植物病原菌分离方法

绣线菊内生真菌的分离及对植物病原菌的抑制作用
徐庆庆;曾现银;柏钰;花日茂;操海群;吴祥为;李学德;唐俊
【期刊名称】《安徽农业大学学报》
【年(卷),期】2013(40)6
【摘要】采用组织分离法，以PDA培养基为分离培养基，从绣线菊的根、茎和叶中分离获得39株内生真菌。

平板对峙结果表明，21株活性菌株对6种植物病原菌（辣椒疫霉病原菌、番茄枯萎病原菌、苹果腐烂病原菌、苹果炭疽病原菌、葡萄灰霉病原菌、小麦赤霉病原菌）有不同程度的抑制作用，其中菌株XXT10对苹果腐烂病原菌、苹果炭疽病原菌、番茄枯萎病原菌、小麦赤霉病原菌的抑制率分别达到73．2％、72．5％、39．5％和42．7％。

通过测得的ITSrDNA序列与GenBank数据库中已知序列比对后该菌为链格孢属菌。

生物学特性试验表明，该菌株在28～32℃时，选择PDA培养基，分别以乳糖和蛋白胨作为碳、氮源，酸碱度中性的条件下，茵落的生长状况最佳。

【总页数】6页(P975-980)
【作者】徐庆庆;曾现银;柏钰;花日茂;操海群;吴祥为;李学德;唐俊
【作者单位】安徽农业大学资源与环境学院
【正文语种】中文
【中图分类】S482.292
【相关文献】
1.商洛黄芩内生真菌分离鉴定及抗植物病原菌活性筛选
2.喜树内生真菌的分离、鉴定以及抗植物病原菌活性的初步研究
3.无花果内生真菌Alternaria sp. FL25次生代谢产物的分离及对植物病原菌的抑制活性(英文)
4.对三种苹果病原菌具抑制作用的新疆野苹果内生真菌的分离与鉴定
5.喜树内生真菌的分离及其对植物病原菌的抑菌活性测定
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商洛黄芩内生真菌分离鉴定及抗植物病原菌活性筛选摘要:采用组织分离法从健康黄芩(Scutellaria baicalensis Georgi)植株的根､茎､叶中分离获得36株内生真菌,经鉴定隶属于12属,链格霉属为优势属｡对峙试验结果显示,分离获得的内生菌中有31株对一种或多种植物病原菌有不同程度的抑制作用, 占分离菌的86%;有6株菌对一种或多种病原菌的抑菌率在75%以上,占分离菌的17%｡对这6株菌培养滤液的抑菌活性也进行了测定,结果表明对峙试验中产生抑菌带的菌株其培养滤液抑菌活性也高｡在6株筛选到的活性菌株中,SBF02和SBF06对棉立枯病菌抑制效果较好;SBF08和SBF27对苹果干腐病菌抑制效果较好; SBF11和SBF27对茄腐皮病镰孢霉抑制效果较好;SBF08和SBF32分别对烟草赤星病菌和草燕麦镰孢霉抑制效果较好｡关键词:黄芩(Scutellaria baicalensis Georgi); 内生真菌;分离;抑菌活性Isolation of Endophytic Fungi from Scutellaria baicalensis Growing in Shangluo Region and Screening of Their Inhibitory Activities to Plant PathogensAbstract: Thirty-six strains of endophytic fungi were isolated from the roots,stems and leaves of healthy Scutellaria baicalensis Georgi with tissue method. They were identified as twelve fungal genera among which Alternaria was the dominant genus. The results of antagonistic cultivation indicated that thirty-one strains of endophytic fungi, accounting for 86% of all the isolates, could inhibit one plant pathogens or more to some extent; and the inhibitory activity of six strains, seventeen percent of total isolates; was significant at least to one plant pathogens, with the anti-bacterial ratio higher than 75%. Antimicrobial activity of six strains’s culture