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睾丸酮丛毛单胞菌耐药性分析及感染分布作者：钟帆来源：《中外医学研究》2018年第02期【摘要】目的：分析睾丸酮丛毛单胞菌的耐药性，为临床合理用药提供参考依据。
方法：回顾性分析2012年1月-2016年12月检出的86株睾丸酮丛毛单胞菌体外药敏试验结果，采用WHONET 5.6软件分析病原菌的分布和耐药情况。
结果：86株睾丸酮丛毛单胞菌，其中标本种类主要为脓液、无菌体液、分泌物和痰，集中于阑尾炎患者及有严重基础疾病患者的多部位感染，来源于外科、重症医学科和内科等科室。
对氨苄西林/舒巴坦、哌拉西林/他唑巴坦、头孢唑林、头孢他啶、头孢曲松、头孢吡肟、头孢替坦、亚胺培南、阿米卡星、庆大霉素、妥布霉素、左氧氟沙星、呋喃妥因敏感性较高，达67.4%～96.5%；对氨苄西林、复方新诺明敏感性较低，为40.7%～45.9%；对氨曲南、环丙沙星耐药率高，达70.9%～93.0%。
结论：睾丸酮丛毛单胞菌体外药敏结果目前处于较敏感的状态，为了减缓耐药菌株产生，临床医师应根据药敏试验结果及严重程度合理选择使用有效抗生素。
【关键词】睾丸酮丛毛单胞菌；药敏试验；耐药性doi：10.14033/ki.cfmr.2018.2.026 文献标识码 B 文章编号 1674-6805（2018）02-0052-02【Abstract】 Objective：To investigate the drug resistance of Comamonas Testosterone and guide the clinical treatment.Method：Retrospective analysis was made on the result of antibiotic susceptibility test of Comamonas Testosterone，from January 2012 to December 2016.The distribution and the drug resistance of Comamonas Testosterone by WHONET5.6 wereanalyzed.Result：86 Comamonas testosterone were isolated from various specimens.They were more sensitive to Ampicillin/Sulbactam，Piperacillin/Tazobactam，Cefazolin，Ceftazidime，Ceftriaxone，Cefepime，Cefotetan，Imipenem，Amikacin，Gentamicin，Tobramycin，Levofloxacin，Nitrofurantoin，about 67.4% to 96.5%，while they were less sensitive to Ampicillin，Trimethoprim/Sulfamethoxazole，about 40.7% to 45.9%.However，they were more resistant to Aztreonam，Ciprofloxacin，about 70.9% to 93.0%.Conclusion：Comamonas Testosterone strains are sensitive to various antibiotics，sensitive antibiotics shall be chosen to prevent from the emergence and spread of the drug resistant Comamonas Testosterone strains.【Key words】 Comamonas Testosterone； Antibiotic susceptibility test； The drug resistanceFirst-author’s address：Chengdu Xindu District People’s Hospital，Chengdu 610500，China睾丸酮丛毛单胞菌（C.testosteroni）隶属于假单胞菌属第Ⅲ群，是一种非发酵革兰阴性需氧杆菌，能利用睾酮、4-羟基苯甲酸酯（4HBA）、乙酸和乳酸作为唯一碳源[1]，引起菌血症、尿路感染及肺部感染等。
名词解释1.Cassette mutagenesis:盒式突变（cassette mutagenesis)，又称片段取代法（DNA fragment replacement)，利用目标基因序列中适当限制酶切位点，插入各种合适的突变DNA片段，用以取代目标基因中特定DNA片段2.DNA shuffling:DNA改组(DNA shuffling)将DNA拆散后重排, 一种模仿自然进化的体外DNA重组的新技术. 这种方法不仅可以对一种基因人为进化, 而且可以将具有结构同源性的几种基因进行重组, 共同进化出一种新的蛋白质. 在实验室中把DNA改组与有效的筛选方法结合起来可为多领域的应用快速进化基因.3. Yeast centromeric plasmid：酵母着丝粒载体，一种在YRp质粒结构基础上增加了一段来自酵母染色体着丝粒DNA片段的载体4.yeast artificial chromosome酵母人工染色体型载体，具有酵母染色体的主要构件包括酵母染色体自主复制序列(ARS)、着丝粒序列(CEN)和端粒序列(TEL)。
