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以下培养针对于小鼠的R1胚胎干细胞系，其它胚胎干细胞的培养可以参考。
不过人的胚胎干细胞培养不可以采用下面的protocol，需要用专用的protocol和培养基。
一般培养－－维持ES细胞处于未分化状态ES细胞培养用含有LIF（白血病抑制因子）和Feed细胞的培养基（高糖）来阻止细胞的分化。
为细胞提供包被有0.1％明胶的平板作为粘附细胞的基质。
建议每2－3天从达到80％－90％融合的平板按1：8的比率传代细胞一次，细胞传代以后，在将细胞接种在0.1％明胶包被的培养皿之前，通过预先将细胞接种在没有经过包被的组织培养板2个小时，使分化细胞粘附，从而将分化和未分化细胞分开。
将细胞全程置于37℃，5％CO2，100％湿度条件下培养。
如果在Feed细胞，那么就需要采用MMC进行处理，抑制Feed细胞增殖，但仍然能保持其分泌LIF因子的活性。
下文中暂不提及Feed细胞。
Feed细胞可以来源于STO细胞或原代胚胎成纤维细胞。
培养基ES:配制一20×不含DMEM，HS，LIF的溶液（该溶液也能用于EB培养基－－见下文）。
分装在50ml 离心管中，（稀释为2×，每管42ml），贮存在-20℃。
通过将21ml该溶液，HS和LIF加入450ml DMEM中制备培养基，0.22 μm滤膜过滤。
贮存于4℃，时间不要超过2周。
贮存液DMEM（高糖）马血清（HS）L-谷氨酰胺（200mM）MEM NEAA（10mM）HEPES（1M）β-巯基乙醇（55Mm）PESTLIF复苏细胞细胞被冻存在10％二甲基亚砜（DMSO）中防止结晶的形成，结晶的形成会损害细胞。
然而，二甲基亚砜对细胞有毒性，快速的进行细胞复苏是很重要的。
步骤：1．从液氮中取出一管细胞；2．将冻存管置于37℃水浴中2分钟（或放到管内溶液恰好完全溶解）；3．将细胞转移到一15ml Falcon管中；4．加入5ml ES培养基（用培养基冲洗冻存管）；5．离心3分钟；6．弃上清，用2ml ES培养基重悬细胞，至少吹打10次；7．接种在明胶包被（见下文）的6孔或6cm组织培养皿；8．孵育。
《小鼠新型胚胎干细胞系的建立》篇一一、引言随着生物医学技术的不断发展，干细胞研究在生命科学领域中扮演着越来越重要的角色。
其中，胚胎干细胞（ESC）作为一种具有自我更新能力和多向分化潜能的细胞类型，已成为研究各种生物过程和疾病模型的热门研究对象。
本文旨在探讨小鼠新型胚胎干细胞系的建立过程及其在科研领域的应用价值。
二、材料与方法1. 实验材料本实验所需材料包括小鼠胚胎、培养基、生长因子等。
所有材料均需经过严格的质量控制，确保实验结果的可靠性。
2. 方法（1）胚胎获取与处理：从特定品系的小鼠中获取早期胚胎，并进行必要的处理，如去透明带等。
（2）干细胞培养：将处理后的胚胎置于特定培养基中，添加生长因子等必要成分，进行干细胞培养。
（3）干细胞系建立：通过细胞克隆、筛选等方法，建立新型胚胎干细胞系。
（4）细胞鉴定与表型分析：通过分子生物学技术对新型胚胎干细胞系进行鉴定，包括基因型、染色体稳定性等方面的分析。
三、实验结果1. 胚胎处理与干细胞培养结果经过适当的处理后，胚胎在特定培养基中成功附着并开始发育。
在适宜的条件下，干细胞得以增殖并形成克隆。
2. 新型胚胎干细胞系的建立通过细胞克隆、筛选等步骤，成功建立了新型胚胎干细胞系。
该细胞系具有自我更新能力和多向分化潜能，为后续研究提供了可靠的细胞来源。
3. 细胞鉴定与表型分析结果通过分子生物学技术对新型胚胎干细胞系进行鉴定，结果显示该细胞系基因型稳定，染色体无异常，具有较高的纯度。
