5-3 慢性毒性作用及其试验方法

兽药慢性毒性和致癌试验指导原则一、概述（一）定义与目的慢性毒性和致癌试验是预测药物在临床应用中诱发癌症危险性的评价方法。

在动物的大部分生命期间，经过反复给予受试药物后观察其呈现的慢性毒性作用及其剂量－反应关系，尤其是进行性和不可逆毒性作用及肿瘤疾患。

确定受试药物的无作用剂量(NOEL)，作为最终评定受试药物能否应用于动物尤其是食品动物的依据。

为了确保慢性毒性和致癌试验结果的真实性、可靠性和可追溯性，根据新兽药研究的规律，结合国内兽药毒理学评价的实际情况制定了本指导原则。

（二）适用范围本指导原则适用于评价兽用化学药品、中兽药、消毒剂及饲料药物添加剂对动物的慢性毒性和/或致癌性的测定。

长期毒性试验发现有可疑肿瘤发生，某些器官组织细胞异常、药物结果与已知致癌物有关或代谢物与已知致癌物有关、作用机制为细胞毒类等情况下，要求进行致癌试验。

二、试验设计（一）材料与方法1.实验动物（1）实验动物种类选择一般要求选用两个种属的实验动物，即啮齿类和非啮齿类，目前已掌握大白鼠和小白鼠各品系的特点及诱发肿瘤的敏感性，故可优先将其用于慢性毒性和致癌试验。

对活性不明的受试药物，则应选用两种性别的啮齿类和非啮齿类动物。

（2）动物的起始周龄和体重慢性毒性试验期长，故一般用刚断乳的大鼠或小鼠。

大鼠50～70g（出生3～4周），小鼠10～15g（出生3周）。

动物个体体重的变动范围不超出各性别平均体重的20%。

（3）动物的性别和数量每个剂量组的动物数应满足试验结束时进行统计学处理的要求，如大鼠40～60只（小鼠数应据此适当增加），一般雌雄各半，雌鼠应为非经产鼠、非孕鼠。

如果将慢性毒性试验与致癌试验结合进行，每组雌雄动物数均应在50只以上。

如计划在试验过程中定期剖杀动物，则动物数应相应增加。

（4）肿瘤自发率实验动物的自然肿瘤发生率原则是控制到越低越好，但试验结果评价时主要是以在相同条件下观察对照组与各剂量组的肿瘤发生率及其剂量-反应关系作为判定依据。

2-1_毒物毒性和毒作用1.某先天缺乏NADH-高铁血红蛋白还原酶的患者，当一次接触大量苯胺后发生高铁血红蛋白血症，这种毒性作用应为：A、速发作用B、局部作用C、过敏性反应D、高敏感性E、特异体质反应2.机体接触有机磷农药后，血液中胆碱酯酶活性降低，致使神经递质乙酰胆碱不能及时水解，引起瞳孔缩小、肌肉颤动、大汗、肺水肿、肢体麻痹等中毒表现。

这种毒性作用属于：A. 速发作用B. 局部作用C. 全身作用D. 高敏感性E. 过敏性反应3.以三邻甲苯磷酸酯TOCP为代表的某些有机磷农药在急性中毒恢复后8-14 d又出现肢体麻痹、共济失调等临床表现相当严重的中毒性神经病，以下哪种概括更为合适：A、局部作用B、不可逆作用C、过敏性反应D、迟发作用E、特异体质反应4.以下哪一种不是化学毒物出现选择毒性的原因：A.物种和细胞学差异B.不同生物或组织器官对化学毒物生物转化过程的差异C.生物所接触的毒物剂量的差异D.不同组织器官对化学毒物亲和力的差异E.不同组织器官对化学毒物所致损害的修复能力的差异5.如检测人体的某些生物材料如血液、尿液、头发中的铅、汞、镉等重金属含量可以准确判断其机体暴露水平，这些生物学标志称为A 、接触性生物学标志物B、效应性生物学标志物C、易感性生物学标志物D、一般性生物学标志物E、特殊性生物学标志物2-3_安全限值MRL为：B安全范围为：FADI为：A暴露范围为：E参考剂量为：D实际安全剂量为：CA、人类每日摄入某物质至终生，而不产生可检测到对健康产生危害的量。