5. Inclusion Bodies6. Refolding：7.Interferon：干扰素是由多种细胞产生的具有广泛的抗病毒、抗肿瘤和免疫调节作用的可溶性糖蛋白8.Interleukin:白细胞介素(interleukin，IL),简称白介素:是由多种细胞分泌的一类具有免疫调节活性的细胞因子。
这类物质主要是由白细胞合成，且主要介导白细胞间的相互作用。
一类低相对分子量的蛋白多肽，通常由一个或几个基因表达合成9. Antisense technology：反义技术(antisense technology)是采用反义核酸分子(人工合成或生物合成的DNA或RNA，它们能与DNA、RNA互补)抑制、封闭或破坏与疾病发生相关的靶基因表达的一种手段10.siRNA :RNAi是一个依赖ATP的过程，在此过程中，dsRNA (外源或内生)首先被降解为具3’端有2～3nt突出、长21～23bp 的小分子双链RNA，这种RNA称为小干扰RNA(siRNA)。
1 JAK-STAT信号通路1) JAK与STAT蛋白JAK-STAT信号通路是近年来发现的一条由细胞因子刺激的信号转导通路，参与细胞的增殖、分化、凋亡以及免疫调节等许多重要的生物学过程。
与其它信号通路相比，这条信号通路的传递过程相对简单，它主要由三个成分组成，即酪氨酸激酶相关受体、酪氨酸激酶JAK和转录因子STAT。
(1) 酪氨酸激酶相关受体（tyrosine kinase associated receptor）许多细胞因子和生长因子通过JAK-STAT信号通路来传导信号，这包括白介素2?7（IL-2?7）、GM-CSF（粒细胞/巨噬细胞集落刺激因子）、GH（生长激素）、EGF（表皮生长因子）、PDGF （血小板衍生因子）以及IFN（干扰素）等等。
这些细胞因子和生长因子在细胞膜上有相应的受体。
这些受体的共同特点是受体本身不具有激酶活性，但胞内段具有酪氨酸激酶JAK的结合位点。
受体与配体结合后，通过与之相结合的JAK的活化，来磷酸化各种靶蛋白的酪氨酸残基以实现信号从胞外到胞内的转递。
(2) 酪氨酸激酶JAK（Janus kinase）很多酪氨酸激酶都是细胞膜受体，它们统称为酪氨酸激酶受体（receptor tyrosine kinase, RTK），而JAK却是一类非跨膜型的酪氨酸激酶。
JAK是英文Janus kinase的缩写，Janus在罗马神话中是掌管开始和终结的两面神。
之所以称为两面神激酶，是因为JAK既能磷酸化与其相结合的细胞因子受体，又能磷酸化多个含特定SH2结构域的信号分子。
JAK蛋白家族共包括4个成员：JAK1、JAK2、JAK3以及Tyk2，它们在结构上有7个JAK同源结构域（JAK homology domain, JH），其中JH1结构域为激酶区、JH2结构域是“假”激酶区、JH6和JH7是受体结合区域。
(3) 转录因子STAT（signal transducer and activator of transcription） STAT 被称为“信号转导子和转录激活子”。
JAK/TAT信号通路的最新研究进展一、JAK/STAT综述JAK (Janus kinase)属于蛋白酪氨酸激酶(PTK)中的一种，可以介导细胞因子与其受体结合后的信号蛋白分子级联活化反应。
细胞因子、生长因子等与其相应受体结合后激活JAK，进而激活信号转导子和转录激活子STAT。
JAK-STAT信号通路是与细胞生长、增殖和分化关系十分密切的一条细胞信号通路，近年来发展迅速。
本文就其组成结构，功能机制以及相关疾病和抑制剂做一个总结。
二、组成与结构此信号通路的传递过程相对简单，它主要由三个成分组成，即酪氨酸激酶相关受体、酪氨酸激酶JAK和转录因子STAT。
JAK( Janus kinase)是一种蛋白酪氨酸激酶，迄今为止。
共发现有4个家族成员，即JAK 1，JAK2，JAK3和JAK4，整个分子可分为7个结构域:(1) JH1，位于梭基末端，具有激酶催化功能。
其中有高度保守的八残基特征性序列FWF。
(2) JH2，与激酶功能相关，但不具有直接的催化活。
(3) JH3一JH7，功能不明确，可能与细胞因子受体的结合有关。
JAK 1，JAK2，Jyk2广泛分布于多种组织细胞，而JAK3仅见于白细胞中。
STATs是JAKS的直接底物，能将信号直接传递到核内，调节特定基因的表达。
共包括6个家族成员，即STAT1- 6。
STAT蛋白长约800个氨基酸，分子量89- 97 kDa，其编码基因在染色体上紧密连锁。
结构上STATs具有SH2和SH3功能区，SH2序列高度保守，位于第600- 700位氨基酸之间，与STATs的激活有关。
SH3则位于第500- 600位氨基酸之间，序列保守性较SH2差，能结合富含脯氨酸的序列，功能尚不明确、此外，STATs还具有DNA 结合区，不同的STATs常有共同的DNA结合基序，但最佳结合点有差异。