此外，该细胞系在体外分化实验中表现出良好的分化潜能。
四、讨论1. 小鼠新型胚胎干细胞系建立的意义建立小鼠新型胚胎干细胞系对于研究生物学、医学等领域具有重要意义。
首先，该细胞系可用于研究小鼠胚胎发育过程及机制，为人类胚胎发育研究提供参考。
其次，该细胞系可分化为多种细胞类型，为疾病模型研究、药物筛选等领域提供可靠的细胞来源。
此外，该细胞系还可用于基因编辑、基因治疗等方面的研究。
2. 小鼠新型胚胎干细胞系的优点与挑战（1）优点：新型胚胎干细胞系具有自我更新能力强、分化潜能高、基因型稳定等特点，为科研工作者提供了可靠的细胞来源。
2020届高三生物一轮复习测试第十单元现代生物科技专题本试卷分第Ⅰ卷和第Ⅱ卷两部分，共100分，考试时间150分钟。
第Ⅰ卷一、单选题(共20小题,每小题3.0分,共60分)1.肉毒杆菌会产生肉毒杆菌毒素，只要有0.01 mg的肉毒杆菌毒素就可使人致死。
肉毒杆菌毒素分子的作用机理是()A．抑制呼吸中枢，使人因缺氧而窒息而死B．阻断血红蛋白与氧气结合，使人因缺氧引起肌肉麻痹C．阻滞神经末梢释放乙酰胆碱从而引起肌肉麻痹D．抑制线粒体进行有氧呼吸，心肌细胞无力收缩，阻碍血液循环2.下面是胚胎干细胞分离途径示意图。
相关说法正确的是()A．图中A所示细胞将来能够发育成胎膜和胎盘B．胚胎干细胞的体积和细胞核都较小C．在体外培养情况下，胚胎干细胞可以只增殖而不发生分化D．利用胚胎干细胞培育的人造器官正在大规模应用3.SOD是一种抗氧化酶，它能将O2－转化成H2O2，增强植物的抗逆性。
下图为培育农作物新品种的一种方式，与此有关的叙述中正确的是()A．①过程常用的工具酶有限制性核酸内切酶、DNA连接酶和载体B．②、③分别表示脱分化、再分化，培养基中需添加植物激素C． SOD可能为O2－转化成H2O2的过程提供能量D．培育过程中需根据基因型的不同进行人工选择4.目前科学家已成功培养出全球首例遗传性稳定且能自然繁殖的四倍体鱼类种群，这在脊椎动物中是首例。
虽然四倍体鱼生长快、肉质好、抗病力强，但研究人员并不直接把它投入生产，而是将它与二倍体鱼杂交的后代投入生产。
你认为这样做主要的意义是()A．防止基因污染，保护物种多样性B．保护自身知识产权C．避免出现新物种，维护生态平衡D．充分利用杂种优势5.干扰素是治疗癌症的重要药物，它必须从血液中提取，每升人血中只能提取0.5 μg，所以价格昂贵。
美国加利福尼亚的某生物制品公司用如下方法生产干扰素。
如图所示：从上述方式中可以看出该公司生产干扰素运用的方法是()A．个体间的杂交B．基因工程C．细胞融合D．器官移植6.抗菌肽对治疗癌症有一定作用，下图表示抗菌肽合成过程。
浅谈昆明种小鼠胚胎干细胞的培养及鉴定摘要：目的从昆明种小鼠的早期胚胎中获取并培养胚胎干细胞。
方法收集小鼠 d的囊胚培养，用小鼠胚胎成纤维细胞作为饲养层，形成的ES细胞样集落，72 h后分离隆起生长的内细胞团并继续培养，观察集落的生长状态，并通过碱性磷酸酶染色进行鉴定。
结果 ES细胞有其典型的形态学特征：集落呈鸟巢状，边缘清楚，表面平滑，结构致密，隆起生长，细胞之间界限不清楚；单个细胞体积小、核大；对ES 细胞碱性磷酸酶进行检测，在AKP底物作用下，未分化的ES 细胞显微镜下为棕褐色，分化的不着色。
结论昆明种小鼠囊胚在小鼠胚胎饲养层细胞上可以发育为胚胎干细胞。
关键词：小鼠胚胎干细胞 ES细胞系胚胎干细胞(Embryonic Stem Cell， ES)是一种多能的未分化细胞，是从早期胚胎的内细胞团(inner cell mass，ICM)中分离出的多能干细胞。
由于它可以参与胚胎发育，将所携带的基因导入受体，生成嵌合体，因此ES细胞已成为制作转基因动物的主要途径之一。
