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第4章 动物细胞培养制药工艺

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《细胞工程》第4章动物细胞培养工程4

《细胞工程》第4章动物细胞培养工程4

美国，产业 化规模生产 蛋白质公司
中国 批式培养 （batch） 流加培养 （fed batch） 2-100L 中试规模 5-500L 中试规模 5-30L 中试规模
美国 产业化手段； 12000L工业反应器 产业化手段； 12000L工业反应器 产业化手段； 12000L工业反应器
灌注培养 （perfusion）
● 防止细胞机械破裂的培养液成分——
4．4 动物细胞培养工艺
●动物细胞培养工艺是指动物细胞表达生物技术产品的 生产工艺； ● 动物细胞表达产品的种类繁多，生物合成各具特点， 其培养工艺过程也不同； ●动物细胞培养工艺的设计要根据细胞本身的生长特点、 生长形式、目标产品的表达量、稳定性等进行综合考虑， 以选择相应的生物反应器系统，确定培养条件、培养环 境和各种参数控制指标等； 目前，成熟的蛋白治疗药物生产工艺有：流加培养工 艺、灌注培养工艺、批式培养工艺和反复批式培养工艺。
D、动物细胞培养工程技术是当今生物制药领域最重要 的关键技术之一；（10000L规模、g/L级）
E、大规模动物细胞培养生产中还存在问题需要解决： 去除培养环境中外源因子的污染 在线检测与工艺控制，如O2限定与溶解CO2尝试累 积的控制新细胞生物反应器系统的开发利用
4．2 生产用动物细胞系
4．2．1 生产用动物细胞发展： 生产用动物细胞——是指按生产条件 选择、驯化，适于大量培养，用于生产制备生 物制品的动物细胞。它经历了原代细胞、二倍 体细胞、连续细胞系、融合细胞和重组细胞的 历史演化。
4．3 培养液 与培养 环境
4． 3 ． 1 动物细胞 培养条件
4．3．2 动物细胞培养液和添加剂
4．3．3 无血清无蛋白培养
优点：化学组分明确，批次间重复性 好，易检测，适合特定过程； 缺点：比较贵，针对性强。

第四章 动物细胞制药

第四章 动物细胞制药

1、 贴壁培养 分散的贴壁依赖性细胞悬浮在培养瓶中很快(几十 分钟至几小时)就贴附在瓶壁上， 称为细胞贴壁， 贴壁后的细胞形态形成多态性， 呈单层生长， 所以此法又叫单层细胞培养。单层培养的细胞保 持接触抑制的特性。 优点：适用的细胞种类多；可采用灌流方式进行 高密度培养。 缺点：需较大面积和贴附材料；培养条件难以均 衡。传代培养时需用胰酶等将细胞从基质上消化 下来。
脂质体介导法：
DNA导入动物细胞的常用方法
融合法 细胞融合法 化 学 法 DNA—磷酸钙 沉淀法 脂质体介导法 DEAE—葡 聚糖法 原生质融合法 染色体介导法 微细胞介导法 鬼影红细胞介导法 物 理 法 电穿孔法 显微注射法 基因枪法 病 毒 法 重组逆转录病毒 介导法 重组DNA 病毒介导法 多瘤病毒样 颗粒介导法
2、二倍体细胞系：细胞群中染色体数 目与原供体二倍体细胞相同或基本相 同，可进行有限培养，具有贴壁依赖 性和接触抑制现象，无致瘤性。
３、转化细胞系：即无限细胞系 自发或诱导形成：正常细胞的培养传 代过程中发生染色体断裂或异倍化； 或人为地应用某些病毒和化学试剂诱 导获得。 由肿瘤细胞建立的细胞系全部为转化 细胞。 培养条件和要求简单，繁殖快，利于 大规模生产。
灭菌： 物理消毒：紫外线、干热、高压高温、过 滤等 化学消毒：消毒剂、抗菌素等 目的: 防止微生物污染。
2、水的处理： 方法：蒸馏、离子交换、电渗析、中空纤维过 滤等 目的：去除有毒元素、金属离子、微生物 3、pH的调整： 理想的pH应为7.2~7.4，整个培养过程不高于 7.6，低于6.8可限制细胞增殖。 控制pH的方法：使用pH电极； 使用各种缓冲 液系统。
1962年 动物细胞大规模培养技术起步 1975年 Sato无血清培养细胞获得成功 1975年 Kohler和Milstein成功构建了 杂交瘤细胞 1989年 Konstantinovti首次提出大规 模细胞培养过程中生理状态控制

