基因工程动物细胞培养制药工艺(PPT 148页)

糖代谢特点：
动物细胞吸收葡萄糖后，进行糖酵解，大部分葡萄糖分 解为丙酮酸，进一步被还原为乳酸，乳酸分泌到胞外并 在培养液中积累。
丙酮酸还可转化为乙酰辅酶A，进入三羧酸循环，彻底 氧化产生CO2和水。小部分（4％～8％）葡萄糖进入戊 糖磷酸途径，把葡萄糖转化为4、5、7碳糖和还原力 NADPH，5碳糖用于核酸合成，其他中间产物进入脂肪 酸代谢、核酸代谢和氨基酸代谢。
SO4-
α2,
GalNAc
3
0
++
α2, 糖 基 等
分
6
化
GluNAc
0-
0
CHO
++
-
0
0
++ 0 +
0
鼠杂交瘤 ++
0
++
0
++ 0 +++ 0
C127
+++
0
人淋巴细胞 ++
0
++
++
++
-
0
0
++ + +++ 0
+ ++ + +++ 0
+
+ +0
++
人垂体
++
0
0
+++ + + 0
++
Namalwa ++
0
0
0
人鼠杂交瘤 ++
0
2. 动物细胞代谢
动物细胞的不同代谢途径及其相应的酶体系定位于特定 的亚细胞区域。通过胞内运输（囊泡包裹）实现区域之间 的物质、信息和能量流动，通过穿梭实现不同代谢途径之 间的交换。
在动物细胞培养中，葡萄糖和谷氨酰胺提供能量并作为合 成代谢的前体，因此动物细胞的培养具有一定的灵活性。
葡萄糖受限可增加谷氨酰胺的消耗得以补偿，反之亦然。 谷氨酰胺是动物细胞的氮源，谷氨酰胺受限时，可增加其 他氨基酸的消耗得以补偿。
干扰素、单克隆抗体、重组基因工程产品。
组织型血纤蛋白溶酶原激活剂、免疫珠蛋白G、M、尿激 酶、人生长因子等。
第一节 动物细胞制药的表达系统与特征
昆虫系统、哺乳动物细胞系统，最成功、重要表达活 性外源蛋白的有效系统，应用于药物蛋白质的表达。 一、哺乳动物细胞表达系统与特征 1. 动物细胞的特征 细胞膜、细胞质 和细胞核 没有细胞壁。 亚细胞器，功能独特。
3. 蛋白质糖基化
蛋白质合成是以mRNA为模板，在核糖体上完成。而蛋白 质的糖基化无需模板指导，因此糖蛋白的寡糖结构容易发 生变化。
糖蛋白的单糖单元:α-D-葡萄糖、α-D-半乳糖、α-D-甘露 糖、α-D-木糖、α-D-岩藻糖、N-乙酰-α-D-葡萄糖胺、N乙酰-α-D-半乳糖胺和α-N-乙酰神经氨酸（或唾液酸）。
杂合型至少含有一条复合糖链，另一个链含有甘露糖。
O-聚糖连接在Thr/Ser的羟基上，还没有发现保守序列。
O-聚糖有四种不同的核心结构，都含有N-乙酰半乳糖胺 基，糖基化会影响蛋白质的局部构象。
O-糖基化比较小，一般为1～6个寡聚糖，但比N-糖基化 变化更大。
O-糖基化只在高尔基体上进行，糖基单元有木糖、葡萄 糖。
鼠和猪细胞倾向于添加乙酰果糖而不是乙酰唾液酸，在鼠 杂交瘤或人鼠杂交瘤生产的抗体中，乙酰果糖占优势。
CHO细胞不能合成等分N-乙酰葡萄糖胺，而鼠细胞系却 能形成半乳糖末端，对人有免疫原性。
要根据糖基化的结构，选择适宜的细胞系。
细胞系
Fuc
Gal
唾液酸
BHK
α1,6 α1,3
Fuc
++
0
