当前位置：文档之家 › 陆川猪耳部成纤维细胞的体外培养

陆川猪耳部成纤维细胞的体外培养

  • 格式：pdf
  • 大小：119.04 KB
  • 文档页数：4

下载文档原格式

  / 4

合集下载

猪耳成纤维细胞的体外培养及EGFP基因的转染

猪耳成纤维细胞的体外培养及EGFP基因的转染
维普资讯
上海农业学报
２ ０ ２ （ ） ０—１ ０ ７， ３ ４ ：１ ３
Ａｃ ａ Ａｇ ｉ ｕｌｕｒ ｅＳｈ ｇ ｉ ｔ ｒｃ ｔ ａ ａｎ ｈａ
文 章 编 号 ：０ ０３ ２ （ ０ ７ ０ —Ｏ ０ １ ０ —９ ４ ２ ０ ） ４ １ － ４
摘
要 ： 化 脂 质 体 Ｌｐ ｒｅ ｔｍｉ ０ ０转 染 Ｅ Ｐ 加 强 型 绿 色荧 光 蛋 白 ） 猪 耳 成 纤 维 细 胞 的 参 数 ， 优 ｉｅｆｃａ ｎ２０ ＧＦ （ 至 如
ＤＮ 和脂 质 体 的 用 量 、 胞 汇 合 度 、 胞 暴 露 于 ＤＮ 和 脂 质 体 复 合 物 的 时 间 。试 验 显 示 ： ４孑 板 内 １ ０嵋 Ａ 细 细 Ａ ２ Ｌ ． ＤＮ 和 ２４ｕ Ａ ． Ｌ脂 质 体 的 用 量 转 染 效 率 最 高 ， ＤＮＡ 和 脂 质 体 过 量 会 对 细 胞 产 生 毒 性 ， 响转 染 效 率 ； 胞 汇 合 影 细
猪 耳 成 纤维 细 胞 的体 外 培 养及 Ｅ Ｐ基 因 的转 染 ＧＦ
刘 伟 ， 华莉 ， 吴 张德 福“
（ 上 海 市 农 业 科 学 院 畜 牧 兽 医 研 究 所 ， 海 ２ １０ ； 京 农 业 大 学 动 物 科 技 学 院 ， 京 ２ ０ ９ ） ’ 上 ０ １６ 南 南 １０ ５
阳离子 脂质 体介 导转 染核 酸进 入真 核 细胞 的方 法 是从 ２ ０世 纪 ８ ０年代 中期 发 展 起 来 的 一种 转 染 技 术 。阳离 子脂质 体 本身带 有 正 电荷 ， 以将 携带 负 电荷 的外 源基 因导 入任 意 种类 哺乳 动物 的原 代细 胞 可 或 连续 培养 的细 胞 ， 因此 是应 用较 广泛 的介 导转 染 方法 之 一 。研 究 发 现影 响 脂 质体 转 染效 率 主 要有 细

滇南小耳猪胆道成纤维细胞的培养鉴定

滇南小耳猪胆道成纤维细胞的培养鉴定
云南医药2021年第42卷第3期
•论著，
滇南小耳猪胆道成纤维细胞的培养鉴定
• 217 •
陈磊1,官德绅2,李皎1,胡平海1 （1.云南省第一人民医院肝胆外科，云南昆明650032; 2.景东县人民医院，云南普洱676200）
摘要：目的探索滇南小耳猪胆道成纤维细胞的培养方法，为进一步研究胆道良性狭窄奠定基础。方法用滇南小耳猪 建立胆道损伤模型，用组织贴壁法，并尝试了不同的培养基和胎牛血清浓度后，探索出成熟的滇南小耳猪胆道成纤维细胞的 培养方法，并用细胞免疫荧光化学检测波形蛋白和结蛋白鉴定为成纤维细胞。结果组织贴壁法可以培养出可以传代的胆道 成纤维细胞。结论胆道成纤维细胞是一种具有增生和多向分化潜能的细胞，较难培养传代，其成功培养为下一步药物干预 的研究打下良好基础。
图6细胞免疫荧光检测结蛋白。10x40倍
•Hale Waihona Puke 220 •3讨论 成纤维细胞是结缔组织中最常见的细胞，由
胚胎时期的间充质细胞分化而来，可合成和分泌 胶原纤维、弹性纤维、网状纤维及有机基质，同 时，成纤维细胞是一种功能活跃的细胞，在多种 因素的影响下会发生增生、趋化或表现型转化。 近年来逐渐认识到成纤维细胞与瘢痕挛缩关系密 切叫 瘢痕是创伤后组织修复过程中的必然产物， 瘢痕的形成与伤口局部炎性细胞和一系列生长因 子密切相关，同时存在细胞的过度增殖和凋亡受 到抑制叫有研究显示良性胆道狭窄的形成的机理 与皮肤瘢痕的形成较为相似，均存在细胞的增殖 和凋亡的平衡被破坏，细胞凋亡受到抑制，尤其 是成纤维细胞大量增殖并过度分泌胶原等基质成 分所致。肝外胆管及胆总管的管壁由内向外由粘 膜、纤维肌层和外膜组成。生理状态下直接与胆 汁接触的为最内层的黏膜层，胆道损伤以后，大 量处于静止期的成纤维细胞则位于黏膜下的纤维 肌层。胆道损伤以后，粘膜的破坏使纤维肌层即 暴露于胆汁成分所造就的慢性炎症环境下叫创缘 静止的成纤维细胞，在细胞因子的调控下，可分 化为具有特异的a平滑肌肌动蛋白的收缩表型， 即肌成纤维细胞(myofibroblast, MFB),引起整个 肉芽组织的收缩。由此可见，成纤维细胞是一种 具有增生和多向分化潜能的细胞，它参与多种生 理及病理反应过程，在胆道良性狭窄的发生、发 展中起重要的作用叫耿智敏等问通过建立犬胆道 损伤模型观察胆道瘢痕的显微和超微结构发现， 肌成纤维细胞在正常胆道壁中很少出现，而在胆 道瘢痕中则持续存在，并认为肌成纤维细胞的持 续存在及其所具有的收缩能力是导致胆道瘢痕性 狭窄的重要因素。胆道成纤维细胞的培养是较为 困难的一环，特别是正常胆道来源的成纤维细胞， 这可能与物种和胆道细胞的特性有关，同时又是 研究良性胆道狭窄非常重要的一环。掌握有效的 动物模型胆道成纤维细胞的培养方法将为今后对 良性胆道狭窄的研究提供基础，并为后续体外药 物或基因治疗干扰降低成纤维细胞的增生的能力 提供实验对象。经文献査询，国内外尚未发现猪 的胆道成纤维细胞的培养的报道。在滇南小耳猪 胆道成纤维细胞的原代培养过程中，下列问题值 得注意：①尽量选择月龄较小的动物。经过多次 实验，动物的年龄越轻，细胞越容易游离，细胞 的生长也越旺盛。②组织块接种至培养瓶后要放