第四章 细胞培养技术制药

第四章 细胞培养技术制药

1967年,Van Wezel以DEAE Sepadex A50 为载体 培养动物细胞获得成功 1975年,Sato等在培养基中用激素代替血清使垂体 细胞株GH3在无血清介质中生长获得成功 1975年,Kohler和Milstein成功地融合了小鼠B淋巴 细胞和骨髓瘤细胞而产生能分泌能分泌单克隆抗体 的杂交瘤技术 1986年,Demo Biotech公司首先用微囊化技术大 规模培养杂交瘤细胞生产单克隆抗体获得成功 1989年,Konstantinovti首次提出大规模培养过程 中生理状态控制,更新了细胞培养中优化控制的理 论
重组血友病VIIa因子,治疗A型和B型 血友病,BHK,1999年上市 IgG1和TNF受体融合,治疗风湿性关 节炎,CHO,1999年上市 重组血凝因子IX,控制B型血友病病人 的出血,CHO,1997年上市
第二节 转基因动物制药
一,产生重组蛋白的动物系统
血液 尿液 精液 蛋清 蚕茧 乳汁
二,转基因动物操作的原理和方法
1. 目的基因载体的构建
编码区 启动子 增强子 调控元件 筛选标记
2. 转基因技术
直接核DNA微注射 逆转录病毒载体感染胚胎 囊胚内注射遗传改变的胚胎干细胞 精子作为基因转移的载体
细胞核内微注射
供体动物的超排 卵的收集 DNA的显微注射 存活胚胎的转移 转基因的整合 转基因的表达
3. 胚胎分割和核移植技术
人们需要进一步研究和开发
动物细胞基因工程技术和杂交技术 新型细胞培养反应器 无血清,低蛋白和无蛋白培养基 新型为载体研制技术及微囊化技术 产物分离纯化技术
二,动物细胞制药的基本原理
动物细胞制药首先涉及到的就是细胞体外培养的 一些基本原理和基本操作,这些和普通的细胞体 外培养技术基本一致 表达过程中能以正确的方式进行折叠和修饰 大多数能以天然形式分泌到培养基中,从而确保 了生产的蛋白质具有天然产物抑制的活性,免疫 原性和体内寿命 一些人用和兽用的重要药物蛋白,尤其是相对较 大,复杂或糖基化的蛋白质来讲,动物细胞培养 制药是首选的生产方式,如病毒疫苗,干扰素等

