂，愿老师见谅。 转基因小鼠的应用及其制备法
（西北农林科技大学动物科技学院，凌712100） 摘要随着后基因组时代的到来，转基因动物已成为新兴的最有效的实验模型。从上世纪80年代以来，上百个不同的基因已经转入各种品系的小鼠中。这有助于理解基因调控，肿瘤发展，免疫特异性，发育分子遗传学以及人们感兴趣的其他生物学过程。转基因小鼠也已在探索利用家畜进行人类治疗药物工业化生产的可能性，以及建立各种人类遗传病的转基因生物医学模型中起到重要作用。现就制备转基因小鼠的实验法及应用前景作简单介绍。 关键词医学模型；试验法；应用前景 Methods and Applications of Transgenic Mice (Northwest A&F University,Colledge of Animal Science and Technoledge,Yangling, Shaanxi,712100,China ) Abstact:Following arrival of the post-genomics era,transgenic animals have become the most effective novel experimental model.Since the 1980’s.Hundreds of different genes have been transferred to the various strains of mice.This helps to understand the gene regulation,tumor development,immune specificity,developmental molecular genetics and other biological processes which people are interested in.Transgenic mice have also been exploring the possibility of using domestic animals for the industrial production of drugs for human treatment,and they also play an important role in establishment of a variety of genetically modified biomedical model of human genetic diseases. The article here is an overview of experimental methods and the application prospect of transgenic mice. Key words:biomedical model; experimental methods; application prospect 1990年人类基因组计划正式启动，经过13年的努力，人类基因组序列图绘制成功及人类基因组计划的所有目标全部实现。人们迎来一个崭新的时代——后基因组时代，即在基因组静态的碱基序列逐步清楚之后而最基因组进行动态的生物学功能研究。转基因动物在后基因组时代已成为生命科学研究中新 作者简介：本科，动物科学专业。Email:lw5166@126.；Tel： *通讯作者：E-mail：mailto:zhangjianqin1356@126.
动物转基因方法简介 转基因动物就是基因组中含有外源基因的动物。它是按照预先的设计，通过细胞融合、细胞重组、遗传物质转移、染色体工程和基因工程技术将外源基因导入精子、卵细胞或受精卵，再以生殖工程技术，有可能育成转基因动物。 原核显微注射法（原核期细胞：受精卵的两个核未融合时期的细胞）目前最常用的转基因动物生产方法，又称DNA显微注射法，即通过显微操作仪将外源基因直接用注射器注入受精卵，利用外源基因整合到DNA中，发育成转基因动物。其创始人是Jaenisch和Mintz等。Gordon等和Palmiter等先后通过此方法获得转基因动物。此方法目前应用较普遍，现在的转基因动物研究大都是在Palmiter等方法的基础上有所改进而进行的。王敏华(1996)报道用显微注射法转移抗瘟病毒核酸酶基因，获得了转基因兔。