猪耳皮肤成纤维细胞的培养

猪耳皮肤成纤维细胞的培养

猪耳皮肤成纤维细胞的培养
于玲珠;刘娣;孙兴参;张冬杰;梁洋;杨秀芹;于浩;高文学
【期刊名称】《细胞生物学杂志》
【年(卷),期】2003(25)4
【摘要】本研究以猪耳皮组织为材料,采用胰蛋白酶冷热处理结合法成功地分离和培养了猪耳皮肤成纤维细胞。

此方法的细胞存活率相对于胰蛋白酶热处理法较高。

传代细胞与原代细胞的形态和生长速度均相似。

传代细胞未检测到凋亡现象。

细胞已传至15代以上,染色体倍性正常,说明我们所建立的胰蛋白酶冷热处理结合法可以快速有效的分离和培养猪耳皮肤成纤维细胞,并且能稳定的进行传代培养。

【总页数】4页(P258-260)
【关键词】猪;耳皮;成纤维细胞;培养;细胞凋亡
【作者】于玲珠;刘娣;孙兴参;张冬杰;梁洋;杨秀芹;于浩;高文学
【作者单位】东北农业大学动物科技学院;东北农业大学生命科学学院;东北农业大学动物医学学院
【正文语种】中文
【中图分类】Q255;S828
【相关文献】
1.成年黇鹿耳皮肤成纤维细胞的分离与培养 [J], 王启凤;王锋
2.猪耳皮肤组织冷藏后成纤维细胞的特性变化 [J], 陶立梅;黄昊洁;张越;孙瑜;芮荣
3.利用民猪耳缘组织重复培养成纤维细胞的研究 [J], 王春安;狄生伟;付德昌;郑鹏
4.利用动物耳皮肤组织培养成纤维细胞的研究 [J], 王红梅;黄俊成;刘明军;王立虎;计巧灵;郭志勤
5.麋鹿耳皮肤成纤维细胞的分离、培养与核型分析 [J], 赵雪萍;张寒莹;王子玉;许丹;孙永成;王锋;丁玉华
因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

成体动物皮肤细胞体外培养

成体动物皮肤细胞体外培养

成体动物皮肤细胞培养一，猪耳皮肤成纤维细胞培养：取材：在种猪场，选取1-6周龄幼猪，尽量挑选猪耳组织上血管较细少的部位，用刮毛刀刮毛后，无菌取一块猪耳组织，将组织块放入含有250iu/ml青霉素和250µg/ml链霉素的无菌PBS中，4℃保温立即带回实验室。

酶消化法分离培养猪耳皮肤成纤维细胞：在超净台上，将猪耳组织块浸入到70%酒精10-30s，然后置于无菌培养皿中，用眼科剪剪去毛，用含有100iu/ml青霉素和100µg/ml链霉素的无菌PBS涮洗3-5遍，在PBS中将猪耳组织块剪碎成1-3mm3的小块，并将猪耳组织块等分到两个培养瓶中，分别采用胰蛋白酶热处理法与胰蛋白酶冷热处理结合法分离细胞。

（1）胰蛋白酶热处理法待组织块下沉后，吸去上清，向其中一个培养瓶中加入含有0.25%胰蛋白酶-0.04%EDTA 的消化液，密封瓶口后，置于37℃下消化30min,中间摇匀数次，消化结束后，收集含有解离下来细胞的消化液，置4℃冰箱内冷却，在所余组织上再一次加入消化液，重复上述消化步骤四次，并将每次收集到的含有细胞的消化液混合到一起，离心去上清，重悬于1ml37℃预温的DMEM/F12（GIBCO)培养液（含20%胎牛血清，2mmol/l谷氨酰胺，100iu/ml青霉素和100µg/ml链霉素），吹打均匀后，将1滴细胞悬液与2滴2%的台酚蓝液混合后，滴入细胞计数板，2min后，在显微镜下计数至少299个细胞，未着色的为活细胞，呈蓝色的为死细胞，计算活细胞百分比。

（2）胰蛋白酶冷热处理结合法向另外一瓶中加入少量含0.25%胰蛋白酶-0.04%EDTA的消化液，置于4℃冰箱。

冷消化1-2h,改为用37℃培养箱继续进行消化。

30-60min后加入1ml37℃预温的DMEM/F12培养液（含20%胎牛血清，2mmol/l谷氨酰胺，100iu/ml青霉素和100µg/ml链霉素），吹打均匀后，用上述的台酚蓝排出检测法计算活细胞的百分比。