动物细胞培养制药工艺

动物细胞培养制药工艺
概念：直接取自于动物组织提取液或体液作为培养基 种类：血浆凝块、血清、淋巴液、胚胎浸出液。 特点：营养价值高，成分复杂，不稳定，来源受到限 制，不宜大量生产使用。 应用：许多细胞系和原代及传代细胞培养。
动物细胞制药
培养基制备
2.合成培养基
概念：用化学成分明确的试剂配制的培养基。 组成：糖、氨基酸、无机盐、维生素及其他成分。 特点：组分稳定，容易配制。 缺点：不能直接使用；需要添加5％-20％血清，才 能培养。 已有几十种合成培养基，大部分已商品化。
动物细胞制药 3.生理盐水和平衡盐溶液
培养基制备
磷酸盐缓冲液 (Phosphate buffer solution,PBS)： KCl、KH2PO4、NaCl、Na2HPO4配制而成。 应用：培养物、器皿的洗涤液。 生理盐水和平衡盐溶液： 配制直接接触、长期培养的培养液。
动物细胞制药
培养基制备
4.氨基酸配制
培养基制备
Ⅰ类：无蛋白质成分，化学成分完全明确，只适用于 一些特定细胞系。 Ⅱ类：含有纯化蛋白和激素，应用广，二倍体，原代 及确立细胞系，相对比较昂贵。 Ⅲ类：非确定生物添加剂取代血清，化学成分不太明 确。可以灭菌，价格低廉。
动物细胞制药
培养基制备
4.3.3 培养基质量的控制
培养用水质 缓冲液 生理盐水和平衡盐溶液 其他成分配制
培养基制备
3、维生素
作用：一类微量的小分子有机生物活性物 既不是细胞的物质基础，也不是能量物质，对 代谢和生长起调节和控制作用。 水溶性维生素：B族维生素和维生素C 脂溶性维生素：维生素A、D、E、K四种。
动物细胞制药
培养基制备
4、无机盐类
作用：细胞代谢所需酶的辅基，调节酶活 性，细胞构成成分； 参与生理电活动； 维持水平衡、保持渗透压和酸碱平衡。 胞外无机盐对维持正常生长环境很重要。

项目四章动物细胞制药ppt演示课件

项目四章动物细胞制药ppt演示课件
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五、环境条件 1、无毒无菌 2、温度
温度除直接影响到细胞生长外，与培 养液的pH值也有关。如低温时可增加CO2 的溶解性而影响pH。最理想的做法是把配 有血清的培养液，置于36.5℃中。过夜，然 后再用于培养。
16
3、渗透压人类血浆的渗透压为770kPa，小 鼠类则为820 kPa。培养液的渗透压一般介 于(690～850)kPa之间，能为多数细胞所耐 受。
11
传代培养：将培养细胞从培养器中取出，把 一部分移至新的培养器中再进行培养。
原代培养形成的单层细胞汇合以后，需 要进行分离培养，否则细胞会因生成空间不 足或由于细胞密度过大引起营养枯竭，都将 影响细胞的生长 。 1、有限细胞系 2、连续细胞系
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四、动物细胞培养的营养条件 特点： 1、细胞生长缓慢，易受微生物污染，培养 时需要抗生素； 2、动物细胞较微生物大得多，无细胞壁， 机械强度低，适应环境能力差； 3、培养过程需氧量少，且不耐受强力通风 与搅拌；
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电融合法是80年代出现的细胞融合技术，在直流 电脉冲的诱导下，细胞膜表面的氧化还原电位发 生改变，使异种细胞粘合并发生质膜瞬间破裂， 进而质膜开始连接，直到闭和成完整的膜，形成 融合体。 电融合法的优点： 融合率高、重复性强、对细胞伤害小； 装置精巧、方法简单、可在显微镜下观察或录像 观察融合过程； 免去PEG诱导后洗涤过程、诱导过程可控性强。
3
第一节 细胞培养技术
细胞培养条件： 1、营养 2、生长环境
4
（一）动物细胞培养技术
5
Hale Waihona Puke 6动物细胞体外培养具有明显的表达产物 方面的优点，为传统的微生物发酵技术所 无法替代。其中以它们转录后修饰和产物 胞外分泌表达最为人们所感兴趣。