B、允许在食物表面或内部残留药物或化学物质的最高含量或浓度。

C、食品中化学物质的日平均接触量的估计值。

D、用于（非？）致癌物质危险度评价的指标。

E、衡量人群“暴露量”估计值与动物实验中获得的NOAEL差异大小的指标。

F、是人群“暴露量”估计值与安全限值差异大小的指标。

下列哪一项效应属于量效应：AA.尿中δ-ALA的含量B. 中度铅中毒C. 动物死亡D. 持续性肌肉松弛E. 正常细胞发生恶变随着科学技术手段的更新，下列表示毒性的指标也会更新，除（D ）外。

食品毒理学评价与食品安全性马立田胡军刘宏霞北京中大华远认证中心100833摘要:本文从食品毒理学的角度对食品安全性进行了论述,探讨了食品安全性评价与ADI、LD50等指标之间的关系，为正确认识和使用食品添加剂及新资源食品的开发提供了理论基础。

关键词：食品毒理学、ADI、LD50、最大使用量前言应用食品毒理学的方法对食品进行安全性评价, 为我们正确认识和安全使用食品添加剂(包括营养强化剂)、开发食品新资源和新资源食品及保健食品的开发提供了可靠的技术保证，为我们正确评价和控制食品容器和包装材料、辐照食品、食品及食品工具与设备用洗涤消毒剂、农药残留及兽药残留的安全性提供了可靠的操作方法。

一．食品毒理学基本概念1.食品毒理学（food toxicology）：应用毒理学方法研究食品中外源化学物的性质，来源与形成，它们的不良作用与可能的有益作用及其机制，并确定这些物质的安全限量和评定食品的安全性的科学。

食品毒理学的作用就是从毒理学的角度，研究食品中可能含有的外源化学物质对食用者的毒作用机理，检验和评价食品（包括食品添加剂）的安全性或安全范围，从而达到确保人类的健康目的。

2.毒物：在一定条件下，较小剂量就能够对生物体产生损害作用或使生物体出现异常反应的外源化学物称为毒物。

食物中的毒物来源有：天然的或食品变质后产生的毒素等、环境污染物、农兽药残留、生物毒素、以及食品接触所造成的污染。

3.外源化学物（xenobiotics）：是存在于外界环境中，而能被机体接触并进入体内的化学物；它不是人体的组成成分，也不是人体所需的营养物质。

近来，确切的概念应称为“外来生物活性物质”。

4. 毒性：是指外源化学物与机体接触或进入体内的易感部位后，能引起损害作用的相对能力，或简称为损伤生物体的能力。

也可简述为外源化学物在一定条件下损伤生物体的能力。

食品中的外源化学物也可能在一定条件下呈有益作用或不良作用。

毒理学的一个基本原则和首要目的就是要对毒性进行定量。

食品毒理学作业题第七章特殊毒性作用及其试验与评价方法1、急性毒性实验的概念和目的2、Ames 实验的原理3、改良Karber法的要求4、蓄积性毒性试验的概念及目的5、亚慢性毒性试验的概念和目的6、生殖毒性和发育毒性的概念，评价的试验方法、指标答：①生殖毒性的概念：外来化合物对生殖过程的损害作用，主要包括对生殖细胞的发生、卵细胞受精、胚胎形成、妊娠、分娩和哺乳作用的损害作用。