也可以利用ES细胞模拟早期胚胎细胞的发育过程，分析参与早期发育中细胞分化与决定的因素，研究基因的调控，建立疾病的动物模型，利用ES细胞还可以为临床提供器官移植、修复器官或组织的原材料［1，2］。
最近，基因打靶及基因捕获又成为应用胚胎干细胞进行研究的热点［3］。
小鼠的ES细胞分离培养最早是在1981年由英国Evans和Kaufman［4］完成的，以后又有陆续建立了数百个小鼠ES细胞系［5-7］。
但这些小鼠细胞系多来源于129，C57BL/6J等品系，而国内应用最广泛的昆明种小鼠ES的建系率很低。
本实验尝试建立昆明种ES细胞系，为进一步的研究工作提供条件。
1 材料和方法动物来源来自辽宁医学院实验动物中心，昆明种小鼠，6～8周龄，体重25～35 g。
试剂丝裂霉素C（Mitomycin C，Sigma，M-4287），MEM培养基（GIBCO公司），胎牛血清（GIBCO公司），白血病抑制因子（LIF，CHEMICON公司），孕马血清绒毛膜促性腺激素（PMSG，杭州动物药品厂），人绒毛膜促性腺激素（HCG，杭州动物药品厂），碱性磷酸酶（AKP，南京建成生物制品研究所）细胞培养饲养层细胞的制备无菌条件下取孕13～16 d的小鼠胚胎，去头，去尾，去胸腹腔脏器及四肢，用眼科剪剪成乳糜状，胰酶消化，机械吹打后种植于25 mL玻璃培养瓶中，加入含10%小牛血清(杭州四季青公司)、2×10-4 mol/L 谷氨酰胺、10 μg/mLLIF、 50 U/mL青霉素的MEM培养基(Gibco公司)。
小鼠胚胎干细胞培养实验步骤小鼠胚胎干细胞（Embryonic Stem Cells，ESCs）是一类在小鼠早期胚胎内分化产生的多能干细胞。
培养和研究ESC可以为了解细胞发育和分化提供重要的实验材料。
下面将为您介绍小鼠胚胎干细胞培养的一般步骤。
一、准备实验所需材料和器械：1.小鼠胚胎干细胞系（ES细胞系）。
2.ESC培养基：一般使用含有LIF（鼠胚性干细胞生长因子）的培养基，如DMEM/F12或DMEM培养基，添加血清、LIF等。
3.ESC传代培养基：与ESC培养基相同，但不含LIF。
4.ESC学习培养基：免LIF和血清的无血清培养基，可以用于学习ES细胞的分化能力。
5. ESC传递板（T25细胞培养板、10 cm细胞培养板等）。
6.培养皿：培养皿的选择可以根据不同的实验目的选用，如离体实验可以选择培养皿或培养碟等。
7.显微镜：用于观察和鉴定细胞形态。
8.细胞培养箱：用于多肽瓶、培养皿等细胞培养。
9.无菌注射器、移液器、离心管等常见实验器材，以及媒液和试剂。
二、实验步骤：1.将小鼠胚胎干细胞系解冻至细胞存储液解冻的方法，迅速转移到预先加热培养皿中。
添加完整的ESC培养基，将细胞孵育在37℃、5%CO2的培养箱中。
2.每两天更换一次ESC培养基，观察细胞的形态和生长情况。
当细胞接近80%的密度时，可以进行传代。
3.小鼠胚胎干细胞的传代通常采用机械法和酶解法两种方法。
机械法是直接使用离心管头吸吸细胞，然后用超声波吹散细胞，最后转入新的培养皿中。
酶解法则是先用胰酶等酶溶解细胞，形成单细胞悬液，然后接种入新的培养皿中。
4.传代完成后，继续在37℃、5%CO2的培养箱中培养细胞，并定期更换培养基。
5.ESC的分化实验通常采用去除LIF和血清的无血清培养基。
将小鼠胚胎干细胞移到含有学习培养基的培养皿中，观察和记录细胞的分化情况。
6.对于特定的实验要求，如体外器官培养、离体实验等，可以将小鼠胚胎干细胞移至特定的培养皿或装置中，进行相关实验。
人教生物学选择性必修3单元检测卷（二）细胞工程(本试卷满分：100分)一、选择题(本题共16小题，共40分。