filtrates were also detected and presented that the strains producing inhibition band in antagonistic cultivation also showed remarkable inhibitory activity to indicative pathogens in the test of culture filtrates. Among six screened strains, SBF02 and SBF06 showed remarkable inhibitory activity to Rhizoctonia solani Kühn, SBF08 and SBF27 showed remarkable inhibitory activities to Botryosphae riadothidea, SBF11 and SBF27 showed remarkable inhibitory activities to Fusarium solani(Mart.), and SBF08 and SBF32 showed remarkable inhibitory activities to Alternaria alternata and Fusarium avenaceum respectively.Key words: Scutellaria baicalensis Georgi; endophytic fungi; isolation; inhibitory activity内生真菌普遍存在于健康植物各种组织､器官和细胞间隙内,与宿主之间建立了紧密的生态关系,产生的次生代谢产物对提高植物对各种生物和非生物胁迫的抵抗能力发挥着重要的作用｡因此,内生菌已成为筛选新型抗生素和其他生理活性物质的重要资源[1,2]｡尤其近年来随着人们对使用化学农药存在残留､容易引发抗性和再猖獗等隐患问题的深刻认识,从药用植物中分离筛选具有生防作用的内生菌以研发生物农药更是一个新兴的研究热点[3-5]｡黄芩(Scutellaria baicalensis Georgi)为唇形科植物,主要以其根部入药,现代医学研究表明,黄芩含有40多种活性成分,具有抗氧化､抗过敏､抗菌､抗病毒等多方面的功效[6]｡目前有关黄芩内生真菌抗菌活性的研究主要集中在对医学病原菌的抑制方面,而对植物病原菌的抑制研究很少｡由于不同地理环境和气候条件下内生真菌有一定差异,陕西商洛地区具有从北温带向南暖湿带过渡的地理和气候特征,黄芩是驰名的五大商药之一,但对商洛黄芩内生真菌的研究尚未见报道｡本实验对商洛黄芩内生真菌进行了分离鉴定,并测定了内生真菌对5种植物病原菌的抑菌活性,以期获得具有良好抑菌活性的菌株,为寻找新型抑菌物质和研发生物农药提供依据｡1 材料与方法1.1 材料1.1.1 植物材料分离内生菌所用植物材料为黄芩,于2009年8月采自商洛香菊药源基地,取健康植株的根､茎､叶组织样品,装入保鲜袋内带回实验室,4 ℃冷藏保存,2 d内样品处理完毕｡1.1.2 供试植物病原真菌选用以下5种植物病原菌为供试靶标菌:烟草赤星病菌(Alternaria alternata),苹果干腐病菌(Botryosphae riadothidea),棉立枯病菌(Rhizoctonia solani Kühn),茄腐皮病镰孢霉[Fusarium solani(Mart.)],草燕麦镰孢霉(Fusarium avenaceum)｡供试植物病原菌由陕西省微生物研究所提供｡1.1.3 培养基内生真菌的分离纯化以及靶标菌的培养采用PDA固体培养基;内生真菌的发酵用PDA液体培养基;内生菌的鉴定用查氏培养基和促孢培养基,促孢培养基配方如下:KH2PO4 1 g, KNO3 1 g, MgSO4·7H2O 0.5 g,KCl 0.5 g,淀粉0.2 g,葡萄糖0.2 g,蔗糖0.2 g,琼脂20 g,水1 000 mL, pH自然｡1.2 方法1.2.1 内生真菌的分离与纯化内生真菌分离采用组织块分离法[7,8]｡将新鲜黄芩的根､茎､叶用自来水冲洗干净,分别切成约0.5 cm的小段(片),每个部位选标样32块,无菌条件下按下列程序进行表面消毒:75%乙醇(15~20 s)→无菌水(3~4次)→0.1%的升汞(3~5 min)→无菌水(4~5次),叶等幼嫩组织处理时间稍短｡再于无菌条件下将上述表面消毒的样品切成0.2 cm长的小段或0.2 cm×0.2 cm的小片接种于含0.04%氯霉素的PDA平板上,置28 ℃恒温培养5 d 左右｡