生物技术Biotechniques.pdf

生物技术Biotechniques.pdf
流加葡萄糖或谷氨酰氨，控制整个代谢过程，避免有 毒废物的积累。
细胞培养制药工艺
细胞系
3、蛋白质糖基化与分泌表达
蛋白质合成场所：粗糙内质网上的核糖体
糖基化场所：内质网合成各种糖类，粗糙内质 网腔内和高尔基体，加工修饰。
不同细胞系糖基化特征不同，选择适宜细胞 系。
对于分泌型蛋白，分泌泡与细胞膜融合，释放 到胞外，完成了蛋白质的分泌表达。
细胞培养制药工艺
细胞系
4.1.3 生产用细胞系
1. 人源细胞系
Namalwa：
类淋巴母细胞，非整体，悬浮生长。
英国Wellcome公司：Sendai病毒诱导，大规模生产 α干扰素，批准上市。产品逐渐淘汰。
细胞培养制药工艺
细胞系
动物细胞培养的应用
作为反应器用于制药：EPO，tPA 作为宿主细胞用于制药：病毒性疫苗 杂交瘤细胞：单克隆抗体，诊断、治疗 组织再生与器官移植（个体克隆）： 本身作为产品：皮肤移植，干细胞治疗 药学研究应用：分子与细胞药理、毒理、代谢 生命科学研究：器官发生，细胞、分子、遗传学
细胞培养制药工艺
细胞系
3.有限细胞系Finite cell line
概念:生长和寿命有限的细胞系。二倍体细胞系 特点：多次传代培养，失去增殖能力，老化死亡。 寿命：取决于细胞来源的物种和年龄、器官。 人细胞最高培养次数为50－60代。 胚成纤维细胞：人，50代；鸡胚，30代；小鼠，8代。
细胞培养制药工艺
生产特征
3.天然结构与活性的药物
完善的翻译后蛋白质修饰功能 游离核糖体：合成细胞质基质内的蛋白质。 与膜结合的核糖体：合成分泌性和膜整合蛋 白，多数为糖蛋白。 修饰：内质网加工，高尔基体加工、转运、分 泌，糖链。糖基化、磷酸化、酰胺化等。 活性分子：装配折叠形成精确的三维结构。