第1～12小题，每小题2分；第13～16小题，每小题4分。
每小题给出的四个选项中，只有一个选项是最符合题目要求的。
) 1．细胞工程中，选择合适的生物材料是成功的关键。
下列选择不合理的是()A．选择幼龄动物的组织进行细胞培养，有利于获得大量细胞B．选择胚胎细胞作为核供体进行核移植，可提高克隆动物的成功率C．选择一定大小的植物茎尖进行组织培养，可获得脱毒苗D．选择植物的愈伤组织进行诱变处理，一定可获得优质的突变体解析：选D幼龄动物的组织细胞的分裂能力强，因此选择幼龄动物的组织进行细胞培养，有利于获得大量细胞；因为胚胎细胞的全能性较高，所以选择胚胎细胞作为核供体进行核移植，可提高克隆动物的成功率；选择一定大小的植物茎尖进行组织培养，可获得脱毒苗，原因是茎尖等分生组织中几乎不含病毒；由于基因突变具有多害少利性，因此选择植物的愈伤组织进行诱变处理，不一定可获得优质的突变体。
2．有关植物细胞工程应用的叙述，错误的是()A．利用组织培养技术培养脱毒苗，获得具有抗病毒的新品种B．利用组织培养技术获得人工种子，能保持亲本的优良性状C．利用细胞培养技术获得紫草宁，实现了细胞产物的工厂化生产D．利用体细胞杂交技术获得“白菜甘蓝”，克服了生物远缘杂交不亲和的障碍解析：选A因为顶端分生区附近(如茎尖)的病毒极少，甚至没有病毒，所以将茎尖进行离体培养能获得脱毒植株，但不能获得抗病毒植株，A错误；经细胞培养产生的胚状体可直接制作人工种子，由于该技术属于无性生殖，因此能保持亲本的优良性状，B正确；组织培养技术除了在农业生产上的应用外，还可广泛应用于另一个重要的领域，即细胞产物的工厂化生产，如获得紫草宁，C正确；白菜和甘蓝属于不同物种，它们之间存在生殖隔离，因此利用植物体细胞杂交技术培育的“白菜甘蓝”，能够克服不同种生物远缘杂交不亲和的障碍，D正确。
第3练细胞工程A级·大概念对点练概念点1植物细胞工程及应用1．[2023·广东卷]人参皂苷是人参的主要活性成分。
科研人员分别诱导人参根与胡萝卜根产生愈伤组织并进行细胞融合，以提高人参皂苷的产率。
下列叙述错误的是() A．细胞融合前应去除细胞壁B．高Ca2＋—高pH溶液可促进细胞融合C．融合的细胞即为杂交细胞D．杂交细胞可能具有生长快速的优势2．生物兴趣小组成员以西瓜5天龄幼苗子叶(子叶尚未完全展开且颜色为淡绿色)为外植体进行相关研究，得到如图所示实验结果。
相关叙述错误的是()A．实验开始前应对幼苗子叶和MS培养基进行灭菌处理B．与愈伤组织细胞相比，胚状体细胞已经分化C．暗处理时间长短对细胞脱分化率影响不大，但影响再分化率D．结果表明西瓜子叶诱导形成胚状体的最适暗处理时间是1～2周3．[2024·临沂模拟]甲乙两种远缘植物体细胞融合会导致一方的染色体被排出，若甲细胞的染色体在融合前断裂，形成的染色体片段在细胞融合后可能不会被全部排出，未排出的染色体片段可以整合到另一个细胞的染色体上而留存在杂种细胞中。
依据该原理，将抗黑腐病的黑芥与不抗黑腐病的甘蓝型油菜进行体细胞杂交获得了抗黑腐病的甘蓝型油菜新品种，过程如图所示。
下列说法错误的是()A．④过程用到了植物组织培养技术B．抗黑腐病的甘蓝型油菜染色体上整合了黑芥的染色体片段C．②紫外线照射强度不同会导致黑芥染色体断裂程度不同D．可利用聚乙二醇融合法或灭活病毒诱导法诱导两种植物原生质体融合概念点2动物细胞培养与细胞融合技术4．细胞融合不仅在自然条件下常见，在现代生物技术中也被经常应用。