三、信号通路的过程与调控JAK一STAT信号传递的基本过程可概括为:公田胞因子与其相应配体结合;C受体和JAKS发生聚集，邻近的JAKS相互磷酸化而被活化;OJAKs的JH 1结构域催化STATs上相应部位的酪氨酸残基磷酸化，同时STATs的SH2功能区与受体中磷酸化的酪氨酸残基作用而使STATs活化尸4}，TATs进入核内同其他一些转录因子相互作用从而调控基因转录181。
2022年9月17日全国事业单位联考《综合应用能力》C类一、给定材料材料1(330310)男性与女性在某些疾病的患病率和对某些药物的反应上都存在差异，那么这些差异是如何与性别联系起来的呢？以色列魏茨曼科学研究所的一项研究发现，数千个能够编码蛋白质的基因的表达情况存在两性差异。
这些基因中的有害突变倾向于在人群中积累，而且具有较高的基因频率。
这些基因的基因图谱已经发表在BMC Biology上，进一步说明了男性和女性经历了不同而又互相联系的演化历程。
几年前，魏茨曼科学研究所分子遗传所的Shmuel Pietrokovski教授和Moran Gershoni博士意识到，人类某些特定疾病的发病率普遍较高。
他们关注的一个典型案例是，希望生育的夫妇中约15%被诊断为不孕不育，这一数据说明导致生育能力降低的突变较为普遍。
但这种现象与常识相违背——减少后代数量进而影响存活个体数的突变，应该在自然选择过程中很快被淘汰掉，但为什么这种疾病的患病率然如此之高呢？Pietrokovski和Gershoni发现，影响精子形成的特定基因突变能够保留下来的原因是：这些基因仅仅在男性中表达。
当一个突变只能影响种群中的一半个体，那么无论危害大小，它都能够通过另一半个体畅通无阻传递给下一代。
在进一步研究中，研究人员的分析范围由生殖必需的基因扩大到两性间表达不相同的基因。
为了确定这些基因，研究人员开展了GTEx（Genotype-Tissue Expression，基因型-组织表达）项目的研究。
该项目拥有一座人类基因表达的数据库，这些基因表达数据来自近550名成年捐赠者提供的器官和组织样本，使得研究人员第一次能够绘制两性之间具有差异表达的基因的基因图谱。
Pietrokovski和Gershoni分析了大约两万个编码蛋白的基因，按照性别将它们分类，以找出那些存在差异表达的基因。
最终发现，大约6500个基因的表达活性与性别有关，且至少在人体某一个组织中存在差异。
cGAS-STING 信号通路调节剂在免疫治疗中的研究进展娄方宁1，郑明月2，陈凯先1,2*，张素林2**（1中国药科大学药学院, 南京211198；2中国科学院上海药物研究所, 原创新药研究全国重点实验室,药物发现与设计中心, 上海 201203）摘 要 环鸟嘌呤-腺嘌呤核苷酸合成酶（cGAS ）-干扰素基因刺激蛋白（STING ）信号通路感知细胞质中的异常双链DNA 后，诱导Ⅰ型干扰素（IFN- Ⅰ ）和促炎细胞因子表达，从而激活宿主的免疫应答，增强机体抗肿瘤免疫反应和抗病原体感染。
但是，cGAS-STING 信号通路的持续激活会驱动自身免疫性疾病、衰老相关炎症和神经退行性病变等疾病。
本文阐述了cGAS-STING 信号通路参与调控多种免疫相关性疾病发生发展的机制，重点回顾了STING 激动剂、cGAS 抑制剂以及STING 抑制剂的研发进展，为cGAS-STING 调节剂的研发提供更多理论参考。
关键词 cGAS-STING 信号通路；STING 激动剂；cGAS 抑制剂；STING 抑制剂；免疫治疗中图分类号 R914.2 文献标志码 A文章编号 1000−5048(2024)01−0015−11doi ：10.11665/j.issn.1000−5048.2023112402引用本文 娄方宁，郑明月，陈凯先，等. cGAS-STING 信号通路调节剂在免疫治疗中的研究进展[J]. 中国药科大学学报，2024，55（1）：15 −25.Cite this article as: LOU Fangning, ZHENG Mingyue, CHEN Kaixian, et al . Research progress of cGAS-STING signaling pathway modulators in immunotherapy[J]. J China Pharm Univ , 2024, 55(1): 15 − 25.Research progress of cGAS-STING signaling pathway modulators in immunotherapyLOU Fangning 1, ZHENG Mingyue 2, CHEN Kaixian 1,2*, ZHANG Sulin 2**1School of Pharmacy, China Pharmaceutical University, Nanjing 211198; 2Drug Discovery and Design Center, State KeyLaboratory of Drug Research, Shanghai Institute of Materia Medica, Chinese Academy of Sciences, Shanghai 201203, ChinaAbstract Upon