待组织块断面边缘长出菌丝后,根据菌落形态和颜色等的不同用接种针挑取尖端菌丝分别移至新的PDA培养基上,反复转接纯化,得到纯培养菌株,4 ℃保藏备用｡为了检验对材料表面消毒是否彻底,以消毒后不做任何切割的样品作为对照,于相同条件下培养,如对照平板无菌丝长出则证明表面消毒灭菌彻底,分离的真菌来自植物组织内部,否则分离结果无效｡1.2.2 内生真菌的形态观察与初步鉴定挑取在PDA培养基上纯化好的菌株尖端菌丝接种于查氏培养基和产孢培养基上,培养一段时间后观察菌落､菌丝体和孢子的形态特征,参考有关文献将分离的内生真菌鉴定到属[9-11]｡以点植培养法进行菌落观察和常规镜检:用接种针从斜面上取少量孢子,点植于平板上适当的位置,倒置平板于恒温箱中, 28 ℃培养4､7､10 d,观察菌落特征｡取少量菌丝,用乳酸石炭酸棉蓝染色液染色,进行常规镜检｡以插片法观察培养基内和气生菌丝:将真菌接种到平板上,插上灭菌盖玻片后培养,使真菌菌丝沿着培养基表面与盖玻片的交接处生长而附着在盖玻片上｡观察时轻轻取出盖玻片置于载玻片上,直接观察｡以印片法观察孢子及菌丝体形态:将要观察的菌落先印在盖玻片上,放置于滴有少量乳酸石炭酸棉蓝染色液的载玻片上直接观察｡根据鉴定结果,计算内生真菌的分离率｡分离率=某一指定类型内生真菌株数/分离样品组织块总数×100%1.2.3 拮抗真菌的初步筛选拮抗真菌初步筛选采用对峙培养法[6,11]:在无菌条件下将内生真菌和供试病原菌活化好,用打孔器制成直径为0.5 cm的菌饼分别移至PDA平板上,二者相距2.5 cm,同时以只接病原菌的平板作对照,处理和对照均设3次重复,置于28 ℃下恒温避光培养｡观察记录对峙培养中病原菌菌落的生长和抑菌现象,测量菌丝扩展半径,根据抑菌率初步筛选出对病原菌生长具有抑制作用的内生真菌｡抑制率=(对照菌落半径-处理菌落对峙面半径)/对照菌落半径×100%1.2.4 初筛拮抗真菌培养滤液活性的测定1)摇瓶培养:将分离的拮抗作用较好的内生真菌在斜面培养基上活化,待生长旺盛后,在无菌条件下用直径为0.5 cm的打孔器沿菌落边缘打下10块菌饼,并用接种针挑取接种至含200 mL PDA液体培养基的500 mL锥形瓶中,28 ℃,120 r/min 恒温摇床振荡培养10 d后,无菌条件下过滤除去菌丝,滤液用于代谢产物活性的测定[12]｡2)活性测定:按生长速率法,取20 mL滤液与150 mL熔化的PDA培养基(50~60 ℃)混匀制成平板, 接种直径为0.5 cm的病原菌菌饼于平板上,以不加滤液的PDA平板作对照,每个处理重复3次, 28 ℃下静置培养5 d, 测量菌落直径, 同时观察对照情况,计算抑制百分率｡2 结果与分析2.1 商洛黄芩内生真菌的分离与鉴定结果从8月份采集的商洛黄芩的96个组织块中分离到36株内生真菌,总分离率为37.50%,其中根､茎､叶各分离到14､10､12株,分离率分别为43.75%､31.25%､37.50%｡分离菌株经鉴定隶属于12个属,根､茎､叶分别有8､4､5属,优势属为链格孢属,有12株,占总分离菌的33.33%(表1)｡总体看来,商洛黄芩中分布的内生真菌比较丰富,不同组织部位内生真菌的数量相差不大,但属种分布存在明显差异｡2.2 内生真菌对病原真菌的拮抗作用筛选结果对峙培养测试表明,商洛黄芩中存在丰富的抗菌活性菌株,分离的36株内生真菌中有31株对5种植物病原菌中至少1种有不同程度的拮抗作用,占总分离真菌的86.11%(表2)｡在活性菌株中,对苹果干腐病菌有抑制作用的菌株最多,有25株,占活性菌株总数的80.65%,且14株菌抑菌率在60%以上,其中从叶部分离到的菌株SBF27的抑菌率达82.36%｡对茄腐皮病镰孢霉､烟草赤星病菌､棉立枯病菌和草燕麦镰孢霉抑菌率在60%以上的菌株分别为12､10､8和7株,综合分析得知,36株分离菌中对至少1种病原菌的抑菌率在60%以上的菌株有21株,占总菌株数的58.33%｡对峙试验显示不同内生真菌对同一病原菌的抑制效果差异较大,以对苹果干腐病菌的抑制为例,SBF23对它的抑制率是15.31%,而SBF27对它的抑菌率达82.36%;同一内生真菌对不同病原菌的抑制程度也不相同,如菌株SBF02､SBF08和SBF32对5种病原菌都有较强的抑菌率,而其他菌株只对特定的病原菌产生较强的拮抗效应,拮抗作用因病原菌的不同表现出较大的差异｡可见内生真菌对病原真菌的拮抗作用具有一定选择性｡此外,从对峙试验中发现,内生菌对病原菌的抑制作用也有多种表现形式｡有的内生菌对病原菌产生抑菌带,在显微镜下可以看到病原菌菌丝出现萎缩､断裂p 2.3 初筛菌株培养滤液的活性测定结果测定结果表明,初筛得到的6株菌的培养滤液对5种病原真菌均有不同程度的抑制作用(表3),其中SBF02和SBF06对棉立枯病菌,SBF08和SBF27对苹果干腐病菌,SBF11和SBF27对茄腐皮病镰孢霉,SBF08和SBF32分别对烟草赤星菌和草燕麦镰孢霉的抑制率都在60%以上,抑菌活性最强的是SBF27对苹果干腐病菌的抑制,抑制率为71.37%｡