右图为细胞融合的简略过程，下列说法正确的是()A．若细胞d是杂交瘤细胞，则在选择性培养基中筛选后即可大规模培养生产单抗B．若细胞a、b分别取自优良奶牛，则采集的卵母细胞和精子可直接体外受精C．若细胞a、b分别代表白菜、甘蓝细胞，则完成融合的标志为核的融合D．细胞融合过程都涉及膜的流动性，常用聚乙二醇融合法、电融合法等进行处理5．科学家通过转入四种基因，可使体细胞形成诱导多能干细胞(iPS细胞)，并将其注射到无法发育到成体阶段的四倍体囊胚中，最终获得克隆鼠，经鉴定证实克隆鼠是由iPS细胞发育而来并可繁殖后代，实验流程如图所示。
小鼠胚胎干细胞（mES细胞）、小鼠iPS细胞培养ProtocolMEF细胞铺制：1. 在T25培养瓶中加入0.2%明胶，摇匀后覆盖底面即可，于37℃细胞培养箱至少放置15min以上。
2. 吸除0.2%明胶，加入事先水浴加热至37℃的MEF完全培养液。
一般地，一个T25培养瓶中加入5ml MEF完全培养液。
3. 按实验需要：小鼠胚胎干细胞使用KM-r P3 MEF或CF-1 P3 MEF；小鼠iPS使用ICR-rP3 MEF，复苏MEF细胞若干支。
将冻存管从液氮中取出，置于37℃水浴中使之迅速融解，取出后拿到超净台内用75%酒精擦拭冻存管旋口处及外壁，防止污染。
4. 将冻存管内细胞悬液转移至含2 ml MEF完全培养液的15 ml离心管内，以1000 rpm，离心5 min，离心后将上清液吸除，另加入新鲜的MEF完全培养液1 ml，重悬后按照一个T25培养瓶铺1 × 106的MEF细胞，平均加入到T25培养瓶中，轻轻摇匀后至于37℃细胞培养箱。
24 h以后可以传入小鼠胚胎干细胞或小鼠iPS细胞。
5. 复苏或传代小鼠胚胎干细胞或小鼠iPS细胞前，将T25培养瓶中的MEF完全培养液吸除，加入2 ml小鼠胚胎干细胞、小鼠iPS细胞完全培养液轻轻冲洗一遍后吸除，加入新鲜的小鼠胚胎干细胞、小鼠iPS细胞完全培养液待用。
复苏：1. 将小鼠胚胎干细胞、小鼠iPS细胞冻存管从液氮中取出，置于37℃水浴中是之迅速融解，取出后拿到超净台内用75%酒精擦拭冻存管旋口处及外壁，防止污染。
2. 将冻存管内细胞悬液转移至含3-4 ml小鼠胚胎干细胞，小鼠iPS细胞完全培养液的15ml离心管内，以1000 rpm，离心5 min。
3. 离心后将上清液吸除，另加入新鲜的小鼠胚胎干细胞、小鼠iPS细胞完全培养液2 ml，吹打悬浮。
4. 重复吹打，制成单细胞悬液，尽量避免起泡。
5. 转移至1个已经铺好MEF细胞的T25培养瓶中培养。
小鼠胚胎干细胞培养实验步骤以下是小鼠胚胎干细胞的培养实验步骤：1.准备培养基和细胞培养器材：-将培养基预热至37摄氏度。
-准备含有培养基的无菌试管、离心管和细胞培养板。
-洗手并戴上合适的培养操作手套。
2.预处理培养皿：-用无菌PBS（磷酸盐缓冲液）将细胞培养板彻底洗涤，去除残留的培养基和细胞残留物。
-用0.1%胰蛋白酶溶液或0.25%胰蛋白酶-EDTA溶液将细胞培养板上的细胞进行脱落。
-将细胞均匀地分布在预处理的培养皿中，使其形成单层细胞。
3.检查细胞数目和品质：-用显微镜检查细胞的形态和活力。
-用细胞计数计算细胞的数目。
-计算细胞的分裂倍增时间。
4.细胞传代：-按照需要的细胞密度将细胞从一个培养皿转移到另一个培养皿。
-用0.05%胰蛋白酶-EDTA将细胞从培养皿上脱落。
-投入适当比例的培养基到新的培养皿中，使其形成单层细胞。
5.制备小鼠胚胎纤维母细胞：-从小鼠胚胎体内收集纤维母细胞。
- 将纤维母细胞转移到含有DMEM（Dulbecco's Modified Eagle Medium）和10%胎牛血清的细胞培养皿中。
-培养纤维母细胞在37摄氏度、5%二氧化碳的培养箱中直至细胞接触起离皿表面。
6.制备和维持小鼠胚胎干细胞：-转接分裂期的小鼠胚胎干细胞到新的培养皿中。
-用无菌吸管或离心管的尖端轻轻挑取细胞克隆。