KrimPenfort运用体外培养胚胎再施用显微注射法获得了转基因牛 这种方法的特点是外源基因的导入整合效率较高，不需要载体，直接转移目的基因。它可以直接获得纯系（应该也不一定，如上述鱼的情况），所以实验周期短。但需要贵重精密仪器，技术操作较难，并且外源基因的整合位点和整合的拷贝数都无法控制，易造成宿主动物基因组的插入突变，引起相应的性状改变，重则致死 外源基因整合到受体基因组的时机，将决定转基因动物是否发育成嵌合体，如整合发生在第一次卵裂前，即发生在DNA合成的S期，外源基因将随染色体的分离均匀的分布到每一个细胞，得到的转基因动物是纯合体，反之，得到的将是嵌合体。显微注射转基因的实践证明，受精卵DNA合成的S期是显微注射的适宜时机。但由于整合需要一段时间，等目的基因整合至染色体后，受精卵早已分裂多次，故很难得到纯合体。如鱼类在原肠胚早期才开始整合，而此时细胞已多值几千，此时转植基因在每个细胞内的整合情况不可能一致，所以第一代转基因鱼总是嵌合体。哺乳动物受精卵的单细胞期阶段较长，还有可能得到纯合体的转基因动物。
转基因动物的检测方法 转基因技术是新兴的生物技术,具有广阔的应用前景,目前利用转基因技术获得的主要是粮食作物,其中转基因植物及产品已进入商品化生产阶段,转基因动物的研究尚处于实验室研究阶段,获得转基因动物技术难度较大,即使外源基因转进动物体内,检测也比较困难。这是由于如果整合拷贝数低,那么它的检测难度比单拷贝基因还大不表达,肯定也会增加检测难度,此外,当外源基因与内源性基因同源性很高时,检测也比较困难,因而选择适当的检测方法,避免造成疏漏及人力、;如果基因表达效率低甚至物力、财力的浪费是至关重要的。目前已有许多实验室结合分子生物学方法,探索出一些检测方法,下面从各不同检测水平来看转基因动物的检测方法。 1 染色体和基因水平 1.1 DNA 斑点杂交(DNA blot hybridization) 通过直接将变性的待测DNA 样品点在尼龙膜(或硝酸纤维素膜) 等固体支持物上,然后和探针杂交,从而检测样品中是否存在目的DNA 序列。根据点样方式—和样品点的形状不同可分为斑点杂交、狭缝杂交( slot blot hybridization) 、打点杂交(spot blot hybridization) 。当目的基因与内源基因组DNA 无同源性时可用它,为避免假阴性,可同时用质粒DNA (1～l0pg) 作阳性对照。该方法在分析基因组DNA 时,对样品纯度要求低、快速、简便、经济、灵敏度高(能从2μg～5μg 的基因组DNA 中检出单拷贝基因),尤其对大批子代动物的粗筛颇具优越性,应作为首选方法。但该方法易出现假阳性。 1.2 PCR(Polymerase chain reaction) PCR 技术是DNA 体外扩增技术,基本原理同体内DNA 的复制一样,均需经过DNA 模板解链、引物、结合及模板指导下的链延伸三个过程,在PCR 反应中是靠温度的调整和聚合酶的共同作用完成的。若PCR 体系中有一对方向相对的引物,通过反复重复变性、复性、延伸过程,则在短时内可将两引物间模板扩增至百万倍。由于PCR 所需样品少,灵敏度高而且操作简便因而逐渐用于转基因动物外源基因整合、表达的检测。可极大提高转基因效率,减少人力物力的浪费。但该尤其在大型转基因动物研究中,用PCR 先对着床前的胚胎筛选,再将已证实携带外源基因的胚胎植入母体, 方法要求待分析的基因组DNA 样品应尽可能纯化,否则会干扰本反应,降低检测的灵敏度和重复性;此外用于大批量检测时,费用较昂贵。 1.3 Southern 印迹法(Southern blot hybridization) Southern 印迹杂交技术是通过探针和已结合于硝酸纤维素膜(或尼龙膜) 上的经酶切、电泳分离的变性DNA 链杂交,检测样品中是否存在目的DNA 序列的方法。该法不仅灵敏而且准确,因而广泛用于转基因阳性鼠的筛选和鉴定。当转入基因与内源基因组DNA有较高同源性时,仍可用此法。,此法对样品的质量和纯度要求较高,操作烦琐,费用也较高。 1.4 整合位点的检测—染色体原位杂交(in situ hybridization) 染色体原位杂交是确定转基因在染色体上确切位置的重要手段,其原理是利用碱基互补的原则,以放射性同位素或非放射性同位素标记的DNA 片段作探针, 与染色体标本上的基因组DNA 在“原位”进行杂交,经放射自显影或非放射性检测体系在显微镜下直接观察出目的DNA 片段在染色体上的位置。最早同位素标记多采用放射性较低的3H 、35S 、及125I ,它们具有定位精确的优点,但放射自显影时间长而且操作较麻烦,随着荧光显微镜技术的发展,尤其是计算机图像处理系统的应用,增强了对荧光信号的分辨率,促进了非同位素在染色体原位杂交中的应用。 1.5 整合拷贝数的检测 外源基因的拷贝数通常以每个单倍体细胞中整合外源基因的分子数计算。测定拷贝数的方法有斑点杂交技术和Southern 印迹杂交等。其基本原理是在杂交实验中设置一系列阳性标准