Hartley豚鼠耳朵成纤维细胞分离培养与鉴定分析

Hartley豚鼠耳朵成纤维细胞分离培养与鉴定分析
ｃｌｅａｒ ａｎｄ ｉｎ ｇｏｏｄ ｓｈａｐｅ. Ｔｈｅ ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｗａｓ ｎｅｇａｔｉｖｅ. Ｔｈｅ ｃｅｌｌｓ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ￣ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎ ｖｉｍｅｎ￣
ｔｉｎ. Ｔｈｅ ｇｒｏｗｔｈ ｃｕｒｖｅ ｗａｓ Ｓ￣ｓｈａｐｅｄꎬ ｗｈｉｃｈ ｗａｓ ｃｏｎｓｉｓｔｅｎｔ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｎｏｒｍａｌ ｇｒｏｗｔｈ ａｎｄ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ ｒｕｌｅｓ ｏｆ ｃｕｌｔｕｒｅｄ ｃｅｌｌｓ
摘 要: 本文旨在建立快速获取豚鼠耳朵成纤维细胞的方法ꎬ为豚鼠体细胞重编程技术提供起始细胞ꎮ 首先
采用 ０. ０５％ Ｔｒｙｐｓｉｎ￣ＥＤＴＡ 和 Ｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅ ＩＶ 两种消化酶对脱毛后的耳朵组织碎块进行消化ꎻ然后对获取的细胞
进行体外培养和形态学观察ꎬ支原体检测ꎬＶｉｍｅｎｔｉｎ 蛋白免疫荧光鉴定ꎬ测定细胞生长曲线计算细胞倍增时间ꎻ
续进一步研究豚鼠体细胞重编程提供了技术基础ꎮ
关键词: Ｈａｒｔｌｅｙ 豚鼠ꎻ 耳朵ꎻ 成纤维细胞ꎻ 生物学特性
中图分类号: Ｒ￣３３２
文献标志码: Ａ
ＤＯＩ:１０. ３９６９ / ｊ. ｉｓｓｎ. １００７￣７１４６. ２０１９. ０３. ００６
Ｅｓｔａｂｌｉｓｈｍｅｎｔ ａｎｄ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｉｎ ｖｉｔｒｏ Ｃｕｌｔｕｒｅ
用绿色荧光蛋白的逆转录病毒感染后用流式细胞仪检测感染效率ꎬ核型鉴定检测病毒对核型的影响ꎮ 分离的
豚鼠耳朵成纤维细胞为贴壁生长细胞ꎬ消化后 ２ ~ ３ ｈ 即大部分贴壁并基本完全伸展ꎬ细胞呈梭形或多角形ꎬ胞
浆饱满ꎬ立体感强ꎬ细胞核清晰形态良好ꎬ支原体检测阴性ꎮ 细胞表达成纤维细胞特异性蛋白 Ｖｉｍｅｎｔｉｎꎮ 生长曲

猪皮肤成纤维细胞的培养与鉴定

猪皮肤成纤维细胞的培养与鉴定

文章编号:100025404(2004)1321171204 论著猪皮肤成纤维细胞的培养与鉴定丁生财1,陈意生1,魏　泓2,刘　萍3 (第三军医大学:1西南医院病理科,2实验动物中心,重庆400038,3新桥医院妇产科,重庆400037) 提　要:目的　研究猪内源性逆转录病毒在体内和体外的感染性,建立理想的细胞模型,为猪一人间跨种移植的生物安全性评价奠定良好的基础。

方法　运用组织块培养法、冷胰蛋白酶方法及热胰蛋白酶方法培养猪皮肤成纤维细胞,比较3种方法的优点和缺点。

结果　建立了猪皮肤成纤维细胞系组织块培养法优于胰酶法。

结论　应用组织块培养法培养猪皮肤成纤维细胞优于胰酶法,经济实惠、操作简便、易于掌握;并为研究PERV在体内和体外的感染性提供了理想的细胞模型,为评估猪一人间跨种移植的生物安全性提供一种新的方法;对建立动物克隆生产的皮肤体外培养模式具有重要的参考价值。

关键词:成纤维细胞;猪内源性逆转录病毒;异种移植;生物安全性;感染;培养;皮肤;猪 中图法分类号:R322.99;R329.2 文献标识码:ACultivation and identification of porcine skin fibroblastsDI NG Sheng2cai1,CHE N2Y i2sheng1,WEI H ong2,LI U Ping3(1Research Institute of Pathology,S outhwest H ospital,2Department of Lab2 oratory Animal Science,3Department of Obstetrics and G ynecology,X inqiao H ospital,400037,Third Military Medical University,Chongqing 400038,China) Abstract:Objective s　T o establish an ideal cellular m odel for the study of in fection of porcine endogenous ret2 rovirus in intro and in vivo and to lay the foundation for evaluating the biological safety of xenotransplantation.Meth2 ods　P orcine skin fibroblasts were cultured by tissue pieces,cold trypsin,and heat trypsin,respectively.The merit and defect of these methods were analyzed.Re sults　P orcine skin fibroblast line was established and the tissue piece method was superior to trypsin methods.Conclusion　Culture of porcine skin fibroblasts with tissue pieces is superi2 or to trypsin method,with the characteristics of low cost and easy operation.The established porcine skin fibroblast cell line supplies an ideal cell m odel for the study of in fection of porcine endogenous retrovirus in vitro and in vivo, provides a new method for the evaluation of biological safety of xenotransplantation,and plays an im portant role in the skin culture m odel of production of cloned animals. K ey w ords:fibroblast cell;porcine endogenous retrovirus;xenotransplantion;biological safety;in fection;cul2 ture;skin;pig 猪器官、组织和细胞作为猪一人间跨种移植的供体源具有广阔的前景,但其基因组载有猪内源性逆转录病毒前病毒序列,可能导致猪内源性逆转录病毒(porcine endogenous retrovirus,PERV)种间传播发生的潜在危险。