观察发现,培养滤液抑菌活性较高的一般都使病原菌菌落长势变慢,气生菌丝减少,显微镜下可见菌丝变短,末端膨大且少有分枝｡而对照菌丝生长正常,菌丝粗壮,分枝较多且有大量分生孢子产生｡通过比较培养滤液抑菌活性测定和对峙培养的结果发现,培养滤液抑菌活性较高的菌株原来在对峙培养中抑菌率也高且有抑菌带产生,如菌株SBF08对苹果干腐病菌的抑制等,说明这些菌株对相应病原菌的抑菌活性物质是分泌到菌丝外的｡但同时也发现,有些在对峙培养中抑菌率较高但无抑菌带产生的菌株,其培养滤液对相应病原菌的抑菌活性却比较低,如菌株SBF11对苹果干腐病菌的抑制等｡这说明它们对相应病原菌的抑制可能是借菌丝的快速生长优势,与病原菌争夺空间和营养而产生抑菌作用的｡3 结论与讨论对商洛黄芩内生菌的分离鉴定和抗植物病原菌活性测定结果表明,商洛黄芩内生菌具有丰富的多样性,属种分布在根､茎､叶中存在明显差异,活性菌株的比例也较高;实验显示隶属于不同属的菌株对同一病原菌表现出不同程度的拮抗活性,而同一属的菌株其抗菌范围以及抗菌活性既相似又有差异｡黄芩内生菌的多样性和抗菌活性的选择性表明其可以作为生防农药开发的重要资源｡实验筛选出了6株高活性的菌株,其中,SBF02(镰刀菌属)和SBF06(青霉属)对棉立枯病菌抑制效果较好;SBF08(木霉属)和SBF27(链格孢属)对苹果干腐病菌抑制效果较好;SBF11(头孢霉属)和SBF27(链格孢属)对茄腐皮病镰孢霉抑制效果较好;SBF08(木霉属)和SBF32(链格孢属)分别对烟草赤星病菌和草燕麦镰孢霉抑制效果较好｡这些菌株的种的鉴定有待进一步研究,如用分子标记方法进行聚类分析等｡内生菌对病原菌抑制作用有各种表现形式,在本实验中,对峙试验产生抑菌带的菌株其培养滤液的抑菌活性也较高,病原菌在活性物质的作用下,菌落萎缩,菌丝断裂､消解｡关于活性物质的具体成分､性质和对病原菌的作用靶点需要进一步提取和分析研究｡内生真菌在黄芩中属种分布的组织差异性可能是由于不同组织的结构､营养､代谢特征等内部环境有别,不同的内生菌在黄芩生长过程中承担的作用不同,因而使内生菌在不同的部位定植｡值得注意的是,正是由于内生菌和植物建立了密切的生态关系,一旦从寄主植物中分离出来后,自身的一些特性也会随之改变[13]｡如在试验中经常会发现,有些活性菌株经多次转接培养或长时间保存后出现菌种退化､抗菌活性降低等现象,这可能是人工培养基成分和保存条件与植物组织的差异所致｡因此,还应对活性菌株的生理生化特性进行测定,以确定内生菌离体培养､保存以及产生活性物质的最适条件,为生防农药开发奠定基础｡参考文献:[1] 史应武,娄恺,李春.植物内生菌在生物防治中的应用[J].微生物学杂志,2009,29(6):61-64.[2] 石晶盈,陈维信,刘爱媛.植物内生菌及其防治植物病害的研究进展[J].生态学报,2006,26(7):2395-2400.[3] 刘霞,党峰峰,贺晓龙,等.陕北野生甘草内生菌的分离及抑菌活性筛选[J].西北植物学报,2010,30(10):2110-2115.[4] 刘建玲,陈宝宝,刘永红,等.半夏内生菌的分离与初步鉴定[J].中国中药杂志,2009,34(18):2304-2307.[5] 张雪兵,史应武,王晓霞,等.醉马草内生菌的分离､鉴定及杀虫效果[J].微生物学报,2010,50(4):530-536.[6] 李青莲,苏红,池维丹,等.野生黄芩内生真菌的分离鉴定及抗菌活性筛选[J].微生物学通报,2010,37(3):381-388.[7] 王建美,田呈明,过颂新,等.黄栌根内生真菌分离鉴定及拮抗真菌筛选[J].菌物研究,2008,6(1):35-39.[8] 方中达.植病研究方法[M]. 第三版.北京:中国农业出版社,1998. 124-125.[9] 魏景超.真菌鉴定手册[M].上海:上海科学技术出版社,1979.[10] 邢来君,李明春.普通真菌学[M].北京:高等教育出版社,1991.[11] 邓振山,赵龙飞,张薇薇,等.银杏内生真菌的分离及其对苹果腐烂病病原菌的拮抗作用[J].西北植物学报,2009,29(3):608-613.[12] 王伟,翟梅枝,徐文涛,等.核桃内生菌的分离及代谢产物活性研究[J]. 西北农业学报,2008,17(1):77-81.[13] 蔡永欢,花日茂,柏钰,等.喜树内生真菌的分离及其对植物病原菌的抑菌活性测定[J].安徽农业大学学报,2010,37(4):748-752.。