发育毒性的概念：外来化合物对发育过程中的损害作用，主要包括对胚胎的发育、胎仔发育及出生幼仔发育的损害作用。

②生殖毒性作用的评定主要通过生殖毒性试验进行，也称繁殖试验，主要有三代两窝试验法、两代一窝、一代一窝生殖试验法。

可观察的指标有受孕率、正常分娩率、幼仔出生存活率、幼仔哺乳存活率。

③发育毒性的评定主要是评价受试物的致畸作用，对胎鼠进行体表检查、内脏检查、骨骼检查、生理功能异常的观察。

可观察的指标有活产幼仔平均畸形出现数、畸胎出现率、母体畸胎出现率。

7、微核是什么？其来源于何？细胞质中发现微核说明了什么？答：微核在细胞的有丝分裂后期染色体有规律的进入子细胞形成细胞核时，仍然留在细胞质中的染色单体或染色体无着丝片断或环。

它在末期之后，单独形成一个或几个规则的次核，被包含在子细胞的细胞质中形成，由于比核小得多故称微核。

微核来源于染色体，在细胞质中发现微核说明染色体发生了变化，发生断裂，受试物对染色体产生了损伤。

第十章食品中有毒有害物质限量标准的制定及风险评估与管理1、安全限量标准制定的意义答：保证食品的食用安全性；国家食品安全质量监督管理的依据；食品安全生产的基础；食品贸易的基本条件。

2、限量标准制定中应综合考虑的因素有哪些？答：在制定限定标准时，应综合考虑各种化学物的来源，毒性大小、毒性特点、实际摄入情况以及社会经济发展情况，权衡该物质可能对人体造成的危害以及可能产生的有益作用，将标准从严制定或者放宽。

考虑因素如下：（一）在体内有蓄积性，不宜排泄或解毒者从严（二）可能产生三致作用的从严（三）接触频度高，长期大量食用者从严（四）供应幼儿、病人食用者从严（五）化学性质稳定，在加工或者烹调过程中不宜破坏者从严（六）与其他化学成分产生协同毒性作用者从严总之，制定的限量标准带有一定的相对性，随着科技进步和社会的发展，限量标准应该适时修订。

第7章⼀般毒性作⽤及其实验与评鉴⽅法第六章⼀般毒性作⽤及其试验与评价⽅法⼀般毒性作⽤：是指毒物对动物机体产⽣的综合毒性效应，也称基本毒性作⽤根据接触毒物的时间长短可将产⽣的毒性作⽤分为急性毒性、亚慢性毒性和慢性毒性。

第⼀节急性毒性作⽤及其试验与评价⽅法⼀、急性毒性试验的概念急性毒性试验是指动物机体⼀次或24h内多次接触受试物后在短期内所产⽜的毒性效应及反应。

观察内容⼀般包括⾏为变化、外观改变以及致死效应。

观察时间⼀般为7d，观察范围可为7～28d（迟发毒性效应）。

凡经⼝或经注射给毒，“⼀次”的含义是指瞬间将受试物输⼊试验动物体内；若经呼吸或⽪肤给毒，“⼀次”则指在⼀个特定的时间内，使试验动物持续接受受试物的过程。

“24h内多次接触受试物”的概念是指当受试物毒性很低，⼀次接触还不能达到充分了解该受试物的毒性作⽤，或⼀次不能导⼊设计剂量的受试物时，需在24h内分次染毒。

⼆、急性毒性试验的⽬的（1）测定和计算出受试物的致死量及其他急性毒试参数，主要获得受试物对某种实验动物以某种接触途径的LD50值；(2)了解受试物对动物机体的急性毒性特征，靶器官和剂量⼀反应关系；(3)研究受试物在动物体内的动⼒学变化规律；(4)为下⼀步的亚慢性、慢性毒性试验及其他毒理学试验的剂量设计和观察指标选择提供依据。

三、急性毒性试验⽅法1．实验动物的选择和要求(1)品种、品系的选择实验动物选择的原则是以哺乳动物为主，选择两种或两种以上的动物，包括啮齿类(rodentspecies)和⾮啮齿类(nonrodenl species)，其中⾄少有⼀种⾮啮齿类动物。