14760186_马身猪耳缘组织成纤维细胞的体外培养与鉴定


部组织!进行成 纤 维 细 胞 培 养' 挑 选 猪 耳 组 织 上 血 板!于*/ a(2C ;^0 培 养 箱 中 培 养' 从 接 种 时 间
管较少的部 位!用 /2C 乙 醇 擦 拭 消 毒!快 速 剪 下 耳 算起!每天同一时间对*个孔中的细胞进行计数!计
尖皮肤块!将组织块浸入/2C乙醇中%&Z后放入装 算平均值'以培养 时 间 为 横 坐 标(细 胞 密 度 为 纵 坐
李 步 高 "%3/&!#!男 !山 西 武 乡 人 !博 士 !教 授 !研 究 方 向 $动 物 遗 传 育 种 与 繁 殖 !G!HB$:$+$-68--!%(*',#H
Copyright©博看网. All Rights Reserved.
003&
中!国!畜!牧!兽!医
)) 卷 !
型猪母本专 门 化 品 系 =<!( 系(=<!$ 系(山 西 白 猪 /0Y后观察组织块旁细胞生长情况'
有 @A="含%C双抗#的离心管中!尽快带 回 实 验 室' 标绘制生长曲线!其余孔每0"换一次液'
在超净工作台 上!将 猪 耳 组 织 浸 入 /2C 乙 醇 %&Z! %'('*!染色体分析"]*代细胞处理#! !将 处于 对
置于无菌培养皿中!用眼科剪去毛后剪成%'0HH* 数生长期达 到 1&C '3&C 汇 合 成 单 层 的 细 胞 添 加
! ! 马 身 猪 是 山 西 省 优 良 地 方 猪 种 !历 史 悠 久 !具 有 繁殖力强(适应性 好(抗 逆 及 抗 病 能 力 强(肉 品 质 好

猪皮肤成纤维细胞PERV体外和体内感染性分析

猪皮肤成纤维细胞PERV体外和体内感染性分析摘要：目的研究分析猪皮肤成纤维细胞猪内源性反转录病毒（perv）的体外和体内感性。

方法运用组织块培养法建立猪皮肤成纤维细胞系，使得该细胞系与人胚胎肝细胞混合共同体外培养，一段时间后将猪皮肤成纤维细胞系移植到具有免疫缺陷疾病的小鼠体内，观察perv对人胚胎肝细胞和对小鼠的感染情况。

结果猪皮肤成纤维细胞系在与人胚胎肝细胞共同培养的过程中使其感染perv；具有免疫缺陷的小鼠体内的猪皮肤成纤维细胞与小鼠体内的正常细胞发生了微嵌合，并且perv也感染了移植小鼠的多种脏器和组织。

结论猪皮肤成纤维细胞中的perv具有体外和体内感染性，但能否继续在体内复制、转录等过程仍尚待进一步研究。

该结果预示在猪异种器官移植过程中需要注意perv，以免发生感染。

关键词：猪皮肤成纤维细胞；perv；体内和体外感染中图分类号：s828 文献标识码：a猪内源性反转录病毒（perv，porcine end ogenous retrovirus）[1]，这种病毒普遍存在于猪体内，已经与猪本身的基因结合，无法去除，该病毒对猪无害。

目前在临床上越来越多的疾病需要器官移植，但是供体器官资源却十分匮乏，因此医师更多的考虑到异种移植，而且考虑到与人体有更小的排异反应，猪是最合适的异种移植供体物种。