常用的几种典型的病原菌分离方法1．斑点病原菌的分离从病斑部分切取每边3～5 mm的小块组织，在70％酒精中浸数秒钟后，移入0.1％的升汞水溶液中处理3～5 min，以灭菌水冲洗3次，移置培养皿的培养基中，然后培养。

2．维管束组织内病原菌的分离从根茎维管束组织分离病菌，可先将寄主病部表面用70％酒精擦拭消毒，将表皮组织用灭菌的解剖刀削去，然后切取其中小块变色的维管束组织，用升汞或漂白粉液消毒后。

，用灭菌水冲洗几次，移置培养基面上。

3．根腐病病原菌的分离根腐或基腐病的分离，由材料的大小决定。

材料小的可仿照斑点病的分离法，材料大的则可以用维管束组织内病原的分离法。

4．肉质组织中病原菌的分离多肉的根、茎及果实等，可以采用维管束组织内病菌分离法除去表面组织，切取小块病组织分离。

如有杂菌感染可采用“直接接种”法，待出现症状后，用此法再行分离。

5．种子内病原菌分离将整个种子或者种子的一部分进行表面消毒(升汞或漂白粉)，用灭菌水洗涤后，移置培养基上。

6．孢子分离法能产生大量孢子的病菌如青霉素、链格孢等，则可配制成孢子悬浮液以稀释法或划线法分离之。

7、土壤带菌分离法为了研究一些真菌在土壤中存活和分布的情形，从有病的土壤中分离它们是必要的。

分离方法是将土壤取出少许，配制成悬浮液，然后用稀释法或划线法分离。

附录2 真菌单孢子分离技术一、目的要求了解单孢分离技术的基本原理，掌握简便实用的单孢分离方法。

二、基本原理单孢分离的方法很多，如振落法、稀释法和直接挑取法。

振落法和稀释法的共同点都是采用某种方法，使真菌孢子较稀疏地分散在水琼脂平板上，然后在显微镜下检查寻找在水琼脂平板表面的单个孢子，一旦找到理想的单个孢子，就通过无菌操作将其(连同一部分培养基)移植到PDA斜面培养基上，置适温下培养，形成的菌落即为单孢系菌株。

直接挑取法是在实体解剖镜下直接挑取单个孢子进行分离纯化的方法。

三、材料、用具与仪器1．材料(依本地资源情况进行选择，下列材料供参考)(1) 稻瘟病叶、病节、病穗颈(Pyricolaria oryzae)。

青海盐湖地区嗜盐菌的分离纯化及抑制植物病原菌的活性初探沈硕;王舰【摘要】以番茄灰霉菌(Botrytis cinerea)、菊芋菌核菌(Jerusalem artichoke Sclerotium)、油菜菌核菌(Sclerotinia sclerotiorum)、辣椒疫霉菌(Phytophthora capsici)、蚕豆根腐菌(Fusarium solani)及豌豆根腐菌(Aphaomyces euteiches Dreehsler)等6种植物病原真菌为供试菌株,采用滤纸片法对植物病原菌提取液的抑菌活性进行了测定.为了获得对这几种植物病原菌具有较高抑制作用的嗜盐菌菌株,对供试菌株进行了液体发酵及发酵液的活性筛选.经滤纸片法测定,青海盐湖嗜盐菌菌株对辣椒疫霉菌具有较强的拮抗作用,并用最小抑制浓度法(MIC)测定了嗜盐菌提取物对辣椒疫霉菌的最小抑菌浓度范围为9～12 mg/mL.【期刊名称】《广东农业科学》【年(卷),期】2013(040)001【总页数】4页(P79-81,88)【关键词】嗜盐菌;次级代谢产物;滤纸片法;抑菌活性【作者】沈硕;王舰【作者单位】青海省农林科学院生物技术研究所/青藏高原生物技术教育部重点实验室,青海西宁810016【正文语种】中文【中图分类】S482.2+92盐湖广泛分布于世界各地，是嗜盐微生物高度集中的极端环境。

目前被重点研究的盐湖有美国的大盐湖，肯尼亚的死海和马加迪湖。

我国新疆维吾尔自治区和青海省也有大量的盐湖分布。

研究表明，盐湖中微生物多样性极为丰富，存在着大量高密度的未知微生物资源[1]。

其中，拮抗微生物的生物防治方法近年来日益受到重视。

理论研究方面,人们对嗜盐菌的嗜盐机理尤感兴趣,生存在极端环境中的微生物,通常是通过代谢作用适应其所处生境而得以存活并发挥作用,集中表现在细胞膜、细胞壁结构性成分和功能性成分的稳定性、反应动力学、酶系的性质、代谢途径及信息传递、蛋白质核酸成分及构象等方面为了适应高盐环境而具有的特异性。

病菌的培养方法有哪些
病菌的培养方法有以下几种：
1. 纯培养法：将病菌采样涂布在含有特定营养物质的培养基上，利用单菌点病斑法或无菌平展法培养，以获得纯种病菌的培养。