-将细胞克隆转移到含有mESC培养基（如DMEM、15%胎牛血清、2mML-谷氨酰胺和1×LIF（小鼠白细胞介素-6）的细胞培养板中。
-在体外细胞培养中维持小鼠胚胎干细胞的自我更新和增殖。
7.细胞培养的常规维护：-定期更换新鲜的培养基。
-检查细胞的形态和活力。
-定期传代细胞，以保持其细胞数目和活力。
-控制培养基和细胞的污染。
以上是小鼠胚胎干细胞培养的一般步骤，实验过程可能因研究目的和实验室的要求而有所不同。
为了保证实验的准确性和可重复性，建议在实验过程中随时记录和保留实验数据，并使用正确的实验操作和生物安全规范。
小鼠胚胎干细胞培养实验步骤一般培养-保持胚胎干细胞处于未分化状态培养基细胞复苏冻存细胞明胶包被细胞传代体外分化培养基包被有多聚鸟氨酸/纤维结合蛋白的培养板（使用或不使用盖玻片）体外分化方法注：以下培养针对于小鼠的R1胚胎干细胞系，其它胚胎干细胞的培养可以参考。
不过人的胚胎干细胞培养不可以采用下面的protocol，需要用专用的protocol 和培养基。
一般培养--维持ES细胞处于未分化状态ES细胞培养用含有LIF（白血病抑制因子）和Feed细胞的培养基（高糖）来阻止细胞的分化。
为细胞提供包被有0.1％明胶的平板作为粘附细胞的基质。
建议每2－3天从达到80％－90％融合的平板按1：8的比率传代细胞一次，细胞传代以后，在将细胞接种在0.1％明胶包被的培养皿之前，通过预先将细胞接种在没有经过包被的组织培养板2个小时，使分化细胞粘附，从而将分化和未分化细胞分开。
将细胞全程置于37℃，5％CO2，100％湿度条件下培养。
如果在Feed 细胞，那么就需要采用MMC进行处理，抑制Feed细胞增殖，但仍然能保持其分泌LIF因子的活性。
下文中暂不提及Feed细胞。
Feed细胞可以来源于STO细胞或原代胚胎成纤维细胞。
培养基ES:配制一20×不含DMEM，HS，LIF的溶液（该溶液也能用于EB培养基--见下文）。
分装在50ml 离心管中，（稀释为2×，每管42ml），贮存在-20℃。
通过将21ml 该溶液，HS和LIF加入450ml DMEM中制备培养基，0.22 μm滤膜过滤。
贮存于4℃，时间不要超过2周。
贮存液DMEM(高糖)马血清（HS）L-谷氨酰胺（200mM）MEM NEAA（10mM）HEPES（1M）β-巯基乙醇（55Mm）PESTLIF复苏细胞细胞被冻存在10％二甲基亚砜（DMSO）中防止结晶的形成，结晶的形成会损害细胞。
然而，二甲基亚砜对细胞有毒性，快速的进行细胞复苏是很重要的。
步骤：1．从液氮中取出一管细胞；2．将冻存管置于37℃水浴中2分钟（或放到管内溶液恰好完全溶解）；3．将细胞转移到一15ml Falcon管中；4．加入5ml ES培养基（用培养基冲洗冻存管）；5．离心3分钟；6．弃上清，用2ml ES培养基重悬细胞，至少吹打10次；7．接种在明胶包被（见下文）的6孔或6cm组织培养皿；8．孵育。
冻存细胞冻存液90％HS和10％DMSO步骤：1．1×PBS洗细胞并留少许PBS在培养皿内；2．用细胞刮刀收集细胞；3．将细胞转入15ml 离心管管内并离心3分钟；4．弃去上清并将细胞重悬于冷的冻存液中（10 cm的培养皿用2ml，15cm的培养皿用6－7ml。
）5．分装于冻存管内，每管1ml；6．置－80℃过夜，第二天移入液氮。
Geltin（明胶）包被准备500ml 0.1％geltin溶液1．将0.5 g明胶溶解在500ml无钙镁的PBS中（50－65℃水浴15～30分钟）。
2．最好在溶液没有冷却的情况下通过0.22 μm滤膜过滤，贮存在4℃。
包被培养板或培养皿1．加入足量的明胶溶液覆盖培养平面（15 cm培养皿加2ml，10 cm培养皿加0.5～1 ml，溶液的量并不重要，只要能完全覆盖培养表面就行了。