monitoring cytoplasmic aberrant double-stranded DNA, cGAS-STING signaling pathway induces the expression of type I interferons and pro-inflammatory cytokines, which activates the host immune response and enhances anti-tumor immune response and resistance to pathogen infection. However, sustained activation of the cGAS-STING signaling pathway drives diseases such as autoimmune diseases, aging-associated inflammation, and neurodegenerative pathologies. Herein, we describe the mechanism by which cGAS-STING signaling pathway participates in regulating the development of various immune-related diseases, with a particular review of the research and development progress of STING agonists, cGAS inhibitors, and STING inhibitors, aiming to provide some theoretical reference for the future development of cGAS-STING modulators.Key words cGAS-STING signaling pathway; STING agonist; cGAS inhibitor; STING inhibitor; immunotherapyThis study was supported by the National Natural Science Foundation of China (No. T2225002, No.82273855); the National Key Research and Development Program of China (No. 2022YFC3400504); CAS Youth Innovation Promotion Association (No.2023296)； and the Natural Science Foundation of Shanghai (No. 22ZR1474300)收稿日期 2023-11-24 通信作者 *Tel ：************ E-mail ：**************.cn**Tel ：************ E-mail ：***************.cn基金项目 国家自然科学基金项目（No. T2225002；82273855）；国家重点研发计划项目（No. 2022YFC3400504）；中国科学院青年创新促进会资助项目（No. 2023296）；上海市自然科学基金项目（No. 22ZR1474300）学报 2024, 55(1): 15 − 2515先天免疫系统依靠模式识别受体（pattern recognition receptors, PRRs ），如细胞膜上的Toll 样受体（Toll-like receptors, TLRs ），以及细胞内的DNA 感受器等[1]，监测细胞外危险信号和细胞内的一些自我或非我成分，从而快速激活宿主免疫系统，产生针对入侵病原体、凋亡或受损组织细胞的免疫反应[2]。
TALEN靶向基因敲除TALENs(transcription activator-like (TAL) effector nucleases)，中文名是转录激活因子样效应物核酸酶，TALENs是一种可靶向修饰特异DNA序列的酶，它借助于一种由植物病原菌黄单胞菌(Xanthomonas)自然分泌的天然蛋白即激活因子样效应物(TAL effectors, TALEs)---的功能：该蛋白能够识别特异性DNA碱基对。
人们可以设计一串合适的TALEs来识别和结合到任何特定序列，如果再附加一个在特定位点切断DNA双链的核酸酶，就生成了TALENs。
TAL效应核酸酶可与DNA结合并在特异位点对DNA链进行切割，从而利用这种TALEN就可以在细胞基因组中引入新的遗传物质。
相对锌指核酸酶(zinc-finger nuclease, ZFN)而言，TALEN能够靶向更长的基因序列，而且也更容易构建。
但是直到现在，人们一直都没有一种低成本的而且公开能够获得的方法来快速地产生大量的TALENs。
TALEN 靶向基因敲除技术是一种崭新的分子生物学工具，现已应用于植物、细胞、酵母、斑马鱼及大、小鼠等各类研究对象。
研究发现，Xanthomonas TAL蛋白核酸结合域的氨基酸序列与其靶位点的核酸序列有较恒定的对应关系。