2. 片状培养法：将病组织切片分别培养在适宜的培养基上，利用病组织上的病斑来培养病菌，通常适用于无法直接培养的病原体。

3. 组织培养法：将感染病变的植物组织分离、继代培养，可得到含有病原菌的组织。

4. 细胞培养法：将病变的植物组织继代培养在含有特定细胞系的培养基上，利用细胞上的病斑来培养病菌。

5. 动物接种法：将病菌接种到合适的实验动物体内，通过观察动物的生理反应、组织病变等来检测病菌的存在。

6. 体外接种法：将病原体接种在适宜的无菌培养基或培养液中，通过培养基中的增殖、病变形成或产物的检测来验证病菌的存在。

以上是常用的一些病菌培养方法，根据具体的实验目的和病菌的特性，选择合适
的培养方法可以有效地获得纯种病菌。

实验概要分离、纯化及初步鉴定土壤中的拮抗植物病原菌的放线菌。

实验原理土壤是微生物的“天然培养基”，也是最丰富的菌种资源库，我们可以从中分离出众多放线菌，尤其是可以从耕作土壤中筛选出拮抗植物病原菌的放线菌。

以耕作有武运粳和苏沪香粳的土壤为样品，应用稀释涂布平板法分离各种微生物。

菌落计数后，通过菌落形态观察并挑取放线菌进行划线分离纯化，多次重复后得到单菌落。

在进行放线菌形态等初步鉴定后，将纯化的菌株接入斜面传代保藏。

最后，分离纯化的放线菌，初步鉴定其拮抗性。

拮抗植物病原菌的放线菌的分离纯化在农业增产、作物种植等方面都有着重要的意义。

主要试剂1. 培养基：高氏1号培养基、马铃薯葡萄糖培养基、牛肉膏蛋白胨培养基、葡萄糖蛋白胨水培养基2. 其他试剂：银染液A液B液（细菌鞭毛染色） 40%KOH 5%α-萘酚（V.P.实验）主要设备培养皿试管锥型瓶接种环移液管震荡器电炉载玻片超净工作台恒温培养箱高压蒸汽灭菌锅显微镜等实验材料土样：苏沪香粳1，2组杨稻6号93113，4组武运粳5，6组实验步骤1.稀释涂布平板法(Spread Plate Method)稀释涂布平板法是一种将菌体按比例制备成若干个稀释度，再分别经涂棒涂布培养而进行微生物分离纯化的方法。

(1) 倒平板；(2) 制备土壤稀释溶液连续不断稀释，得到不同稀释度的土壤溶液；(3) 涂布分别吸取三种稀释度菌液，均匀涂于培养基表面；(4) 培养；(5) 划线分离，直到获得纯培养。

2. 平板菌落计数法平板菌落计数法是根据微生物在固体培养基上所形成的一个菌落是由一个单细胞繁殖而成的现象进行的，也就是说一个菌落即代表一个单细胞。

计数时，先将待测样品作一系列稀释，再取一定量的稀释菌液接种到培养皿中，使其均匀分布于平皿中的培养基内，经培养后，由单个细胞生长繁殖形成菌落，统计菌落数目，即可换算出样品中的含菌数。

这种计数法的优点是能测出样品中的活菌数。

此法常用于某些成品检定（如杀虫菌剂），生物制品检定以及食品、水源的污染程度的检定等。

茶叶通讯　第48卷　第2期Journal of Tea Communication Vol.48, No.2投稿平台：一株茶轮斑病病原菌的分离鉴定及致病力卢声洁1，赵兴丽2，罗林丽2，程宇豪1，张金峰3，李　帅3，周玉锋2*1. 贵州大学 茶学院，贵州 贵阳 550025；2. 贵州省农业科学院 生物技术研究所，贵州 贵阳 550006；3. 贵州省农业科学院 茶叶研究所，贵州 贵阳 550006摘　要：为明确发生于贵州省湄潭县茶叶所茶树资源圃中的茶轮斑病病原，采用单孢分离法和离体接种法对病原菌进行分离和致病性测定，分别观察形态学特征及结合分子生物学技术以确定病原菌的种类。

结果表明，菌株ZYP04-5能够侵染茶树叶片，是茶轮斑病的致病菌；形态学特征结合病原菌的ITS 、β-tubulin 和 tef1基因分析结果确定引起茶轮斑病的病原菌为卵圆新拟盘多毛孢（Neopestalotiopsis ellipsospora ）。

研究结果可为该病菌引起的茶轮斑病的防控提供理论基础。

关键词：茶树；茶轮斑病；卵圆新拟盘多毛孢；致病性中图分类号：S571.1 文献标识码：A 文章编号：1009-525X （2021）02-253-258Isolation, Identification of a Pathogen of Tea Gray Blight and ItsPathogenicityLU Shengjie 1，ZHAO Xingli 2，LUO Linli 2，CHENG Yuhao 1，ZHANG Jinfeng 3，LI Shuai 3，ZHOU Yufeng 2*1. Tea College, Guizhou University, Guiyang 550025, China;2. Institute of biotechnology, Guizhou Academy of Agricultural Sciences,Guiyang 550006, China; 3. Tea Research Institute, Guizhou Academy of Agricultural Sciences, Guiyang 550006, ChinaAbstract ：In order to identify the pathogen of tea gray blight that occurred in the tea resource nursery of Tea Research Institute in Meitan County, Guizhou Province. The single spore isolation method and in vitro inoculation method were used to isolate the pathogen and determine its pathogenicity. Morphological characteristics and combination of molecular biological technology were observed to determine the species of pathogen. The results showed that the strain ZYP04-5 could infect the leaves of tea plants, and it was the pathogen of tea gray blight; The morphological characteristics combined with analysis results of the pathogens of ITS, β-tubulin and tef1 genes to determine the pathogen causing tea gray blight was Neopestalotiopsis ellipsospora . The research can provides a theoretical basis for the prevention and control of tea gray blight caused by this pathogen.Key words ：Tea plant, Tea gray blight disease, Neopestalotiopsis ellipsospora , Pathogenicity收稿日期：2020-10-10 修订日期：2021-04-14基金项目：国家现代农业（茶叶）产业技术体系建设专项（CARS-19），黔科合平台人才（[2017] 5717号）作者简介：卢声洁（1995-），女，贵州兴义人，在读硕士研究生，研究方向：茶树病害防控。