）；2．置室温30分钟；3．去除明胶溶液，将培养板贮存在包装袋中室温放置，最好将板子平放或倒扣，以免明胶污染盖子和流出培养板。
细胞传代建议每2天传代细胞一次，过度生长的细胞会降低细胞的自然分化率，我们建立了一种纯化方法来去除分化细胞，在将细胞接种在明胶包被的培养板上之前，通过将分化细胞黏附在没有包被的组织培养板上去除分化细胞。
纯化步骤包含在下面的方法中。
1．去除培养液；2．无钙镁PBS（Gibco）洗涤；3．加入胰酶EDTA（Gibco）。
37℃孵育5分钟。
4．加入ES培养基使胰酶失活；5．将细胞转入15 ml离心管中离心3min；6．去除上清，将细胞重悬于2 ml ES培养基，至少吹打10－20次。
如果加入培养基的量较少会比较容易将细胞团弄散分开。
ES细胞有聚集成团的倾向，传代过程中仔细将细胞弄散分开很重要。
这样可能会减少细胞的自然分化。
7．将细胞接种在没有包被的组织培养皿中（使用和一开始同样规格的培养皿）放入温箱2小时（分化细胞在该时间内将黏附，而ES细胞仍将保持悬浮）；8．将含有细胞的培养基转入geltin包被的组织培养皿。
吹打以确保细胞被分散开（前面已经提到--ES细胞有聚集成团的倾向）9．建议按1：4－1：10的比率传代 (ATCC)保持细胞的传代比率很重要，以我们的经验，1：8的比率是好的，可以使细胞的自然分化降到最低。
当你使用不同规格的培养板进行细胞传代可以使用表1来计算传代比率。
体外分化胚胎干细胞在体内外可以分化为各种类型的细胞。
我们的体外分化方法有利于神经前体细胞通过在最少量的培养基内选择（第3步），在有bFGF存在的情况下扩增（第4步）并最终分化在第5步。
细胞全程培养在37℃，5％CO2，100％湿度条件下。
一般体外诱导向神经细胞方向分化，也可以采用低浓度的RA进行诱导。
时间线（总时间为27～34天）第2步；4＋1天第3步；4－10天第4步；4天第5步；10－15天体外向心肌细胞方向分化胚胎干细胞在体外去除LIF情况下会自然向心肌细胞方向分化，小鼠的R1系一般在第7-8天自然出现搏动的心肌细胞，与胚胎发育时间线是完全一致的。
培养基EB配制一20×不含DMEM，FBS，LIF的溶液（该溶液也能用于ES培养基--见前述）。
分装在50ml 离心管中，（稀释为2×，每管42ml），贮存在-20℃。
将21ml该溶液和50ml FBS加入450mlDMEM中制备培养基，0.2μm滤膜过滤。
贮存于4℃。
贮存液DMEM(高糖)胎牛血清L-谷氨酰胺（200mM）MEM NEAA（10mM）HEPES（1M）β-巯基乙醇（55Mm）PEST（P104U/mlS104μg/mlITSFn and N3（分化培养基）：配制一20×不含DMEM/F12的溶液。
分装在15ml 离心管中，（稀释为1×，ITSFn 7.05ml，N3 12.55ml），0.2μm滤膜过滤，贮存在-20℃。
将该溶液加入DMEM/F12中制备培养基，贮存于4℃。
贮存液DMEM(高糖)转铁蛋白50mg/ml胰岛素5mg/ml亚硒酸钠300μM黄体酮（20μM）腐胺（100μM）PEST（P104U/ml S104μg/ml）层粘连蛋白100μg/ml纤维连接蛋白250μg/ml碱性rhFGF, 10μg/ml*在第4步将bFGF加入N3培养基使终浓度为10ng/ml。
ITSFn and N3培养基贮存液的准备使用无菌的溶剂和稀释液，在分装之前要对溶液进行过滤，如果因为某些原因溶液在分装之前没有进行过滤，需要在管子上标明以便别人在使用时知道该溶液不能直接用于细胞培养。