转基因小鼠的应用及其制 备方法 学院：动物科技学院 专业班级： 学生姓名： 学号： 指导老师： 时间：2015年12月17日
老师，这篇文章是在图书馆《分子生物技术——重组DNA的原理与应用》书上整理下来的，没有参考文献，但是，这一万多字都是自己亲手打下来的，图也是自己用软件画的，其中的原理也都 弄懂，愿老师见谅。 转基因小鼠的应用及其制备方法 （西北农林科技大学动物科技学院，陕西杨凌 712100）
摘要随着后基因组时代的到来，转基因动物已成为新兴的最有效的实验模型。从上世纪80年代以来，上百个不同的基因已经转入各种品系的小鼠中。这有助于理解基因调控，肿瘤发展，免疫特异性，发育分子遗传学以及人们感兴趣的其他生物学过程。转基因小鼠也已在探索利用家畜进行人类治疗药物工业化生产的可能性，以及建立各种人类遗传病的转基因生物医学模型中起到重要作用。现就制备转基因小鼠的实验方法及应用前景作简单介绍。 关键词医学模型；试验方法；应用前景 Methods and Applications of Transgenic Mice (Northwest A&F University,Colledge of Animal Science and Technoledge,Yangling, Shaanxi,712100,China ) Abstact:Following arrival of the post-genomics era,transgenic animals have become the most effective novel experimental the 1980’ of di fferent genes have been transferred to the various strains of helps to understand the gene regulation,tumor development,immune specificity,developmental molecular genetics and other biological processes which people are interested mice have also been exploring the possibility of using domestic animals for the industrial production of drugs for human treatment,and they also play an important role in establishment of a variety of genetically modified biomedical model of human genetic diseases. The article here is an overview of experimental methods and the application prospect of transgenic mice. Key words:biomedical model; experimental methods; application prospect 1990年人类基因组计划正式启动，经过13年的努力，人类基因组序列图绘制成功及人类基因组计划的所有目标全部实现。人们迎来一个崭新的时代——后基因组时代，即在基因组静态的碱基序列逐步清楚之后而最基因组进行动态的生物学功能研究。转基因动物在后基因组时代已成为生命科学研究中新 作者简介：本科，动物科学专业。；Tel： *通讯作者： E-mail： 兴的最有效的动物实验模型。小鼠是最早建立的转基因动物模型，利用转基因小鼠进行生物学或生物医学研究是当前生命科学发展的主要内容之一。转基因小鼠是一个思维体系，所研究的问题都是在活体中进行的，类似于人体内的各种背景因素仍然存在，通过这套体系所得出的研究结论具有很高的真实性。因此，其成为生命科学领域中的研究利器。