湘西地区猕猴桃溃疡病病原菌分离及其全基因组分析杨睿;汪琳罗沙;姚迪;唐蕴哲;张婧一;彭清忠【期刊名称】《微生物学杂志》【年(卷),期】2024(44)1【摘要】通过了解湘西地区猕猴桃溃疡病致病菌分类地位和基因类型,初步探讨其致病的分子机理。

采用纯培养法分离猕猴桃溃疡病菌;基于16S~23S rRNA基因内转录间隔序列进行病原菌的系统发育分析;通过基因组测序和生物信息学分析解析其致病的分子机理。

从“米良1号”和“红阳”猕猴桃感病枝条中分离获得5株溃疡病菌,编号为L211、L212、L321、L322、L323;通过形态特征和16S~23S rRNA基因内转录间隔序列分析,鉴定5株细菌均为丁香假单胞菌猕猴桃致病变种(Pseudomonas syringae pv.actinidae,Psa)。

以菌株L211为代表进行体外猕猴桃枝条接种实验表明能引起典型溃疡病症状。

通过菌株L211的全基因组测序和生物信息学分析,获得5741条基因数目,长5412072 bp;基因功能注释发现菌株L211携带121种毒力因子、71个植物互作因子和77个耐药基因;同时,基因组单核苷酸多态性分析发现病原菌L211为基因Ⅲ型Psa。

引起湘西地区猕猴桃溃疡病的病原菌是丁香假单胞菌猕猴桃致病变种基因Ⅲ型,与国内外报道的引起猕猴桃溃疡病大流行的致病菌一致。

猕猴桃溃疡病发病原因可能是病原菌的多种毒力基因和互作基因协同作用的结果。

【总页数】10页(P58-67)【作者】杨睿;汪琳罗沙;姚迪;唐蕴哲;张婧一;彭清忠【作者单位】吉首大学生物资源与环境科学学院【正文语种】中文【中图分类】Q93-331【相关文献】1.秦岭北麓猕猴桃主产区溃疡病病原菌的分离与鉴定2.湘西地区猕猴桃细菌性溃疡病抗性资源筛选及其抗性机理研究3.桑细菌性枯萎病病原菌的分离鉴定与全基因组序列分析4.湘西州猕猴桃溃疡病发病情况及其影响因素分析5.陕西省猕猴桃溃疡病病原菌分离鉴定及分型研究因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

实验一常见植物病原菌物形态观察一实验目的认识和掌握常见植物病原菌物的分类特征。

二实验内容在显微镜下观察下列菌物形态（1）假霜霉属（Pseudoperonospora ）孢囊梗、孢子囊（2）盘梗霉属（Bremia）：孢囊梗、孢子囊、孢囊孢子（3）霜疫霉属（Peronophythora）：孢囊梗、孢子囊（4）根霉属（Rhizopus）：假根、匍匐丝、孢囊梗、孢囊孢子、接合孢子（永久玻片）（5）单孢锈菌属（Uromyces）冬孢子，夏孢子（6）镰刀菌属(Fusarium)：分生孢子（7）壳二孢属（Ascochyta）：分生孢子器、分生孢子示范片：（1）核盘菌属（Sclerotinia）子囊盘，子囊，子囊孢子（永久玻片）（2）炭疽菌属（Colletotrichum）：分生孢子盘、分生孢子三实验方法1．培养菌（1）在载玻片上滴一滴水；（2）用镊子或挑针从培养皿中取少量的霉状物置于载玻片上水滴中；（3）用镊子和解剖针将霉状物分散开；（4）盖上盖玻片后放到显微镜下观察。

2．浸泡标本（1）在载玻片上滴一滴水；（2）用镊子或挑针从病斑处取少量霉状物置于载玻片上水滴中；（3）用镊子和解剖针将霉状物分散开；（4）盖上盖玻片后放到显微镜下观察。

3．病征为粉状物的浸泡标本：（1）在载玻片上滴一滴水；（2）用镊子或挑针从病斑处取少量粉状物置于载玻片上水滴中；（3）用镊子和解剖针将粉状物分散开；（4）盖上盖玻片后放到显微镜下观察。

4．病征为粒状物的浸泡标本：（1）在载玻片上滴一滴水；（2）用镊子取一小块有病菌生长的病斑组织，或在病斑处取明显的粒状物置于载玻片上水滴中；（3）用镊子和解剖针将病斑组织分散开后，盖上盖玻片后放到显微镜下观察；（4）然后轻轻敲击盖玻片，压迫分生孢子器以释放分生孢子，放到显微镜下再次观察。