贮存液溶剂，贮存液，稀释剂和储存转铁蛋白50mg/ml胰岛素5mg/ml亚硒酸钠300μM黄体酮（20μM）腐胺（100μM）PEST（P104U/ml S104μg/ml）层粘连蛋白（100μg/ml）纤维连接蛋白（250μg/ml ）碱性rhFGF, （10μg/ml）包被有多聚鸟氨酸/纤维结合蛋白的培养板（使用或不使用盖玻片）包被液的准备多聚-L-赖氨酸，15μg/ml把75ml多聚-L-赖氨酸和425ml 1×PBS混合。
贮存在4℃。
纤维结合蛋白，1μg/ml把0.5ml纤维结合蛋白和500m l 1×PBS混合。
包被过程：1．加入多聚-L-赖氨酸，至少2－3小时（过夜也行）2．吸出多聚-L-赖氨酸3．加入纤维结合蛋白，大约1－2小时4．吸出纤维结合蛋白，放置30分钟晾干5．贮存在4℃24孔板用200μl，6孔板用500μl。
震荡培养板确保溶液能够覆盖盖玻片或培养孔。
有时需要剧烈震荡培养板。
体外分化方法第1步：ES培养基在LIF存在的条件下维持细胞培养第2步：EB培养基使用细菌培养皿去除LIF后胚状体的形成需要4天。
1．分散纯化细胞（参见上面的细胞传代部分）2．纯化2小时后将细胞转入含有ES培养基的50ml Falcon管中，计数细胞取适量体积放入15ml管中离心3分钟。
3．用2mlEB培养基重悬细胞，吹打至少10次制成单细胞悬液4．一个15cm的细菌培养皿接种4～5×106个细胞（1个完全融合的组织培养皿通常足以接种4个同样规格的细菌培养皿）。
5．2天后更换培养基将胚状体转入锥形管中放置3～5分钟使细胞沉降。
弃去上清，将细胞重悬于新鲜培养基并接种在新的细菌培养皿中。
6．用EB培养基培养的第4天将细胞转入没有包被的组织培养皿中（这即是细胞的移植步骤）。
1个组织培养皿之中放置1个细菌培养皿，在进行第3步之前一天将胚状体黏附在同样规格的培养板上。
形成胚状体需要4天时间。
在EB培养基中再培养1天使胚状体粘附在组织培养皿的表面。
这一天被认为是第2步和第3步的分界。
第3步--ITSFn培养基在最少量培养基中选择神经前体细胞1．在胚状体接种在组织培养皿一天后将培养基换成ITSFn培养基2．并非所有胚状体在这一时期都已经发生粘附，因此在移除培养基时要小心谨慎以使大部分胚状体留在培养皿内。
3．保持细胞在ITSFn中培养大约10天，根据需要更换培养基--大约每隔一天。
观察细胞形态，神经样细胞大约出现在第4到第7天。
当神经样细胞能够被鉴别时，转入到第4步。
步骤的转换应该在神经前体细胞出现第一个清晰的标志几天以后，通常是在第3步的第6到第10天。
第4步－N3培养基＋bFGF通过将神经前体细胞培养在含有10ng/ml bFGF的培养基中进行扩增。
1.PBS洗涤，加入1-2ml 胰酶2．37℃孵育5分钟3．用4mlEB培养基终止胰酶活性，将细胞转入锥形管中放置3～5分钟移出细胞团，将上清移入一新的离心管离心。
4．将细胞重悬于含有bFGF的N3培养基。
5．将细胞接种在包被多聚-L-鸟氨酸/纤维连接蛋白的盖玻片上（最好将盖玻片放于24孔培养板或6孔培养板，6孔培养板中每孔放置5个盖玻片如果是塑料的放置4个，以使最大可能的获得样品数量）。
24孔板接种3.5×105/孔或6孔板1.7×106/孔。
6．2天后更换培养基第5步－N3培养基通过撤除bFGF使神经前体细胞分化1．细胞被接种在盖玻片上4天后将培养基换成不含bFGF的N3培养基2．根据需要换液（大约每隔一天）3．分化10～15天后固定细胞移除培养基PBS洗涤加入4%福尔马林室温放置30分钟PBS洗涤2次储存于PBS。
长期储存使用含0.01％叠氮化纳的PBS移植细胞的准备细胞在胚状体形成4天以后被移植（相应于体外分化过程中的第2步末细胞被转种到组织培养板）。