但在临床上发现，猪体内普遍存在着perv，其对猪本身无影响，但对人的危害却没有科学的论断，因此异种移植是否安全也是一个悬而未决的问题。

凭借我国丰富的小型猪种资源，笔者开展了猪皮肤成纤维细胞perv体内和体外感染的实验，并就其结果做探讨分析。

1 资料与方法1.1 一般资料人胚胎肝细胞选自9～19周的婴儿死胎，死前测定其母亲的肝功能均正常并且所有的胚胎肝细胞不带有其他感染性疾病。

所有的胚胎肝细胞的选取均经过家属的同意并签字授权。

猪皮肤成纤维细胞来自中国实验小型猪(zgsy），原代取在其腹壁皮肤，并经检验确认其含有perv病毒（perv-a,perv-b）。

猪胎儿肾脏成纤维细胞体外培养体系的建立


细 胞 为 胎 儿 肾脏 成纤 维 细 胞 。 使用 血 清 饥 饿 法 和 接 触 抑 制 法 诱 导 细 胞 进 入 Ｇ Ｏ ／ Ｇ １ 期 ，并 且 分 别 比较 两 者 同 期 化 效率 ，结 果 显 示 ：血 清 饥 饿 ２ ｄ和 ４ ｄ 的 同 期 化 效 率 差 异 不 显 著 ，但 都 比 ８ ｄ组 的 高 （ ８ ８ ． ９ ７ ％和 ８ ７ ． ６ ９ ％ 比
维普资讯
动物 学报
５ ３ （ ６ ） ： １ ０ ５ ４—１ ０ ６ ２ ，２ ０ ０ ７
Ａｃ ｔ ａ Ｚｏ ｏ ｌ ｏ ｇｉ ｃ ａ Ｓ ｉ ｎ ｉ ｃ ａ
猪Ｉ ］ ￣ Ｊ Ｌ 肾脏 成 纤 维细 胞 体 外 ． Ｓ ｈ ｅ ｎ ｇ ， ，Ｌ Ｉ Ｕ Ｈ ｏ ｎ ｇ ． Ｂ ｏ ， ，曲
Ｐ ｅ ｉ ． Ｒ ｕ ， ，Ｌ Ｕ Ｙ ａ ｎ ｇ ． Ｑ ｉ ｎ ｇ 一，
ＹＡＮＧ Ｘｉ ａ ｏ ． Ｇａ ｎ ， ，Ｐ Ｉ Ｄａ ｏ ． Ｙｕ ａ ｎ ， ，Ｌ Ｕ Ｋｅ — Ｈｕ ａ ｎ ’
Ａｂ ｓ ｔ ｒ ａ ｃ ｔ Ａ ｍｅ ｔ ｈ ｄ ｉ ｅ ｓ ｄ ｅ ｓ ｃ ｉｂ ｒ ｅ ｄ ｆ ｏ ｒ ｉ ｓ ｏ ｌ ａ ｔ ｉ ｏ ｎ ａ ｎ ｄ ｃ ｕ ｌ ｔ ｕ ｒ ｅ ｏ ｆ ｐ ｏ ｃｉ ｒ ｎ ｅ ｋ ｉ ｄｎ ｅ ｙ ｆ ｅ ｔ ａ ｌ ｉｂ ｆ ｏｂ ｒ ｌ ａ ｓ ｔ ｃ ｅ ｌ ｌ ｓ ｄ ｅ ｉｎ ｆ ｅ ｄ ｆ ｏｒ ｐ ｏ ｃｉ ｒ ｎ ｅ ｓ ｏ ｍａ ｔ ｉ ｃ ｎ ｕ ｃ ｌ ｅ ａ ｒ ｔ ｒ ａ ｎ ｓ ｆ ｅ ｒ ．Ｐ ０ ｒ ｃ ｉ ｎ ｅ ｆ ｅ ｔ ａ ｌ ｋ ｉ ｄ ｎ ｅ ｙ ｉ ｆ ｂ ｏｂ ｒ ｌ ￣ｔ ｃ ｅ ｌｓ ｗｅ ｒ ｅ ｉｒ ｆ ｓｔ ｉ ｓ ｏ ｌ ａ ｔ ｅ ｄ ａ ｎ ｄ ｉ ｄｅ ｎ ｔ ｉ ｉｅ ｆ ｄ ｂ ｙ ｍｏ ｒ ｐｈ ｏ ｌ ｏ ｙ ｇ ａ ｎ ｄ Ｉ ｍｍｕ ｎ ｏ ｌ ｆ ｕ ｏ ｒ ｅ ｓ ｃ ｅ ｎ ｃ ｅ．Ｔｈ ｅ

马身猪耳缘组织成纤维细胞的体外培养与鉴定

马身猪耳缘组织成纤维细胞的体外培养与鉴定张旗;曹果清;李步高;郭晓红;高鹏飞;靳玉舒;李萌;成志敏;张宁芳;乐宝玉;刘宏【摘要】为研究马身猪体细胞的生物学特性,试验以3日龄马身猪耳缘组织为材料,采用组织块贴壁法建立马身猪耳缘组织成纤维细胞系,并对体外获得的细胞系进行生物学特性检测.结果表明,获得的马身猪耳缘组织成纤维细胞系符合成纤维细胞的基本特征,细胞贴壁生长,呈典型的梭形、星形和多边形,细胞汇合成单层的时间为10～13 d,生长曲线呈S型,中期染色体二倍体(2n=38)占主体,约占细胞总数的84％,符合细胞建系的要求;脂质体(LipofectamineTM 2000)转染绿色荧光蛋白质粒(pEGFP-C1)的转染效率为25％.马身猪耳缘组织成纤维细胞系的成功建立为地方猪种遗传资源的保护开辟了新的方法.%In order to study the biological characteristics of somatic cells of Mashen pig,the ear marginal fibroblast cell lines of Mashen pig were established from 3 days old Mashen pig by direct explant method,and the biological characteristics of cell lines were detected.The results showed that the cell lines obtained from Mashen pig were in conformity with basic properties of typical fibroblasts,the shape of adherent cells were typical spindle,star and polygon,the time of grew into monolayer cells was 10 to 13 d,the growth curve was typical S shaped.The frequency of metaphase chromosome number(2n=38)was about 84％of the total number of cells,and it had met the establishment standard of fibroblast cell line.The transfection efficiency of green fluorescentprotein(pEGFP-C1)transfected by lipofectamine-mediated method was 25％.The successful establishment of the fibroblast cell lines of Mashen pig had opened up a new method for the conservation of genetic resources.【期刊名称】《中国畜牧兽医》【年(卷),期】2017(044)008【总页数】6页(P2289-2294)【关键词】马身猪;成纤维细胞系;组织块贴壁法【作者】张旗;曹果清;李步高;郭晓红;高鹏飞;靳玉舒;李萌;成志敏;张宁芳;乐宝玉;刘宏【作者单位】山西农业大学动物科技学院,太谷 030801;山西农业大学动物科技学院,太谷 030801;山西农业大学动物科技学院,太谷 030801;山西农业大学动物科技学院,太谷 030801;山西农业大学动物科技学院,太谷 030801;山西农业大学动物科技学院,太谷 030801;山西农业大学动物科技学院,太谷 030801;山西农业大学动物科技学院,太谷 030801;山西农业大学动物科技学院,太谷 030801;山西农业大学动物科技学院,太谷 030801;大同市种猪场,大同 037000【正文语种】中文【中图分类】Q813.1+1马身猪是山西省优良地方猪种，历史悠久，具有繁殖力强、适应性好、抗逆及抗病能力强、肉品质好等优点[1]。

  1. 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
  2. 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
  3. 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。