工程动物细胞培养制药工艺过程

工程动物细胞培养制药工艺过程工程动物细胞培养制药工艺过程是一种利用动物细胞培养技术来生产各种药物的方法。

该过程通常包括以下几个步骤：1. 动物细胞的选取和培养基的准备：首先，需要选择合适的动物细胞作为生产细胞株。

通常使用哺乳动物细胞，如CHO细胞等。

然后需要准备培养基，培养基中包含了生长和繁殖细胞所需的营养物质、生长因子和其他必要的成分。

2. 细胞的扩增和传代：将选取好的动物细胞接种在培养基中，通过提供适当的温度、pH和氧气浓度等环境条件，使细胞可以持续增殖和扩增。

当细胞达到一定的密度时，需要将其传代到新的培养器中，以维持细胞的生长状态。

3. 细胞的表达和分泌：在培养过程中，可以向培养基中添加适当的诱导剂，促使细胞表达和分泌所需的药物。

细胞内的基因表达会产生药物的前体分子，然后通过细胞分泌系统将其释放到培养基中。

此外，细胞内的代谢途径也会参与药物的合成和修饰。

4. 收集和纯化药物：当细胞分泌出药物后，需要对培养基进行采集和处理。

这通常包括离心和过滤等步骤，以去除细胞碎片和其他杂质。

然后可以通过柱层析、电泳或其他分离技术对药物进行纯化，以得到纯度较高的药物样品。

5. 进一步的处理和制剂制备：在得到纯化的药物后，可以进行进一步的处理和制剂制备。

这包括稳定性研究、配方优化和药物制剂的制备等。

最终，通过临床试验和质量控制等步骤，可以得到最终用于临床应用的制药产品。

总结而言，工程动物细胞培养制药工艺过程是一个复杂的生产过程，需要合理设计培养条件、监控细胞生长和药物表达等关键参数。

同时，也需要严格的质量控制和合规操作，以确保药物的质量和安全性。

这一过程在现代制药工业中扮演着重要的角色，为生产高质量的药物提供了可靠的方法。

工程动物细胞培养制药工艺过程是一种利用动物细胞培养技术来生产各种药物的方法，广泛应用于药品研发和制造领域。

它比传统的化学合成方法更安全、高效，并能够生产出高质量的药物。

在工程动物细胞培养制药工艺中，动物细胞株的选取是至关重要的一步。

生物制药工程：第四章-动物细胞工程制药

② 必须有足够的营养供应，绝对不可有有害的物质， 避免即使是极微量的有害离子的掺入；
③ 保证有适量的氧气供应； ④ 需要随时清除细胞代谢中产生的有害产物； ⑤ 有良好的适于生存的外界环境； ⑥ 及时分种，保持合适的细胞密度；
一、动物细胞的培养条件
1. 器材的清洗和消毒
Sterilization, disinfection: • Spraying Alcohol • UV light • Autoclave • Irradiation • Dry heating • Bleaching?
该细胞是成纤维细胞，能产生胶原，培养基用 BME （Eagle’s basal medium）加小牛血清，pH控 制 在7.2。细胞的倍增时间为24h，有限寿命为50 代， 上世纪60年代被广泛用于制备疫苗。
（2）BHK-21：
1961年从5只生长1天的地鼠幼鼠的肾脏中分离的。 现在广泛采用的是1963年用单细胞分离的方法经 13次的克隆的细胞。
2.基因载体的导入和高效表达工程细胞株的筛选
DNA导入动物细胞的常用方法
融合法
化学法
物理法
病毒法
细胞融合法 DNA-磷酸钙沉淀法 电穿孔法
脂质体介导法 DEAE-葡聚糖法 显微注射法
原生质融合法 染色体介导法
基因枪法
微细胞介导法
鬼影红细胞介导法
细胞融合法: cell fusion 脂质体介导法: liposome mediated gene transfer 原生质融合法: protoplast fusion 微细胞介导法: microcell mediated method 鬼影红细胞介导法: ghost mediated method
成纤维细胞,通常用的培养基 为DMEM培养基，添加7%胎 牛血清。过去多用于增殖病毒， 包括多瘤病毒、口蹄疫病毒和 狂犬病疫苗，现在已被用于构 建工程细胞。

细胞工程制药技术 动物细胞培养技术


Part2 植物细胞培养技术 二、动物细胞培养类型
2、动物组织培养
从动物体内取出组织，模拟体内的生理环境，在无菌、适温和丰富的营养条 件下，使离组织生存、生长并维持结构和功能的技术
（观看视频：用脂肪细胞培养骨 头-以色列干细胞治疗的新突破）
玻璃离子粘固剂（glass ionomer cement，GIC）
器官培养
培养类型 组Biblioteka 培养细胞培养Part2 植物细胞培养技术
二、动物细胞培养类型 1、动物器官培养
部分或整体器官在不损伤正常组织结构的条件下进行的培养，即仍保持组织 的三维结构，并模仿在各种状态下的器官功能
美国科学家从一只死亡的实验鼠 体内取出一颗完整的心脏，去除 其中的细胞结构，只留下心脏基 本的胶原结构，再向其注入从新 生鼠体内提取的未完全发育的心 脏细胞，并供给营养，成功地培 养出一颗活心脏
Part2 植物细胞培养技术
二、动物细胞培养类型 3、动物细胞培养
取动物胚胎或幼龄动物器官、组织。将材料剪碎，并用胰蛋白酶（或用胶原 蛋白酶）处理（消化），形成分散的单个细胞，将处理后的细胞移入培养基 中配成一定浓度的细胞悬浮液（观看视频：primary cells culture）
生化制药工艺
项目四 细胞工程制药技术
CONTENTS
目 录
1 细胞融合 2 植物细胞培养技术 3 动物细胞培养技术
03
动物细胞培养技术
Part2 植物细胞培养技术
一、动物细胞的生理特点 1、动物细胞生理特点
细胞的分裂周期长：12～18 h 细胞生长需贴附于基质，并有接触抑制现象 正常二倍体细胞的生长寿命有限 动物细胞对周围环境敏感 动物细胞对培养基的要求高 动物细胞对蛋白质的合成途径和修饰功能与细菌不同