研究者们利用来自Xanthomonas TAL的序列模块，构建针对任意核酸靶序列的重组核酸酶，在特异的位点打断目标基因，敲除该基因功能。
成功解决了常规的ZFN方法不能识别任意目标基因序列，以及识别序列经常受上下游序列影响识别特性的问题，使基因敲除变得简单方便。
技术特点：·无基因序列、细胞、物种限制。
·实验周期短。
·整个实验简单准确，成本低。
·成功率可达90%以上。
·毒性低、脱靶情况少。
·TAL的核酸识别单元与A、G、C、T有恒定的对应关系。
·靶序列识别模块不受上下游影响，特异识别并打断基因组中的任意靶序列。
敲除Attractin或Mahoganoid基因对雄性小鼠生殖内分泌激素的影响隋聪;熊承良;沈士亮【期刊名称】《中国计划生育学杂志》【年(卷),期】2007(015)012【摘要】目的:探讨敲除Attractin(Atrn)或Mahoganoid(Md)基因对雄性小鼠生殖内分泌激素的影响.方法:选取成年雄性Atrn基因敲除纯合子、Md基因敲除纯合子及正常小鼠(均为C3H/Hej种系)各12只设为Atrn基因敲除组、Md基因敲除组和对照组.内眦静脉取血清取外周血,化学发光法检测血清睾酮(T)、雌二醇(E2)浓度,用酶联免疫法(ELISA)检测血清卵泡刺激素(FSH)、黄体生成素(LH)和泌乳素(PRL)浓度,进行组间浓度对比.结果:Atrn基因敲除组和Md基因敲除组的外周血E2、LH、FSH、PRL浓度均低于对照组,差异有统计学意义(P＜0.05);血清T浓度Atrn基因敲除组高于对照组,而Md基因敲除组低于对照组,差异无统计学意义(P＞0.05).结论:Atrn或Md基因敲除后雄性小鼠的外周血E2、LH、FSH、PRL浓度均有下降,其具体机制及对外周血T浓度的影响有待进一步研究.【总页数】3页(P729-731)【作者】隋聪;熊承良;沈士亮【作者单位】华中科技大学同济医学院计划生育研究所生殖医学中心,武汉,430030;华中科技大学同济医学院计划生育研究所生殖医学中心,武汉,430030;美国斯坦福大学遗传学教研室【正文语种】中文【中图分类】R3【相关文献】1.促肾上腺皮质激素释放激素基因敲除对烧伤后早期小鼠巨噬细胞趋化和组织细菌移位的影响 [J], 杨策;王海燕;黄苏娜;严军;钟河江;刘庆;李磊;蒋建新2.诱蛋白基因敲除对雄性小鼠细胞因子水平的影响 [J], 王仕琪;熊承良;李洁3.FMR1基因敲除对雄性小鼠生殖功能的影响 [J], 祝亚桥;周兴;陈盛强4.SOX30基因敲除对雄性小鼠睾丸组织结构及激素分泌的影响 [J], 王平;姜晓;韩飞;崔志鸿;唐莹;周洋西;刘文斌;曹佳;刘晋祎5.UTB基因敲除对雄性小鼠Leydig细胞分泌睾酮的影响 [J], 郭丽荣;孟艳;赵雪俭因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
Rosetta系列的表达菌株可以提供T7 RNA聚合酶，它能表达PET系列载体上的外源基因。
pGEX系列载体上的外源基因不需要T7 RNA聚合酶，普通的大肠杆菌经IPTG 诱导即可表达Tac启动子是一组由Lac和trp启动子人工构建的杂合启动子，受Lac阻遏蛋白的负调节，它的启动能力比Lac和trp都强。
其中Tac 1是由Trp启动子的－35区加上一个合成的46 bp DNA片段(包括Pribnow盒)和Lac操纵基因构成，Tac 12是由Trp的启动子-35区和Lac启动子的-10区，加上Lac操纵子中的操纵基因部分和SD序列融合而成蛋白标签：A myc tag is a polypeptide protein tag derived fromthe c-myc gene product that can be added to a protein using recombinant DNA technology. It can be usedfor affinity chromatography, then used to separate recombinant, overexpressed protein from wild type protein expressed by the host organism. It can also be used in the isolation of protein complexes with multiple subunits.A myc tag can be used in many different assays that require recognition by an antibody. If there is no antibody against the studied protein, adding a myc-tag allows one to follow the protein with an antibody against the Myc epitope. Examples are cellular localization studies by immunofluorescence or detection by Western blotting.The peptide sequence of the myc-tag