第２天投入 液 氮 。 ［８］ 复 苏 细 胞 时，从 液 氮 中 取 出 冻 存管，快速投入４２℃温水中，并 不 断 摇 动 冻 存 管，使 其迅速融化，一 般 １ ｍｉｎ 左 右 即 可 完 成 。 ［９］ 待 冰 块 全 部 融 化 后 ，在 超 净 工 作 台 内 ，将 细 胞 悬 液 转 移 至 离 心管中，加入预热的 ＤＭＥＭ 培 养 液，离 心（１ ０００ｒ／ ｍｉｎ，５ ｍｉｎ）２ 次，去 除 上 清，再 次 加 入 预 热 的 ＤＭＥＭ，用 吸 管 轻 轻 吹 打 重 悬 细 胞，以 １×１０６ 个／ ｍＬ 左右的密 度 接 种 于 培 养 皿 中，用 枪 轻 轻 吹 打 使 细胞分散均匀。次 日 观 察 细 胞 贴 壁 情 况，去 除 皿 中 的培养液及漂浮的死细胞，加入新鲜预热的 ＤＭＥＭ 继 续 培 养 ，以 后 每 ２ 天 换 液 １ 次 。 １．２．４ 细胞类型鉴定 用 ＤＰＢＳ清洗盖玻片３ 遍， 用７５％的甲醇 将 生 长 在 盖 玻 片 上 的 陆 川 猪 耳 朵 成 纤维细胞 固 定 １５～２０ ｍｉｎ，ＤＰＢＳ（ＰＨ ７．４）浸 洗 盖 玻片３遍；室温下，在 ０．２％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００ 的 ＤＰＢＳ 渗透液中处理３０ｍｉｎ，用 ＤＰＢＳ清洗３遍，随后浸入 １％ ＢＳＡ 的 ＤＰＢＳ封闭液中处理３０ｍｉｎ，ＤＰＢＳ（ＰＨ ７．４）清洗３遍；分 别 加 入 小 鼠 抗 波 形 蛋 白 单 克 隆 抗 体或小鼠抗角形蛋 白 单 克 隆 抗 体 （二 者 稀 释 浓 度 为 １∶２００），４℃ 过 夜。ＤＰＢＳ 清 洗 ３ 遍，每 次 浸 泡 ５ ｍｉｎ，再与１∶２００ 稀 释 的 ＦＩＴＣ 标 记 的 山 羊 抗 小 鼠 ｌｇＧ 室温孵 育 １ｈ；ＤＰＢＳ 清 洗 ３ 次，每 次 ５ ｍｉｎ，然 后 把所有 ＦＩＴＣ 标记的样品再用５ｍｇ／Ｌ 的 ＰＩ室温 孵 育 １０ ｍｉｎ，ＤＰＢＳ（ＰＨ ７．４）清 洗 ３ 遍 ，荧 光 显 微 镜 下观察。检测 ＦＳＨＲ 表 达 时 以 山 羊 抗 ＦＳＨＲ 多 克 隆抗体为一抗，驴抗山羊ＩｇＧ－ＦＩＴＣ 为 二 抗，方 法 同 上。各设 ２ 个 对 照 组：自 发 荧 光 对 照，标 本 只 用 ＤＰＢＳ清洗，镜检有无荧光；荧光抗体对照，用 ＤＰＢＳ 代替一抗，以排除非特异的二抗结合 。 ［１０－１２］
Ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ ｅａｒ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ ｃｅｌｌｓ ｆｒｏｍ Ｌｕ－ｃｈｕａｎ ｐｉｇ
ＱＩＮ Ｘｉａｏ－ｅ，ＨＵ Ｌｉｎ－ｌｉｎ，ＬＵ Ｓｈｅｎｇ－ｓｈｅｎｇ＊ ，ＬＵ Ｋｅ－ｈｕａｎ＊ （Ｇｕａｎｇｘｉ Ｋｅｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ Ｓｕｂｔｒｏｐｉ－
ｃａｌ Ｂｉｏ－Ｒｅｓｏｕｒｃｅ Ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｕｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ，Ａｎｉｍａｌ Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｇｕａｎｇｘｉ Ｕｎｉｖｅｒｓｉ－ ｔｙ，Ｎａｎｎｉｎｇ５３０００４，Ｃｈｉｎａ）
广西 南宁 ５３０００４）
摘要：本研究建立陆川猪耳部成纤维细 胞 的 体 外 培 养 体 系，采 用 组 织 块 培 养 法 可 以 获 得 陆 川 猪 耳 部 成 纤 维 细 胞。 用０．２５％胰蛋白酶＋０．０２％ＥＤＴＡ 消化液消化 细 胞、用 含 有 １０％ＦＢＳ 的 ＤＭＥＭ 对 细 胞 进 行 培 养，能 很 好 的 支 持 陆川猪耳部成纤维细胞的生长。传３代后，观察到培养的细胞形态逐渐均一，为 典 型 的 成 纤 维 细 胞，绝 大 部 分 呈 梭 形或不规则三角形。细胞生长时呈放射状、火焰状或旋涡状走势。用间接免 疫 荧 光 法 对 细 胞 类 型 进 行 鉴 定 。 抗 波 形蛋白免疫荧光染色显示为阳性，抗角形蛋白 免 疫 荧 光 染 色 为 阴 性。 结 果，分 离 得 到 的 细 胞 为 成 纤 维 细 胞。 结 果 表 明 ，用 组 织 块 培 养 法 ，可 以 培 养 出 陆 川 猪 耳 部 成 纤 维 细 胞 。 关 键 词 ：陆 川 猪 ；耳 部 成 纤 维 细 胞 ；组 织 块 培 养 ；间 接 免 疫 荧 光 中 图 分 类 号 ：Ｑ８１３ 文 献 标 志 码 ：Ａ 文 章 编 号 ：１００５－４５４５（２０１１）０８－１１８９－０３