转基因小鼠制备方法 一、引言 转基因小鼠是指通过基因工程技术将外源基因导入小鼠基因组中，使其表达或缺乏特定基因，从而研究基因功能、疾病模型等方面的动物模型。转基因小鼠制备方法是实现转基因小鼠研究的重要步骤之一，本文将详细介绍转基因小鼠制备的一般步骤和常用技术。 二、转基因小鼠制备的一般步骤 1. 选择目标基因和载体 转基因小鼠制备的第一步是选择目标基因和适当的载体。目标基因可以是外源基因、特定基因的突变体或基因敲除。载体通常是带有选择标记（如抗生素抗性基因）和目标基因的质粒。 2. DNA构建 在DNA构建过程中，首先需要将目标基因和选择标记基因插入到载体的适当位点上。这可以通过限制性内切酶切割和连接、PCR扩增等方法实现。构建完成后，需要进行酶切鉴定和测序确认。 3. 体外培养胚胎干细胞（ES细胞） 转基因小鼠制备中常用的方法是利用ES细胞技术。首先，从小鼠胚胎中获得内源性干细胞（ES细胞），并进行体外培养。然后，将构建好的转基因载体导入ES细胞中，通过抗生素筛选获得带有目标基因的转基因ES细胞克隆。
4. 转基因小鼠制备 转基因ES细胞的制备完成后，可以进行转基因小鼠的制备。这一步骤通常有两种方法：内源性重组和外源性重组。内源性重组是将转基因ES细胞注射到小鼠早期胚胎中，使其整合到小鼠的生殖细胞中，从而获得转基因小鼠。外源性重组是将转基因ES细胞直接注射到小鼠的细胞团中，形成转基因胚胎，再将转基因胚胎移植到雌性小鼠子宫中，使其发育成为转基因小鼠。 5. 转基因小鼠鉴定 转基因小鼠制备完成后，需要对其进行鉴定。通常采用PCR、Southern blotting、Western blotting等分子生物学方法，检测转基因小鼠是否成功表达目标基因。 三、常用技术 1. CRISPR/Cas9技术 CRISPR/Cas9是一种新兴的基因编辑技术，可以实现高效、精确地对基因组进行编辑。通过CRISPR/Cas9技术，可以直接在小鼠胚胎中进行基因编辑，从而制备转基因小鼠。 2. 皮质醇诱导干细胞（iPS细胞）技术 iPS细胞技术是通过转染一组特定的转录因子，将普通体细胞重新编程成类似胚胎干细胞的多能干细胞。通过将iPS细胞导入到小鼠胚胎中，可以制备转基因小鼠。
动物转基因技术的应用与发展动物转基因技术是一种使用基因重组技术来改变动物遗传特征的方法。它已经被广泛应用于农业、医学和科学研究领域。本文将介绍动物转基因技术的应用以及其在发展过程中面临的挑战。 一、农业应用 1.提高农产品质量 动物转基因技术被运用于改良农产品，使其具有更好的质量和耐抗性。例如，将鱼类的抗冷基因导入猪的基因组，可以使猪具备更好的抗寒能力，提高猪肉的质量。 2.增加产量 通过转基因技术，科学家可以改变动物的生长速度和体重增加率，进而提高农业产量。例如，转基因鸡可以在相同时间内生长更快，产量更高的肉。 二、医学应用 1.药物研发 动物转基因技术在药物研发过程中扮演着重要角色。研究人员可以将人类的疾病基因导入到转基因动物体内，模拟人类疾病的发生和发展过程，用于药物的研发和测试。这种技术有助于提高新药的研发效率和准确性。 2.疾病治疗
动物转基因技术还可以用于治疗某些疾病。例如，通过将人类抗血 友病基因导入到小鼠体内，可使小鼠具备抗血友病的能力。这种转基 因动物可以为人类血友病的治疗提供新的思路和方法。 三、科学研究应用 1.基因功能研究 通过转基因技术，科学家可以在动物中插入特定的基因，以研究其 功能和作用机制。这些研究有助于人们更好地理解基因对生物体发育、生长和生命活动的影响，为遗传学和生物学领域的学术研究提供了有 力的工具。 2.进化研究 动物转基因技术也可以用于研究物种的进化历程和遗传变异。通过 改变动物的基因组，科学家可以重建已灭绝物种的基因组，有助于揭 示物种起源和演化的秘密。 动物转基因技术的发展遇到的挑战： 1.伦理问题 动物转基因技术的应用涉及到伦理道德问题，例如人类的基因是否 可以导入到动物体内等。这需要相关机构和研究人员严格遵守伦理准则，确保技术的合理和安全运用。 2.风险评估