动物细胞培养制药工艺


动物细胞培养
动物细胞培养技术
2、悬浮培养
概念：细胞在反应器内游离悬浮在培养液中生长的培 养过程。
优点： 操作简单，培养条件相对均一 传质和传氧较好，容易放大培养。
缺点： 细胞体积小 密度低 培养病毒易失去标记而降低免疫能力。
适用范围：悬浮细胞，兼性贴壁细胞，杂交瘤。 借鉴微生物发酵理论和经验，发挥动物细胞的特性。 培养容器：通气式搅拌和气升式生物反应器
动物细胞培养
动物细胞培养技术
3、半连续式操作
动物细胞培养生产药物中经常采用。已应用于大规模生产 乙肝表面抗原、t-PA等基因工程产物。
半连续操作特别适用于分泌表达型细胞，如杂交瘤细胞的 培养，尤其是微载体系统。
微载体系统培养基因工程CHO细胞，待细胞长满载体后， 反复收获细胞的分泌产物乙肝表面抗原，制备乙肝疫苗。
动物细胞培养
2、流加式操作
动物细胞培养技术
最常见的流加物质是葡萄糖、谷氨酰胺等能源和碳源物质。 通过流加控制，可实现高密度培养。
杂交瘤细胞培养，细胞密度可达1.4×107，生产抗体的产量 比分批操作提高几～10倍，可达500 mg/L。
由于培养体积不断变化，流加对过程的控制能力仍然有限 在实际生产中应用少。
动物细胞培养
1、单层贴壁培养
动物细胞培养技术
概念：细胞贴附于一定的固体支持表面上，形成单层 细胞的培养方法。大多数动物细胞属于贴壁依赖性，贴 壁培养是动物细胞培养的一种重要方法。
生长过程：
接种，细胞经过吸附、接触而贴附于基质表面； 进行生长、分裂繁殖，很快进入对数期。 数天就长满整个表面，形成致密单层细胞。
动物细胞培养技术
4、微载体培养
微载体
微载体：是指直径在60-250μm，能适用于贴壁细胞生长 的微珠。
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制药过程与工艺
二 动物细胞培养基本过程
1 原代细胞分离与培养 2 传代细胞培养
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制药过程与工艺
1 原代细胞培养－过程
动物组织或器官
洗涤 粉碎 酶解消化 离心或过滤
从体内取出组织或器官 经过粉碎、消化而获得单细胞 进行体外接种培养。 37℃消化，胰蛋白酶，胶原酶 工作浓度：0.1-0.3 mg/ml
一 对培养条件要求严格
➢动物细胞对周围环境十分敏感
✓ 无细胞壁保护，细胞膜直接接触外界。
✓ 物理化学因素：渗透压、pH、离子浓度、剪切力等耐 受力很弱，容易受伤害。
✓ 与细菌和植物细胞相比，动物细胞培养条件要求严格 地多。
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武汉科技大学
制药过程与工艺
1 温度
➢哺乳动物细胞最佳培养温度为 37℃ ➢鸡细胞为 39℃ ～ 40℃；昆虫类细胞为
制药过程与工艺
2 悬浮培养
➢细胞在反应器内游离悬浮在培养液中生长的培 养过程
➢优点：操作简单，培养条件相对均一，传质和 传氧较好，容易放大培养。
➢缺点：细胞体积小，密度低，培养病毒易失去 标记而降低免疫能力。
➢适用范围：悬浮细胞，兼性贴壁细胞，杂交瘤
➢借鉴微生物发酵理论和经验，发挥动物细胞的 特性
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制药过程与工艺
3 贴壁依赖性细胞
➢概念：anchoraged-dependent cell
✓ 需要有适量带电荷的固体或半固体支持表面才能生长 的细胞。
➢大多数动物细胞都属于此类。
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制药过程与工艺
4 非贴壁依赖性细胞
➢概念：anchoraged-independent cell
➢人体 ：血液pH比较恒定，7.36～7.44。
➢低于7.05 发生酸中毒，高于 7.45发生碱中毒。
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制药过程与工艺
4 渗透压
➢正常血浆渗透压为280～310 mOsm/kg ➢高渗溶液：高于310 mOsm/kg ➢低渗透压溶液：低于280mOsm/kg。 ➢动物细胞对渗透压有较强的耐受性 ➢离体培养细胞的渗透压应控制为等渗透溶液。 ➢增减 NaCl 的浓度调整渗透压，每增加
➢不同细胞系糖基化特征不同，选择适宜细胞 系。
➢对于分泌型蛋白，分泌泡与细胞膜融合，释放 到胞外，完成了蛋白质的分泌表达。
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武汉科技大学