四病原菌的主要形态特征1．假霜霉属（Pseudoperonospora ）：黄瓜霜霉病菌孢囊梗无色，无分隔，不对称状分枝，有限生长，分枝末端尖锐；孢子囊褐色椭圆形，顶端有乳状凸起，着生在孢囊梗顶端或已脱落。

几种罹病植物镰刀菌(Fusarium)种类鉴定前言镰刀菌无性时期在分类上原属于半知菌亚门，根据《菌物词典》2001年第9版现属于无性真菌类,有性时期为子囊菌门。

镰刀菌因其在无性阶段产生的大型分生孢子形似镰刀而称之。

镰刀菌属是在1809 年Link从锦葵科植物上发现第一株镰刀菌定名为粉红镰刀菌(Fusarium roseum Link)的基础上建立起来的[1]。

镰刀菌种类多，迄今已发现44 种和7个变种[2]。

它们分布极广，在地球上所能及的地方，几乎都能找到它的踪迹。

镰刀菌历来是真菌学和植病学的主要研究对象之一。

镰刀菌对农业生产具有重要经济意义，其中的许多种是重要的植物病原菌，往往使农作物遭受重大病害，如麦类赤霉病、棉花枯萎病、水稻恶苗病、玉米青枯病、甘薯蔓割病、瓜类枯萎病等[4]，导致农业生产损失严重，甚至颗粒无收。

人类栽培的各种作物如稻、麦、棉、麻、油、茶、果树和蔬菜等，均易受到镰刀菌的侵袭而发生各种病害[4 ~ 7]。

许多重要的萎蔫病害曾在世界范围内造成许多毁灭性的植物病害。

前苏联曾有报道，当种植的甘蓝为感病品种时，镰刀菌所引起的萎蔫病害可使产量降低50%-95%。

在前苏联亚麻种植区亚麻萎蔫病发生也极为普遍，且有病的亚麻种子油是有毒的，会引起人畜中毒。

花卉植物如紫苑、石竹等等也遭受萎蔫病的损害[8]，有时危害严重到需要停止栽培的地步。

除上述病害外，镰刀菌也是根腐病和各种农作物及其他植物贮存期间腐烂病的重要病原，被污染的食品和饲料含有毒质，常使人类和家畜中毒[12]。

此外，镰刀菌可引起动物病害，如镰刀菌产生的有毒代谢产物—镰刀菌毒素（Fusariotoxin）毒性很强，污染人类食品和禽畜的饲料，会造成雏鸡、鸭、鹅、鸽子、黄牛、水牛、猪、羊、马、驴等禽畜镰刀菌毒素中毒，是常见的病害。

镰刀菌作为病原微生物也能侵入人体，引起人类的真菌病。

如茄病镰孢等镰刀菌可引致人足部溃疡、眼角膜溃疡和大骨节病等。

镰刀菌产生的毒素物质可引起人和动物的急性或非急性中毒，甚至死亡。

病害诊断技术快速准确地判断病害种类和病因病害诊断技术是农业领域中一项重要的技术手段，它能够帮助农民和专业人员快速准确地判断病害的种类和病因，从而采取相应的防治措施。

本文将介绍几种常见的病害诊断技术，包括生理学方法、病原学方法和遗传学方法。

一、生理学方法生理学方法是通过观察植物的生长发育过程和生理反应来判断病害的种类和病因。

例如，植物在感染病害后，会出现不同程度的生长发育异常、叶片变色、萎蔫等症状，通过观察这些症状可以初步判断病害的种类。

此外，可以通过检测植物体内的一些生理指标，如叶绿素含量、酶活性等来辅助病害诊断。

生理学方法能够快速初步地确定病害的种类，但对于病因的确定有一定的局限性。

二、病原学方法病原学方法是通过检测病原体（如细菌、真菌、病毒等）来判断病害的种类和病因。

这种方法一般需要采集植物感染部位的病组织，进行病原菌的分离鉴定和复繁培养，并通过生物学、生化、分子生物学等方法进行病原学鉴定。

通过病原学方法可以准确地鉴定出病害的种类和病因，为后续的防治工作提供了有力的支持。

三、遗传学方法遗传学方法是通过检测植物在遗传水平上的变异来判断病害的种类和病因。

这种方法主要通过分析植物的遗传多样性以及植物和病原体之间的相互作用来识别抗病基因和病害相关基因。

遗传学方法可以通过遗传分析和分子标记技术来进行，能够更全面地了解植物与病害之间的关系，为病害的防治提供科学依据。

综上所述，病害诊断技术具有重要的应用价值。

生理学方法能够快速初步地识别病害的种类，病原学方法能够准确地鉴定病害的种类和病因，遗传学方法能够更全面地了解植物与病害之间的关系。

在实际应用中，可以根据具体的情况综合运用这些方法来进行病害诊断，从而采取有针对性的防治措施，保障农作物的生长发育和产量。

因此，加强病害诊断技术的研发与应用，对于农业生产的发展具有重要的意义。