转基因动物实验技术 1980年底Gordon等人首次将克隆的基因注入小鼠受精卵原核，然后移植于假孕的母鼠输卵管,培育出第1个转基因动物。这种将外源性基因用实验方法插入动物生殖细胞的基因组而获得具有插入基因特性，并能正常繁衍的动物称为转基因动物 ( transgenicanimals)。转基因技术是生物学领域最新重大进展之一，已能渗透到生物学、医学、畜牧学等学科的广泛领域。转基因动物已成为探讨基因调控机理、致癌基因作用和免疫系统反应的有力工具。同时人类遗传病的转基因动物模型的建立，为遗传病的基因治疗打下坚实的理论和实验基础。 转基因技术涉及外源基因的组建、载体、受体、基因导入技术、供转基因胚胎发育的体外培养系统和宿主动物等方面的内容。 一、转移基因 (一)转移基因的原理:转基因技术的理论基础在于各种生物的遗传密码都是统一的。都是以3个碱基决定一个氨基酸这样的密码形式贮存在DNA链上，各物种间形状的不同仅仅是由于DNA上的四种核苷酸排列次序的不同，同时各种生物从DNA 到蛋白质合成都服从“中心法则”,当一个物种的细胞内加入另一物种或人工合成的DNA(即基因)后就可能产生新的性状。 (二)基因的获得:取自现有的生物体如病毒、细菌、体细胞或肿瘤细胞的DNA,用限制内切酶或外切酶把DNA切割成若干小段,然后再把这些小段利用连接酶分别放入载体中,并建成载体克隆。载体通常是一种独立的，能自我复制的遗传物质，如质粒、某些噬菌体和病毒均可作为载体。基因的片断可随载体复制，有时亦可表达，用DNA 或抗体探针做分子杂交试验或ELISA试验筛选出带有理想基因的克隆,再把理想基因载体放入大肠杆菌等宿主细胞中扩大、增殖,或采用PCR的方法扩增。再对扩增的DNA片断进行适当修饰,例如将一个单一的基因与经选择的启动子
转基因动物流程 转基因动物是通过基因工程技术对动物基因进行修改和调整，以达到特定目的的一种操作。转基因动物流程可以分为以下几个步骤：1. 设定目标：在转基因动物的研究中，首先需要确定目标，即希望通过基因工程技术实现什么样的改变。这可以是增加动物的抗病能力、提高农作物的产量或改善动物的生长性能等。 2. 基因选择：根据设定的目标，研究人员需要选择合适的基因。这些基因可以来自于同一物种的其他个体，也可以来自于不同物种。选择基因时需要考虑基因的功能和效果，以及与转基因动物所需的特性是否相符。 3. 基因克隆：在确定了目标基因后，研究人员需要进行基因的克隆。这一步骤涉及到将目标基因从提供者中提取出来，并进行扩增和纯化，以获得足够的基因材料。 4. 转基因技术：转基因技术是将目标基因导入动物体内的关键步骤。常用的转基因技术包括基因枪法、细胞核移植和胚胎干细胞技术等。通过这些技术，研究人员可以将克隆好的基因导入到动物的基因组中，并使其在动物体内表达。 5. 繁殖和筛选：经过转基因技术处理的动物需要进行繁殖和筛选，以获得所需的转基因个体。这一步骤通常需要通过交配或体外受精等方式，将转基因个体繁殖出来。同时，研究人员还需要通过PCR、
Southern blot等技术对转基因个体进行筛选和鉴定。 6. 分析和评估：完成转基因动物繁殖后，研究人员需要对其进行分析和评估。这包括对转基因动物的基因表达水平、生理特性和遗传稳定性等进行评估，以确保转基因动物达到预期目标。 7. 应用和研究：转基因动物的应用和研究十分广泛。它们可以用于药物研发、疾病模型的建立、农作物改良等领域。通过对转基因动物的研究和应用，我们可以更好地理解基因的功能和调控机制，为人类的生活和健康提供更多的可能性。 转基因动物的制备流程可以概括为设定目标、基因选择、基因克隆、转基因技术、繁殖和筛选、分析和评估以及应用和研究等步骤。通过这些步骤，研究人员可以通过基因工程技术对动物基因进行修改和调整，为人类社会的发展和进步提供有力支持。
转基因小鼠的方法概述
转基因小鼠的应用及其制 备方法
学院：动物科技学院 专业班级： 学生姓名： 学号： 指导老师： 时间：2015年12月17日 老师，这篇文章是在图书馆《分子生物技术——重组DNA的原理与应用》书上整理下来的，没有参考文献，但是，这一万多字都是自己亲手打下来的，图也是自己用软件画的，其中的原理也都 弄懂，愿老师见谅。