制药过程与工艺
二 制药动物细胞的种类
➢目前用于制药的动物细胞有4类：
✓ 原代细胞系 ✓ 二倍体细胞系 ✓ 异倍体细胞系 ✓ 融合的或重组的工程细胞系
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武汉科技大学
制药过程与工艺
4 固定化培养
➢概念：用物理、化学方法将细胞固定在载体介 质上，然后进行悬浮培养。
➢应用：贴壁依赖性和非贴壁依赖性细胞。
➢优点：细胞密度高、抗剪切力和污染，生产首 选
➢方法
✓ 共价交联：双功能试剂处理，细胞之间交联。
✓ 吸附：物理吸附使细胞贴附在固体载体表面。
✓ 包埋：细胞包埋在载体内部。
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制药过程与工艺
三 动物细胞大规模培养方法
1 单层贴壁培养 2 悬浮培养 3 微载体培养 4 固定化培养
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制药过程与工艺
1 单层贴壁培养——概念与过程
➢细胞贴附于一定的固体支持表面上，形成单层 细胞的培养过程。
➢生长过程：接种，细胞经过吸附、接触而贴附 于基质表面；
➢进行生长、分裂繁殖，很快进入对数期。
25℃ ～28℃。 ➢耐受温度范围较窄，35℃～37℃
✓细胞受伤：39℃～40℃ 1小时，但能恢复。
✓ 受伤严重：41℃～42℃，部分可恢复。
✓ 死亡：43℃以上。
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制药过程与工艺
2氧气
➢动物细胞生长必须有氧气，缺氧时不能生存。
➢离体培养的气体：含有 5％CO2和95％空气， 其中氧浓度为 中氧浓度为21％。
② SV40病毒启动子驱动表达载体，在COS-1中 瞬时表达红细胞生成素
③ 昆虫SF9细胞中杆状病毒系统表达rhEPO。 产率有所改善，但糖基化程度较小
④ 干扰素-α基因启动子的rhEPO表达载体， BALL-1细胞，产生较高量的rhEPO。
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制药过程与工艺Βιβλιοθήκη ⑤ 大肠杆菌中表达，仅具有体外抗原结合活性。
✓ 不依赖于固体支持物表面生长的细胞，可在培养液中 悬浮生长，被称为悬浮细胞。
➢举例：血液、淋巴细胞、肿瘤细胞和某些转化 细胞，Namalwa细胞。
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制药过程与工艺
5 兼性贴壁依赖性细胞
➢概念：
✓ 对支持物的依赖性不严格，既可贴壁生长，也可悬浮 生长。
➢举例：CHO细胞、BHK细胞、L929细胞。 ➢理想的药物生产细胞系。
➢ 中间产物进入脂肪酸代谢、核酸代谢和氨基酸代谢。 葡萄糖代谢旺盛，产生大量乳酸，对细胞有毒性。
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制药过程与工艺
➢ Gln代谢：脱氨、转氨等作用，合成其他必需和非必 需氨基酸。
➢ Gln氮源，Gln受限，增加其他氨基酸消耗以补偿。
➢ 离体动物细胞系，转氨作用是主要代谢途径。谷氨酰 胺在脱氨酶的催化下，脱氨产生氨，对细胞有毒性。
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制药过程与工艺
4.3 动物细胞培养技术
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制药过程与工艺
一 细胞生长和基质依赖性
➢生长基质 ➢接触抑制 ➢贴壁依赖性细胞 ➢非贴壁依赖性细胞 ➢兼性贴壁细胞
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制药过程与工艺
1 生长基质
➢概念：growth substratum
✓ 把改变生长表面特性，促进细胞贴附的物质。
制药过程与工艺
细胞系分类
➢来源：原代细胞，传代细胞。 ➢寿命：有限细胞系，无限细胞系。 ➢染色体数目：二倍体细胞系，异倍体细胞系。 ➢获得方式：工程细胞系，癌变细胞系。 ➢生长特性：贴壁依赖型，非贴壁依赖型细胞系。
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制药过程与工艺
4.2 动物细胞的生产特征
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制药过程与工艺