is (in 1- and 3-letter codes, respectively): N-EQKLISEEDL-C,N-Glu-Gln-Lys-Leu-Ile-Ser-Glu-Glu-Asp-Leu-C, where N stands for Amino-terminus and C stands for Carboxyterminus. The tag is approximately 1202 Daltons in atomic mass and has 10 amino acids.It can be fused to the C-terminus and the N-terminus of a protein. It is advisable not to fuse the tag directly behind the signal peptide of a secretory protein, since it can interfere with translocation into the secretory pathway.A monoclonal antibody against the myc epitope, named 9E10, is available from thenon-commercial Developmental Studies Hybridoma BankpGEX4T1载体基本信息出品公司:GE别名:pGEX-4T-1, pGEX4T1, pGEX 4T 1质粒类型:大肠杆菌蛋白表达载体表达水平:高拷贝启动子:Tac克隆方法:多克隆位点，限制性内切酶载体大小:4969 bp5' 测序引物及序列:pGEX5': GGGCTGGCAAGCCACGTTTGGTG3' 测序引物及序列:pGEX3': CCGGGAGCTGCATGTGTCAGAGG 载体标签:N-GST载体抗性:Ampicillin 氨苄备注:复制子是pMB1产品目录号:27-4580-01稳定性:瞬时表达Transient组成型:诱导表达病毒/非病毒:非病毒pGEX4T1载体质粒图谱和多克隆位点信息原核生物DNA复制起始点，是DNA链上独特的具有起始DNA复制功能的碱基序列。
睾丸酮丛毛单胞菌激素降解关键酶3,17β-HSD蛋白质相互作
用研究
于璇;史翔予;赵艳阳;高乐;张昊
【期刊名称】《长春理工大学学报（自然科学版）》
【年(卷),期】2024(47)2
【摘要】为研究睾丸酮丛毛单胞菌(Comamonas Testosteroni,C.T.)ATCC11996降解甾体类激素过程中关键蛋白质的相互作用关系,本文利用基因同源重组及移码突变原理构建睾丸酮降解关键酶3,17β-HSD基因敲除突变株,在回收率95%条件下高效液相检测野生株与突变株睾丸酮降解率,突变株对睾丸酮降解能力明显低于野生株;原核表达3,17β-HSD获得浓度2.4 mg/mL纯化蛋白,制备特异性鼠源多克隆抗体,ELISA检测抗体效价1∶320000;将多克隆抗体与经睾丸酮诱导的野生型C.T.细胞裂解液蛋白质复合物进行免疫共沉淀,质谱测定蛋白质相互作用组,结果表明短链脱氢酶SDRy(WP_003078287.1)为睾丸酮降解过程中关键酶3,17β-HSD 的主要相互作用蛋白。
【总页数】8页(P84-91)
【作者】于璇;史翔予;赵艳阳;高乐;张昊
【作者单位】长春理工大学生命科学技术学院
【正文语种】中文
【中图分类】Q819
【相关文献】
1.睾丸酮丛毛单胞菌LysR基因的克隆及对3α-HSD/CR表达的调节
2.睾丸酮丛毛单胞菌3α-HSD的研究进展
3.睾丸酮丛毛单胞菌降解胆固醇的培养条件研究
4.丛毛睾丸酮单胞菌ZD 4-1和铜绿假单胞菌ZD 4-3降解芳香烃化合物的机理
5.改良睾丸酮丛毛单胞菌降解鸡粪甾体化合物的研究
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烟酸羟基化菌株睾酮丛毛单胞菌JA1抗性质粒的消除杨瑶;袁生;尚广东;戴亦军【期刊名称】《南京师大学报（自然科学版）》【年(卷),期】2007(030)002【摘要】睾酮丛毛单胞菌JA1可羟基化烟酸产生6-羟基烟酸,并且对多种抗生素具有抗性.碱变性法提取JA1细胞内的质粒, 检测到一个约19 kb大小的质粒.用0.002 5% SDS进行质粒消除实验,结果表明,质粒消除后菌株对卡那霉素敏感,但仍对氨苄青霉素、安普霉素和链霉素具有抗性,推测质粒携带卡那霉素的抗性基因.同时,质粒消除后,JA1菌株烟酸脱氢酶酶活性没有变化,推测烟酸脱氢酶的基因并不在质粒上.【总页数】4页(P77-80)【作者】杨瑶;袁生;尚广东;戴亦军【作者单位】江苏省生物多样性和生物技术重点实验室,南京师范大学生命科学学院微生物工程重点实验室,江苏,南京,210097;江苏省生物多样性和生物技术重点实验室,南京师范大学生命科学学院微生物工程重点实验室,江苏,南京,210097;江苏省生物多样性和生物技术重点实验室,南京师范大学生命科学学院微生物工程重点实验室,江苏,南京,210097;江苏省生物多样性和生物技术重点实验室,南京师范大学生命科学学院微生物工程重点实验室,江苏,南京,210097【正文语种】中文【中图分类】Q819【相关文献】1.睾丸酮丛毛单胞菌JL40中甲酸脱氢酶-O的锑抗性及锑氧化作用 [J], 王佳佳;刘冬梅;王革娇;李明顺2.食酸丛毛单胞菌AN3菌株降解苯胺代谢途径的研究 [J], 刘志培;杨惠芳3.睾丸酮丛毛单胞菌活化因子基因的质粒载体构建及表达 [J], 戴艺民;潘大仁;Guangming Xiong;吴明霞;周以飞4.睾酮丛毛单胞菌JA1菌株羟基化烟酸产生6-羟基烟酸的发酵产酶条件研究 [J], 杨瑶;袁生;戴亦军5.食酸丛毛单胞菌AN3菌株降解苯胺的研究 [J], 刘志培;杨惠芳;周培瑾因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