学研究是当前生命科学发展的主要内容之一。转基因小鼠是一个思维体系，所研究的问题都是在活体中进行的，类似于人体内的各种背景因素仍然存在，通过这套体系所得出的研究结论具有很高的真实性。因此，其成为生命科学领域中的研究利器。 一、方法学 1.逆转录病毒转染法 1974年，Jaenisch等试图用病毒感染早期胚胎的方式将SV40 DNA肿瘤病毒基因导入小鼠体内，但是这样的基因并没有参与整个发育过程，传代的机会也很小。1976年，Jaenisch又通过反转录病毒感染小鼠的胚胎。 在各种基因转移法中，利用逆转录病毒转染法（图1-1）能够有效地将基因整合在受体细胞基因组上。但缺点是只能导入小片段基因（8kb左右）。由于受到大小的限制，转移的基因可能缺少表达调控序列。 这话总方法还有一个缺陷，虽然这些载体设计为复制缺陷型，但由于产生大量载体DNA所必须的逆转录病毒品系（辅助病毒，helper virus）的基因组，可能和转移的而基因一起整合到同一个细胞核上。尽管有特殊的预防措施，转基因生物仍有可能产生辅助病毒。但是，在应用转基因生物合成商业产品或直接作为食品过程中，必须绝对保证没有逆转录病毒的污染。转基因已有其他可行的方法，因此很少用逆转录病毒转染法来产生具有商业用途的转基因动物。
制备转基因动物的方法 制备转基因动物的方法有很多，以下是一些常见的方法： 1. 显微注射法：这是最早的动物转基因技术，通过显微镜将目的基因注射到受精卵细胞的原核内，使目的基因与胚胎基因组融合。该方法的优点是可靠性高、重复性好、整合效率高，导入基因片段的大小和类型不受限制，转基因可以稳定遗传。但缺点是导入基因整合的随机性和不可见性可能导致基因表达不稳定和插入突变。成功应用该方法的例子包括美国科学家Hammer 等在1985年获得的转基因兔、绵羊和猪，以及我国朱作言院士等在1985 年成功获得的世界上首例转基因鱼。 2. 精子载体法：将精子与目的DNA进行预培养，使精子具有携带目的基因进入卵子的能力，再让精子与卵子结合，该基因被整合到受精卵的DNA中。该方法的优点是不需要显微注射操作，不会对胚胎造成损伤，整合率高，成本低，不需要对动物进行胚胎移植手术处理等。但成功率不高、效果不稳定，有待科研人员进一步探索和改进。成功应用该方法的例子包括1989年意大利Lavitrano等首次报道利用精子载体法获得转基因鼠，以及1996年意大利Sperandio科研小组报道的采用该方法生产转基因牛和猪。 3. 逆转录病毒感染法：利用逆转录病毒作为载体，将目的基因整合到受体细胞的DNA中。该方法的优点是效率高、操作简单、成本低，在转基因动物生产中应用广泛。但缺点是插入突变的可能性大、外源基因表达量不稳定。
4. 胚胎干细胞介导法：将目的基因导入胚胎干细胞，通过将胚胎干细胞注入受体胚胎以生产转基因动物。该方法的优点是整合效率高、可遗传给后代、可进行种间转基因操作等。但缺点是技术难度高、操作复杂、胚胎干细胞建系不易等。 5. 细胞核移植法：通过将已转染的外源基因的体细胞核移植到受体细胞的卵母细胞中，以生产转基因动物。该方法的优点是可获得转基因动物的高纯合子、可进行种间转基因操作等。但缺点是技术难度高、操作复杂、成功率低等。 这些方法各有其优缺点，在转基因动物生产中有着不同程度的应用。在实际操作中，可以根据需要选择合适的方法来制备转基因动物。
微生物转基因方法 微生物转基因是研究遗传和分子生物学中一种常用的新技术，也称为“转化”。通过这种技术，可以将某些基因植入到微生物体内，从而获得指定基因组成的新型微生物，完成一项重大的基因功能研究。其原理和过程集中论述如下： 一、基因的提取 首先，需要提取要转化的基因片段，即将要植入到微生物体内的基因。 基因提取的常用方法有基因拷贝、PCR（聚合酶链式反应）、测序分析和克隆等。 二、基因的载体 其次，将提取的基因片段放入一种特殊的分子载体中，以便将基因片段植入到微生物中。 载体可以采用质粒、单链DNA、慢病毒等多种，可根据需要进行选择。 三、转基因 将载体质粒加入到微生物体中用于转基因，即将质粒中的基因片段植入到微生物中。 该技术最常见的方法是外源性核酸注射，即采用细管将质粒直接注入到微生物 细胞中，从而将质粒中的基因植入到微生物体中。另外还可以使用发生转化、拷贝结合酶切除和过渡态等多种方法来完成转基因，从而获得指定基因组成的新型微生物。 四、基因筛选 转基因后，需要进行基因筛选，以便确定转入到微生物体内的基因是否被正确表达，能否完成指定的基因功能。 基因筛选的方法有建立表达系统（荧光报告基因）、克隆技术、PCR技术、荧 光原位杂交技术等。 五、基因功能验证 最后，需要进行基因功能的验证，即确定转入的基因是否能实现其预期的功能，包括重组蛋白的分子结构等。 常用的基因功能验证方法有定量RT-PCR法、Western Blot法等，可以用于研 究转基因后微生物体的变化情况。