α1,3 Gal +
不同的培养条件，葡萄糖和谷氨酰胺代谢重叠于丙酮酸。 在正常细胞系中，丙酮酸羧化产生草酰乙酸，而草酰乙酸 来源于谷氨酰胺。
在连续细胞系中，没有这种流动。能量是以ATP和 NADPH的形式提供，来源于葡萄糖和谷氨酰氨，但二种 细胞系对各个代谢途径的贡献和所起的作用不同。
常流加葡萄糖或谷氨酰氨，控制整个代谢过程，避免有毒 废物积累。
基因工程动物细胞培养制药工艺
药用蛋白质的合成复杂，要有精确折叠的空间结构， 要有糖基化，才能使药物发挥真正的功能。细菌和酵母等 产品要么是包涵体，要么难以糖基化功能修饰。动物细胞 的培养技术来生产有功能的蛋白质，大规模动物细胞特别 是人源细胞的培养在药物生产中的位置会越来越重要。
人畜病毒疫苗:口蹄疫苗、狂犬病疫苗、牛白血病和脊髓 灰质炎、乙肝疫苗。
葡萄糖代谢旺盛，会产生大量的乳酸，对细胞产生毒性。
氨基酸代谢特点：
吸收谷氨酰胺后，进入氨基酸代谢途径，通过脱氨、转氨 等作用，合成其他必需和非必需氨基酸。
大多数谷氨酰胺在脱氨酶催化下，生成谷氨酸，并释放氨， 对细胞产生毒性。小部分谷氨酰胺通过转氨生成其他嘌呤、 嘧啶和氨基糖等合成代谢的前体。
谷氨酸还原酶把谷氨酸转化为中间产物α-酮戊二酸，进 入三羧酸循环，为细胞提供能量。所以谷氨酰胺在细胞能 量代谢中具有重要作用。谷氨酰胺与丙酮酸和草酰乙酸发 生转氨作用，生成丙氨酸和天门冬氨酸，丙氨酸可进入培 养液并积累。在快速生长的动物细胞培养体系，转氨作用 是主要的代谢途径。
N-糖基化分为高甘露糖型、复合型和杂合型三种类型，共 同 核 心 是 3 个 甘 露 糖 和 2 个 N- 乙 酰 葡 萄 糖 胺 组 成 的 5 糖 （Man3GluNAc2），其他糖形成支链。
高甘露糖型的支链为甘露聚糖（5～9聚体），无其他糖。
复合型含有2个以上支链，如乙酰半乳糖胺、果糖和唾液 酸等。
糖基化磷脂酰肌醇锚着点：它在膜与蛋白质之间形成稳定 的 相 互 作 用 ， 都 具 有 相 同 的 核 心 结 构 ： 胆 胺 -PO4-Man2GlcHN2-肌醇-PO4-脂。
胆胺形成膜内蛋白的桥，而肌醇在膜内。
在细胞培养生产重组蛋白时，磷脂酶C可切割此类蛋白， 有利于纯化。
细胞特异性糖基化途径——淋巴细胞中进行，它不依赖于 内质网和高尔基体。
糖基化类型：寡糖基以共价键与蛋白质的氮原子结合为N糖基化，或与氧原子结合为O-糖基化。这两种糖基化的 位点和数量及糖的种类都不同。
N-糖基化：聚糖部分连接在天门冬酰胺的氨基上，其模体 的保守序列为Asn-X-Thr/Ser (X为除脯氨酸以外的任意氨 基酸)。如果X为Trp、Asp、Glu和Leu，对糖基化有负影 响，而第三位Thr能增强糖基化。
IgG的糖基化，等分GlcNAc残基连接在核心甘露糖上，该 糖基化在抗体依赖性细胞介导的细胞毒性中起重要作用。
IgG蛋白的铰链区，富含Ser、Thr和Pro，5个Ser全部糖 基化。
促黄体激素、促甲状腺素等的硫酸化只能在垂体中发生。
尽管哺乳动物细胞具有细胞内的糖基化装置，但不同细胞 系，糖基化特征不同。