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制药过程与工艺
1 工程CHO细胞系
共转染，筛选稳定表达的细胞系
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制药过程与工艺
第4章 动物细胞培养制药工艺
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制药过程与工艺
本章内容
4.1 制药动物细胞 4.2 动物细胞的生产特征 4.4 动物细胞培养技术 4.5 重组人红细胞生成素的生产工艺
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制药过程与工艺
4.1 制药动物细胞
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制药过程与工艺
一 动物细胞的结构与功能动物细胞的结构与功能
➢第二代：EPO突变体，2001,Amgen,Arasnep 长效。
✓ 二联体或三联体EPO：高活性，长效（3－5倍）
✓ 适应症：肾性贫血、艾滋病患者贫血、癌症相关贫血 等。隔日注射一次，长效EPO：每周一次。
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制药过程与工艺
4 rhEPO的表达研究
① 由再生障碍性贫血患者的尿液中纯化而得， 人源的红细胞生成素。产量极其有限。
➢数天就长满整个表面，形成致密单层细胞。
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单层贴壁培养——特点
➢优点：
✓ 容易更换培养液，灌注培养时，能达到高细胞密度； 有利于产物的分泌表达，可改变培养液与细胞的比例。
➢缺点：
✓ 操作较繁杂，检测受到限制，培养条件难以均一，传 质和传氧差，放大培养是瓶颈。
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泌，糖链。糖基化、磷酸化、酰胺化等。 ➢活性分子：装配折叠形成精确的三维结构。
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四 生产工艺特征
➢产品与天然的产物一致：适于临床使用 ➢动物细胞生产：70％蛋白质药物。 ➢培养工艺：难度大，产量低，成本高。 ➢胞外分泌产物：分离纯化简单。 ➢有潜在的血源性污染危险。
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1mg/ml NaCl，渗透压增加32 mOsm/kg。
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二 对培养基组成要求高
➢动物细胞对培养基的要求高
✓ 完全异养，容易利用、相对低分子量的营养物 ✓ 12中必需氨基酸 ✓ 8种以上维生素 ✓ 多种无机盐和微量元素 ✓ 多种附加成分：生长类、细胞因子和贴壁因子因子及
➢高氧环境：O2浓度 60%以上，对细胞毒性较 大，抑制生长和增殖，出现染色体异常等现象。
➢有时充以 有时充以N2气稀释O2浓度。
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3 pH值
➢低于6.8或超过 7.6会对细胞产生严重影响甚 至使细胞死亡。
➢机体细胞的pH 范围为6～8，而且在血液和体 液中，变化范围很小。
✓ 微囊法：亲水半透膜把细胞包埋在微囊内。
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4.4 重组人红细胞生成素生产工艺
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一 概述
➢天然红细胞生成素的发现与种类 ➢理化性质 ➢重组人红细胞生成素及其临床应用 ➢重组人红细胞生成素表达研究
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1 天然红细胞生成
细胞膜 细胞质 细胞核 没有细胞壁 亚细胞器
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动物细胞培养的代谢特征
➢ 葡萄糖和谷氨酰氨：能量和合成代谢的前体。
➢ 葡萄糖限制葡萄糖限制：通过增加谷氨酰氨消耗得以 补偿，反之通过增加谷氨酰氨消耗得以补偿，反之亦 然。