总之，微生物转基因技术是研究生物基因过程中广泛使用的新技术，可以用来转移和表达指定基因，为生物基因研究提供重要的研究内容，成为现代生物科学研究的重要手段。
转基因动物的概念、原理及应用 引言 转基因动物技术是一种将外源基因植入到一个物种基因组中的 技术，使得其宿主物种具有外来基因中的特性，这些特性可能是有利的、有害的或不变的。转基因动物在过去几十年得到了广泛的应用，它在各个领域，如医学、物理、化学、生物等发挥了重要作用。本文将详细阐述转基因动物的概念、原理及应用。 概念 转基因动物也被称为转基因实验动物，是指通过基因工程技术，将一种特定的外源基因植入到动物本身基因组中的一种特殊的动物。转基因实验动物里散发出的基因表达形式或者特性可以延长它们的 寿命，或者对它们的生理功能有所改变。转基因动物可以研究到一些没有被发现的关于物种的特性，还可以用来研究人体某些疾病的发生机制。 原理 转基因动物的基本原理是利用基因工程技术将外源基因植入到 动物基因组中，使得动物具有外源基因中的特性，以达到我们想要的目的。首先，转基因动物的研究者需要先从某种物种中取出我们所需要的基因，然后把它们植入到动物本身的基因组中，最后生成一只新的转基因动物。一般来说，转基因动物会将基因植入到它们的胚胎细胞中或者胚胎内，通过易位器和基因载体等手段使得其他基因能够被引入。
应用 转基因动物在医学上有着重要的应用。例如，经过转基因的小鼠，可以用于研究癌症，心脏病，糖尿病等疾病的形成机制和治疗方法。除此之外，转基因动物在药物研究方面也有着重要的作用。它可以用来测试药物的毒性，实验在药物发现和开发过程中发挥着至关重要的作用。此外，转基因动物还可以用来研究人类疾病的致病机制。 结论 转基因动物是一种新兴的技术，它可以用来解决许多医学上的疑难问题，在药物研究方面也发挥着重要的作用。它不仅可以提高动物的发育能力，而且可以改变动物本身的一些特性，为科学家们的研究提供了丰富的资源，为人类的健康作出了重要的贡献。
转基因小鼠制备实验方法 1、选取7~8周龄雌性小鼠，阴道口封闭，作为供体，下午3:00左右，每只小鼠腹腔注射PMSG(10 IU)。 2、 47~48小时后，每只小鼠腹腔注射HCG(0.8 IU)，并与正常公鼠合笼；另取数只适龄母鼠(2月龄以上)作为受体，阴道口潮红，与结扎公鼠合笼。 3、第二天上午9:00前观察供体、受体，有精栓者拿出备用。受体笼拿出作好隔离措施。 4、10:30左右，断颈处死供体，手术取出整个输卵管，放入透明质酸酶~0.3mg/M2液中。显微镜下，用镊子撕开输卵管壶腹部，受精卵随同颗粒细胞即一同流出。 5、仔细观察放在透明质酸酶M2液中的受精卵，当受精卵周围的颗粒细胞脱离时，将受精卵吸出，放入M2液中洗涤，最后放在M16液中放入5% CO2，37C0培养箱培养。 6、在显微镜下观察，挑选细胞饱满，透明带清晰，雄原核清晰可见的受精卵待用。 7、安装持卵针和注射针，使其末端平行于载物台，在凹玻片的中央滴入一滴M2液，覆盖石蜡油，移入待注射的受精卵。DNA在注射针中的气泡应在先前全部弹走。 8、在高倍镜下，将注射针轻触持卵管，使DNA缓慢流出并控制其流量；反复吹吸受精卵，使其处于最佳位置，将注射针刺入受精卵的雄原核，直至看到原核膨大即退出。将注射过的和未注射过的受精卵上下分开放置，不致于混搅，注射完毕后，放入5% CO2，37C0培养箱培养。 9、将受体麻醉，注射计量为1%戊巴比妥钠0.01ml/g，腹腔注射。手术取出卵巢连接输卵管，用脂肪镊固定，在显微镜下找到输卵管开口。吸取注射后经培养成活的受精卵，吸取方法是先吸一段较长的M2，吸一个气泡，然后吸取受精卵，尽量紧密排列，再吸一段液体，吸一个气泡，再吸一段液体，共四段液体三个气泡。除较长的那段液体，其余的液体大致1cm 左右，气泡0.2cm左右。将移植管口插入输卵管口，轻轻将移植管内的液体吹入，看到输卵管壶腹部膨大并清晰地看到三个气泡，即移植成功。将卵巢连同输卵管放回腹腔，缝合肌肉和皮肤。 10、受体每隔一个星期称体重一次，当第二次比第一次称重增加时，即可初步判断怀孕。手术后19~21天仔鼠分娩，待仔鼠3周后，剪耳、编号，剪尾，交分子组检测。 (一般选取4-5周龄的雌鼠作为供体，此时的小鼠卵数较多，状态较好。用pms诱导卵细胞成熟，用hcg超排。)