收 稿 日 期 ：２０１０－０６－１２ 基 金 项 目 ：国 家 自 然 科 学 基 金 资 助 项 目 （３０８６００３９）；农 业 部 “转 基
因生物新品种培育 重 大 专 项”项 目 （２００９ＺＸ０８０１０－０２３Ｂ）；广 西 科学研究与技术开发计划资助项目（桂科能０８１５０１１－６－３） 作 者 简 介 ：秦 小 娥 （１９８２－），女 ，硕 士 。 ＊通讯作者
１１９０
中 国 兽 医 学 报 ２０１１年８月 第３１卷 第８期 Ｃｈｉｎ Ｊ Ｖｅｔ Ｓｃｉ Ａｕｇ．２０１１ Ｖｏｌ．３１ Ｎｏ．８
１ 材料与方法
１．１ 试 验 药 品 培 养 皿 （Ｆａｌｃｏｎ，ＢＤ，Ｕ．Ｓ．Ａ．）， ＮａＨＣＯ３（Ｓｉｇｍａ），丙 酮 酸 钠 （Ｓｉｇｍａ），乙 二 胺 四 乙 酸二钠（Ｓｉｇｍａ），胰蛋白酶 Ｔｒｙｐｓｉｎ（Ｓｉｇｍａ）；ＤＭＥＭ （高糖，ＧＩＢＣＯ），青、链霉素 （Ｓｉｇｍａ），胎 牛 血 清 ＦＢＳ （杭州四季青），甲醇（洛阳 化 学 药 品 厂），ＤＰＢＳ 粉 剂 （ＧＩＢＣＯ，无 钙 离 子 ），ＤＭＳＯ（Ｓｉｇｍａ），小 鼠 抗 人 细 胞角蛋白单克隆抗 体、小 鼠 抗 人 波 形 蛋 白 单 克 隆 抗 体和山羊抗 ＦＳＨＲ 多克隆抗体、抗组蛋白 Ｈ３Ｋ９ 抗 体为一抗；羊抗小鼠ＩｇＧ／异 硫 氰 酸 荧 光 素 （ＦＩＴＣ）、 驴抗山羊ＩｇＧ－ＦＩＴＣ、山羊抗兔ＩｇＧ－ＦＩＴＣ 为 二 抗 均 购自美国 Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ公司。 １．２ 试 验 方 法 １．２．１ 材料获取与 原 代 培 养 剪 取 新 生 陆 川 猪 耳 部组织，用 酒 精 浸 泡 １ ｍｉｎ，然 后 用 含 有 抗 生 素 的 ＰＢＳ清洗３遍，放入小 的 青 霉 素 瓶 中 用 灭 菌 的 剪 刀 将组织块剪碎，用 ＰＢＳ离 心 洗 涤 ３ 遍，再 用 ＤＭＥＭ 洗涤１ 遍，弃 去 上 清，加 入 少 量 的 ＤＭＥＭ 液，把 组 织块接种到培养皿中，用移液枪摊 均 匀，培 养 ６～１０ ｈ。待组织 块 贴 壁 后，加 入 ２～３ ｍＬ ＤＭＥＭ 培 养 液 ，以 后 每 ２ｄ 换 液 １ 次 ，９０％ 汇 合 时 传 代 。 １．２．２ 细胞传代培 养 方 法 原 代 培 养 的 细 胞 生 长 到９０％～１００％ 汇 合 时，吸 去 ＤＭＥＭ 培 养 液，加 入 ＤＰＢＳ 洗 涤３ 遍 ，然 后 加 入 消 化 液 （０．２５％ ｔｒｙｐｓｉｎ＋ ０．０２％ ＥＤＴＡ），放入３７℃培养箱中消化３～５ｍｉｎ， 倒 置 显 微 镜 下 观 察 细 胞 ，贴 壁 的 细 胞 逐 渐 收 缩 变 圆 ， 约 ８０％ 细 胞 开 始 脱 壁 时，迅 速 加 入 １０％ ＦＢＳ ＋ ＤＭＥＭ 培养液终止消化，并用移液枪反复吹打使细 胞脱壁，将消化后的 细 胞 混 合 液 转 移 到 灭 菌 离 心 管 中，轻轻吹打 混 匀，以 １ ５００ｒ／ｍｉｎ 离 心 ５ ｍｉｎ。 去 除上清液，加 入 ＤＰＢＳ 再 离 心 １ 遍，去 除 上 清，加 入 ＤＭＥＭ 液混匀细 胞，将 混 匀 后 的 细 胞 悬 液 按 １∶２ 比例接种到 细 胞 培 养 皿 中，以 ３７℃、５％ＣＯ２、１００％ 湿度培养，每隔 ２～３ｄ换液 １ 次，待 细 胞 长 至 ９０％ ～１００％ 汇 合 ，进 行 传 代 、冻 存 。 １．２．３ 冷 冻 保 存 及 复 苏 当 细 胞 生 长 到 ８０％ ～ ９０％ 汇 合 时 ，即 细 胞 处 于 对 数 生 长 期 ，取 生 长 情 况 正 常 的 陆 川 猪 耳 部 成 纤 维 细 胞 ，吸 去 培 养 液 ，加 入 适 量 经３７℃ 预 温 的 ０．２５％ 胰 蛋 白 酶 溶 液，消 化 分 散 细 胞，收集细胞方 法 同 传 代 一 样。 将 收 集 的 细 胞 用 细 胞冻存液重悬成 密 度 约 为 ５×１０６ 个／ｍＬ 的 细 胞 悬 液，装 入 标 记 好 的 细 胞 冻 存 管 中。 将 冻 存 管 放 在 ４℃下平衡３０ｍｉｎ 后 置 于 －８０℃ 超 低 温 冰 箱 过 夜，