农业生物技术学报 Journal of Agricultural Biotechnology 2008,16(2):336~340* 基金项日： 福建省科技厅攻关计划重大项目(No.2003N028)、 教育部科学技术重点项目(No.207056)、 福建省教育厅科学技术重点项目(No. JA06011)和福建省发改委项目(闽计投资 〔2003170号〕)资助。
**通讯作者。
Author for correspondence.教授,主要从事农业生物技术应用研究。
Email ： <pandaren@>. 收稿日期：2007.0919 接受日期： 20071008 ·研究论文· 启动子碱基突变对睾丸酮丛毛单胞菌()降解能力的影响 *陈建秋 1 , 潘大仁 1**, 周以飞 1 ,程晓春 2 ,张剑亮 1 , 卢文标 2 ,陈雅艳 1 ,林 钿 1 (1.福建农林大学作物科学学院，福州 350002;2.福建农林大学生命科学学院， 福州 350002;) 摘要：应用PCR 技术将发生突变的 启动子原 10区（TATGTT ） 回复突变为TATATT 和 TATGAT ， 构建了 2 个重组质粒 pPM1和pPM2。
酶切结果发现，pPM1质粒转化大肠杆菌 （ ） 后部分细菌对启动子进行切除。
将重组质粒分别与 pAX1共转化大肠杆菌， 提取细菌总蛋白， 酶联免疫吸附法测定细菌总蛋白中 activator 及 3琢 HSD 的表达量， 结果表明， 启动子原 10保守区为TATATT 的质粒比原 10保守区为 TATGAT 的质粒具有更高的转录活性， activator 及 3琢HSD 的表达量高 低依次均为 pPM1＞pPM2＞pb (对照)。
根据同源重组原理, 将重组质粒电击转化睾丸酮丛毛单胞菌 (, . .),并利用HPLC 测定了各突变菌对睾凡酮的降解能力， 结果表明， 不同突变菌对睾丸酮的降解能力高低依次为 Cp7( +pPM1)>Cp4(+pPM2)>Cb7(+pb)>。
关键词： 启动子;突变;睾丸酮丛毛单胞菌中图分类号: S188 文献标识码: A 文章编号: 10061304(2008)02033605Influence of Mutant Promoter on the Degradation ofCHEN Jianqiu 1 ,PAN Daren 1 **, ZHOU Yifei 1 ,CHENG Xiaochun 2 ,ZHANG Jianliang 1 ,LU Wenbiao 2,CHEN Yayan 1 ,LIN Dian1原 10consensus sequence (TATGTT)of mutational promoter was reverted to TATATT and TATGAT by PCRamplification method.According to the results of PCR amplification,two recombinant plasmids pPM1and pPM2were constructed. Results of endonuclease digestion showed thatpromoter of plasmid pPM1could be deleted inTotal cell lysate ofthe host bacteria was extracted after cotransforming intoHB101respectively with pPM1+pAX1and pPM2+pAX1.Thequantity of activator or 3琢 HSD protein was tested by ELISA.The results indicated that plasmid containing TATATT of 原 10 consensus sequence had higher transcriptional activity than that containing TATGAT,and the quantity of activator or 3琢 HSD protein expressed in different plasmids was pPM1＞pPM2＞pb(control).Meanwhile,recombinant plasmids were integrated into( . .)chromosome through homologous recombination by electroporation respectively.Their testosterone degradationability was determined by HPLC and their testosterone degradation ability was Cp7 （ +pPM1） >Cp4 （+pPM2） >Cb7 （+pb ） >.promoter;mutation;睾丸酮丛毛单胞菌 ( ) 3琢 HSD （3琢 羟基类固醇脱氢酶） 是类固醇类化合 物、 多环芳烃等降解过程中的关键酶。