啮齿类多选⽤⼩⿏和⼤⿏，⾮啮齿类常选⽤⽝或猴。

(2)性别和年龄或体重的要求对于实验动物的性别⼀般要求雌雄(早6)各半。

如果试验仅为某些特殊试验研究⽬标，也可选⽤单⼀性别。

如致畸试验可仅选雌性动物，对精⼦毒性试验可仅选雄性动物。

急性毒性试验通常要求刚成年的动物。

⼀般按体重选购，通常要求⼩⿏18～25g、⼤⿏180～240g、豚⿏．200～250g、家兔2～2．5kg、猫1．5～2kg、⽝4～6kg(⽝⼀般为1岁左右)。

第三节慢性毒性作用及其试验方法一、概念和试验目的(一) 慢性毒性概念慢性毒性是指以低剂量外来化合物长期给予实验动物接触，观察其对实验动物所产生的毒性效应。

(二) 试验目的慢性毒性试验是确定外来化合物的毒性下限，即长期接触该化合物可以引起机体危害的阈剂量和无作用剂量。

为进行该化合物的危险性评价与制定人接触该化合物的安全限量标准提供毒理学依据，如最高容许浓度和每日容许摄入量等。

二、慢性毒性试验设计（一）慢性毒性试验期限一般认为工业毒理学慢性试验动物染毒6个月或更长时间；而环境毒理学与食品毒理学则要求实验动物染毒1年以上或2年。

也有学者主张动物终生接触外来化合物才能全面反映外来化合物的慢性毒性效应，以及求出阈剂量或无作用剂量。

但是，也有学者认为大鼠为进行慢性毒性试验动物，接触受试化合物1年以上不一定必要。

多次经验证明延长接触1年以上，大鼠也不再出现新的毒性效应(致癌试验除外)。

例如有报道在122种化合物中，大鼠连续接触3个月之后才出现毒性效应的只有3种(占2.46%)，其它化合物均在3个月内已出现毒性效应。

因此认为以大鼠为试验对象时连续接触外来化合物90天，即可确定受试化合物的长期无作用水平。

但是，这种观点还存有争论。

因此在食品及环境毒理学中进行慢性毒性试验，接触外来化合物的时间仍以2年为好。

（二）实验动物与饲养环境1、实验动物慢性毒性试验选择实验动物的条件与亚慢性毒性试验相同。

但实验动物最好为纯系甚至同窝动物均匀分布于各剂量组。

实验动物年龄应较小，大鼠和小鼠应为初断奶者，即小鼠出生后3周，体重10~12g；大鼠出生后3~4周，体重50~70g。

性别要雌雄各半。

2、动物饲养环境慢性毒性试验实验动物的饲养条件和饲养环境与亚慢性毒性试验相同。

（三）接触途径慢性毒性试验多为经口与经呼吸道接触。

经呼吸道接触，每日接触时间，依试验要求而定。

工业毒物的试验通常每日吸入4～6小时。

环境污染物一般要求每日吸入8小时或更长。

慢性毒性试验测定1目的检测受试物长期染毒对实验动物所产生的毒性作用，确定其最小观察到有害作用剂量，最大未观察到有害作用剂量及毒性作用的靶器官。

2实验动物试验选用刚离乳的大鼠。

在试验结束时，每个剂量组每种性别的动物应不少于10只。

中间需活杀动物检查时，需相应增加实验动物数量。

3试验分组将实验动物随机分在3个剂量组和1个阴性对照组。

阴性对照组除不接触消毒剂外，其它与实验组相同，若在试验中对受试物使用溶剂或赋形剂时，阴性对照组应给予相应剂量的溶剂或赋形剂。

试验剂量根据亚慢性试验结果选择。

高剂量应引起明显的毒性效应甚至个别动物死亡，低剂量应不引起毒性效应。

4操作程序(1)用灌胃法或将受试物掺入饲料或饮水中喂饲。

掺入饲料的受试消毒剂的最高浓度一般不超过5%0饲料中受试消毒剂应定期监测，观察其均匀性和稳定性。

(2)灌胃法每天给药一次。