的前提，２００１年 Ｂｏｎｄｉｏｌ等［６］用 ４ 月 龄 公 猪 的 耳 部 成纤维细胞克隆得 到 ２ 只 活 仔 猪，说 明 用 耳 部 成 纤 维细 胞 做 核 移 植 供 体 细 胞 是 可 行 的。陆 川 猪 于 １９７３年被确定为全国八大地方 良 种 猪 之 一，是 国 家 重点保护优良品 种。 其 主 要 优 点 为 皮 薄 肉 嫩、肉 质 味道好；适 应 性 强，耐 粗 饲、容 易 饲 养、早 熟 易 肥；母 猪 繁 殖 力 高 ，平 均 窝 产 仔 猪 １２ 头 以 上 ，而 且 母 性 好 ； 遗传力稳定，杂 交 优 势 明 显。 本 研 究 选 择 广 西 地 方 优良品种陆川猪为 研 究 对 象，对 地 方 优 良 品 种 的 育 种、保种研究和 实 际 应 用 具 有 特 殊 的 意 义。 目 前 为 止，国内还没有陆川 猪 耳 部 成 纤 维 细 胞 体 外 培 养 的 相 关 报 道 ，为 此 ，本 研 究 以 陆 川 猪 耳 部 组 织 作 为 材 料 进行体外分离培 养，并 对 其 细 胞 类 型 进 行 鉴 定。 旨 在建立陆川猪耳部 成 纤 维 细 胞 的 体 外 培 养 体 系，为 体 细 胞 核 移 植 、转 基 因 技 术 的 研 究 提 供 参 考 。
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｉｎ ｏｒｄｅｒ ｔｏ ｅｓｔａｂｌｉｓｈ ａｎ ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ ａｎｄ ｃｕｌｔｕｒｅ ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ Ｌｕ－ｃｈｕａｎ ｐｉｇ ｅａｒ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ ｃｅｌｌｓ，Ｌｕ－ｃｈｕａｎ ｐｉｇ ｅａｒ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ ｃｅｌｌ ｗａｓ ｉｓｏｌａｔｅｄ ａｎｄ ｃｕｌｔｕｒｅｄ ｂｙ ｔｉｓｓｕｅ－ｐｉｅｃｅ ｍｅｔｈｏｄｓ．Ｕｓｉｎｇ ０．２５％ ｔｒｙｐｓｉｎ ＋ ０．０２％ ＥＤＴＡ ａｓ ｄｉｇｅｓｔｅｄ ｍｅｄｉｕｍ ａｎｄ ＤＭＥＭ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ １０％ ＦＢＳ ａｓ ｃｕｌｔｕｒｅ ｍｅｄｉｕｍ ｆｏｒ ｓｕｂｃｕｌｔｕｒｅ，ｉｔ ｗａｓ ｃｏｎｃｌｕｄｅｄ ｔｈａｔ ｃｕｌｔｕｒｅ ｓｙｓｔｅｍ ｗａｓ ｇｏｏｄ ｅｎｏｕｇｈ ｆｏｒ ｌｕ－ｃｈｕａｎ ｐｉｇ ｅａｒ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ ｃｅｌｌｓ．Ｔｈｅ ｐｕｒｅｄ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ ｃｅｌｌｓ ｃｏｕｌｄ ｂｅ ｏｂｔａｉｎｅｄ ａｆｔｅｒ ｐａｓｓ－ ｉｎｇ ３ｓｕｂｃｕｌｔｕｒｅｓ．Ｔｈｅ ｃｕｌｔｕｒｅｄ ｃｅｌｌｓ ｗｅｒｅ ｔｙｐｉｃａｌ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ，ｗｈｉｃｈ ｇｒｏｏｖｅｄ ａｓ ｉｒｒｅｇｕｌａｒ ｔｒｉａｎｇｌｅ ｏｒ ｓｈｕｔ－ ｔｌｅ，ａｐｐｅａｒｉｎｇ ａｓ ｒａｄｉｏａｃｔｉｖｅ ｂｌａｚｅ ａｎｄ ｈｅｌｉｘ ｉｎ ｓｈａｐｅ．Ｔｈｅ ｃｅｌｌ ｔｙｐｅ ｗａｓ ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ ｂｙ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｉｍｍｕｎｅｏｃｙｔｏｃｈｅｍｉｓ－ ｔｒｙ （ＩＣＣ）ａｎｄ ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔ ｉｎｄｉｃａｔｅｄ ｔｈａｔ ｉｓｏｌａｔｅｄ ｃｅｌｌｓ ｆｒｏｍ Ｌｕ－ｃｈｕａｎ ｅａｒ ｔｉｓｓｕｅｓ ｗｅｒｅ Ｌｕ－ｃｈｕａｎ ｅａｒ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ ｃｅｌｌｓ．Ｉｎ ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ，Ｌｕ－ｃｈｕａｎ ｐｉｇ ｅａｒ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ ｃｅｌｌ ｃｏｕｌｄ ｂｅ ｉｓｏｌａｔｅｄ ａｎｄ ｃｕｌｔｕｒｅｄ ｂｙ ｔｉｓｓｕｅ－ｐｉｅｃｅ ｍｅｔｈｏｄｓ． Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：Ｌｕ－ｃｈｕａｎ ｐｉｇ；ｅａｒ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ ｃｅｌｌｓ；ｔｉｓｓｕｅ ｐｉｅｃｅ ｃｕｌｔｕｒｅ；ｉｎｄｉｒｅｃｔ ｉｍｍｕｎｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