在 基因上游 2.6kb 处存在一个基因，该基因的启动子为弱启动子 (Xiong.,2001a,b; 2003a,b,c)，自然条件下该菌表达的关键酶活性较第 2期 陈建秋等:\启动子碱基突变对睾丸酮丛毛单胞菌( )降解能力的影响低。
研究表明， 含 启动子的重组质粒 pb可以显 著提高 基因的表达(戴艺民等， 2005； 戴艺 民等， 2006)。
通过对 pb质粒测序， 结果发现 启动 子原 10区保守序列发生了突变，启动子原 10区(Prib now区)从 TATAAT变成 TATGTT导致结构基因 转录水平的降低。
为了更好地提高 基因的 表达， 本研究在前期研究的基础上， 利用 PCR技术 将 启动子原 10区 TATGTT回复突变为 TATATT 或 TATGAT， 研究其在大肠杆菌内 基因的 表达以及所构建的突变菌对睾凡酮物质降解能力的 影响。
1材料和方法1.1 材料1.1.1菌种、质粒和培养基 睾丸酮丛毛单胞菌 （ ATCC11996,Amp r）、大肠 杆菌 （ ） HB101、 质粒 pb（含 409bp的 基因， 载体为 pK18， Kan r）、 pK18（Kan r） 和 pAX1（含 基因， 载体为 pUC18,Amp r） 均为 本实验室保存。
LB培养基:蛋白胨 10g/L,酵母粉 5 g/L,NaCl5g/L,pH7.0。
1.1.2酶、生化试剂及试剂盒 DNA聚合酶、 胶回收试剂盒 （PCR Fragment Recovery Kit）、 限制性 内切酶和 T4 DNA连接酶均购自大连宝生物公司 （TAKARA）； 卡那霉素(Kan)和氨苄青霉素 （Amp） 购 自 AMERSCO(America,Solon)。
质粒提取试剂盒 （MediBEST Plsmid Purification Kit） 购自 Qiagen公 司(上海)。
PCR引物由上海生工生物工程技术服务 有限公司 （Sangon） 合成。
兔抗 activator和 3琢 HSD 血清为本实验室制备。
其余生化试剂均为国产分析 纯。
1.2 方法1.2.1 pPM1和 pPM2质粒载体的构建 根据戴艺 明等(2005， 2006)的研究结果， 在 启动子原 10区 设计 2条下游引物:PM1:5'GCTCGTATATTGTGTGG3'；PM2:5'CTCGTATGATGTGTGGA3'。
PM1将 启动子原 10区保守序列突变为 TATATT，PM2将 启动子原 10区的保守序列突 变为 TATGAT。
同时根据 pb质粒载体序列， 设计 2条引物：上游引物 PL:5'TAACGACGGCCAGTG3'；下游引物 PR:5'TAAGGAACCCGCACT3'。
以 pb质粒为模板， 分别以 PM1、 PL和 PM2、 PL 为引物进行 PCR扩增， PCR产物经 1.0%的琼脂糖 凝胶电泳后回收目的片段。
以该回收的目的片段为 上游引物，再分别与下游引物 PR进行第 2次 PCR 扩增， PCR产物经 1.0%的琼脂糖凝胶电泳后回收目 的片段。
参照 Sambrook and Russell(2002)进行目的 片段与载体 pb的酶切连接， 构建 pPM1和 pPM2质 粒载体。
1.2.2突变菌的构建 用 10%冰冷的甘油制备ATCC11996的感受态细胞， 并将质粒 pPM1、 pPM2和 pb进行脱盐处理 (Sambrook and Russell， 2002)。
脱盐后的质粒分别和 .感受态细胞进行电击转化，将电击转化后的细菌涂 布在含卡那霉素的固体 LB培养基上， 30 ℃培养过 夜， 挑取单克隆进行振荡培养。
1.2.3细菌总蛋白的提取 取 3mL培养好的细 菌， 13000r/min,离心 30s， 弃上清， 用无菌水清洗菌 体沉淀 3次后， 加入 200滋 L的 PBS溶液， 重悬沉淀 并加入 1滋 L的溶菌酶(5mg/mL)。
反复冻融 3次 （每 次 30min以上）， 13000r/min离心 20min，取上清 备用。
1.2.4目的蛋白的 ELISA检测 提取的细菌总蛋白 用考马斯亮蓝法进行蛋白质含量的测定，并将细菌 蛋白浓度调整为 1mg/mL，用包被液稀释 100倍后 进行 ELISA测定。
ELISA检测具体方法参考 Frederick .(1998)方法。
1.2.5突变菌对睾丸酮降解能力的 HPLC测定 调 节各突变菌 600为 15000r/min离心 10min,收集 菌体， 悬浮于无菌水中制成菌悬液。
取 1mL菌悬液 加入到装有无机盐培养基的三角瓶中，加入终浓度 为 270滋 g/mL的睾凡酮， 30 ℃ 180r/min震荡培养 6 h。