(3)前3个月每周称量体重，3个月后每月称1次体重，调整受试物灌胃量。

如受试物掺入饲料，应定期称饲料消耗量。

如受试物溶于饮水中喂饲，需记录动物的饮水量。

(4)试验期限为一般为6个月，必要时可延长至2年。

5观察指标指标与亚慢性毒性试验基本相同，也可根据受试物对实验动物的亚慢性毒性作用和靶器官，可适当增加或更换一些针对性更强更灵敏的观察指标。

(1)临床观察：观察中毒表现，体重前3个月每周1次，以后每月I次。

(2)血液学检查：于试验的第3个月、6个月及以后每半年进行1次血液学检查。

(3)血液生化检查：检查时间同血液学检查。

(4)病理学检查：系统解剖：所有实验动物包括试验过程中死亡的动物都应进行完整的系统解剖和详尽的肉眼观察。

肉眼可见的异常组织都应留样作进•步组织病理学检查。

脏器重量：称取脑、肝、肾、肾上腺和睾丸重量并计算脏器系数。

组织学检查：对照组、高剂量组动物及系统解剖发现异常的组织均需作详尽的组织学检查。

当高剂量组有异常发现时，其它剂量组才进行相应检查。

检查脏器一般包括脑、心、肺、肝、脾、肾、胃、肠、肾上腺、甲状腺、垂体、睾丸（卵巢）和子宫等。

慢性毒性试验1、材料与方法1.1 试剂1.1.1 MCLR样品实验所用MCLR由室内培养的铜绿微囊藻提取分离，通过HPLC纯化获得（HPLC检测纯度≥98%）.取一定量MCLR的甲醇溶液，减压浓缩蒸干，定容于蒸馏水中，配制成2.75μg/mL的MCLR水溶液。

1.1.2 鱼肉样品取市售新鲜鳙鱼（经HPLC法和ELISA法检测不含MCLR），参照文献[16]报道的方法制备鱼肉粉末:低温下取鱼肉，匀浆后冷冻干燥，然后研磨成粉，过30目筛，所得样品避光冷藏保存，以保持其活性.实验前，按照1:5（质量比）的比例向鱼肉粉末中加入制备好的MCLR水溶液，搅拌0.5h后，常温静置4h。

1.2 主要仪器Waters600Ｅ型高效液相色谱仪，配有2487双波长紫外可见检测器，分析柱Hypersilc18（5μm，4.6mm×250mm），Ｃ18半制备柱（10μm，19mm×300mm）;冷冻干燥机（ALPHA1.2LD）;生物显微镜（MoticB1）;全自动生化分析仪（UF2700）。

1.3 实验动物及染毒方式湖北省防疫站提供的SPF级雄性BalbC小鼠54只，体重（20±2）g，随机分成3组（2个处理组和1个对照组），每组18只.经口灌胃染毒，处理组按照68.75μg/kg（以单位体重计，下同）剂量，分别给予水溶态MCLR、鱼肉结合态MCLR，对照组给予等体积的蒸馏水。

1周内连续染毒5d，每天1次，染毒13周。

1.4 观察指标与方法1.4.1 一般中毒症状和体征染毒期间观察小鼠体重增长情况、饮食、活动状况及一般中毒表现。

1.4.2 脏器系数于实验第1、3、5、7、9、13周，每组随机取3只小鼠，空腹称体重，摘除眼球取全血，准确称量小鼠肝脏、肾脏的重量，按照脏器系数=脏器重（mg）体重（g）计算各脏器系数。

1.4.3 组织病理学观察取新鲜小鼠肝脏、肾脏组织，分别固定于10%福尔马林溶液中，24ｈ后石蜡包埋、切片、常规ＨＥ染色，在光镜下观察各组织结构变化.1.4.4 血清酶学指标的测定小鼠血液标本常温静置2h后，离心取上清液，用全自动生化分析仪进行检测.检测指标有:天冬氨酸氨基转氨酶（AST）、丙氨酸氨基转氨酶（ALT）、碱性磷酸酶（ALP）、肌酐（Cr）、尿素氮（BUN）。