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病原菌分离方法一、实验原理：植物患病组织内的真丝菌丝体，如果给予适宜的环境条件，除了个别种类外，一般都能恢复生长和繁殖。
植物病原菌的分离就是指通过人工培养，重染病植物组织中将病原真菌与其他杂菌相分开并从寄主植物中分离出来，再将分离得到的病原菌于适宜环境内纯化，这个过程总称植物病原的分离培养。
二、实验用具：酒精灯、手术剪、镊子、75%酒精、3%~5%次氯酸钠、灭菌水、培养皿、封口膜、乳酸等三、实验前的准备工作：1、煮培养基（PDA）：马铃薯200g,葡萄糖20g，琼脂粉(AGAR)20g（10:1:1）水1000ml（1）将去皮称量好的马铃薯切片后加水煮沸15~20min（水可以适量多加200ml 左右，因为在煮的过程中会蒸发一些），待土豆煮软即可。
（2）三层纱布滤去马铃薯后将过滤的水倒入洗净的锅中，加琼脂粉搅拌充分后再加热煮沸，小火使其充分融化。
（3）加入葡萄糖并不断搅拌，待其完全融化后双层纱布过滤，定容到1000ml，分装到500ml的玻璃瓶内，每个玻璃瓶最多装300ml，121℃湿热灭菌30min。
2、培养皿干热灭菌170℃1h;蒸馏水、枪头等湿热灭菌121℃30min。
四、实验步骤：1、用75%酒精擦拭超净工作台，所有器具用紫外灯灭菌30min,分离室要保持清洁。
2、取样，病斑大小约20个（含病缘线）3、分装培养基：（1）融PDA，松盖在微波炉中加热约3min（看量多少而定）（2）待冷却至50℃后在超净工作台指示灯显绿灯时分装(3) 分装时滴入一管乳酸约20滴（每10ml培养基中加3滴乳酸）（4）左手拿培养皿并将皿盖在火焰附近打开一缝，迅速倒入培养基约15m1(300ml一瓶的培养基倒20多个平板)，加盖后轻轻摇动培养皿，使培养基均匀分布在培养皿底部，然后平置于桌面上，待凝后即为平板。
4、表面消毒：（1）75%的酒精3ml~4ml没过样表面10s，快速吸掉酒精（2）3%~5%次氯酸钠（现配现用、避光）10ml消毒2~3min（3）无菌水冲洗2~3次5、转样：（1）器具经酒精灯消毒后无菌水水洗（2）培养皿上写明名称、分离时间后，在酒精灯旁转五点于培养基上。
植物病原细菌的分离、纯化及鉴定1实验目的及意义植物病原菌的分离、鉴定是植物病理学实验最基本的操作技术之一，通过本实验，要求掌握植物病原菌分离培养、纯化鉴定的一般原则和方法。
2实验材料及准备2.1 实验材料：新发病的植物组织2.2 培养基准备（LB培养基）：胰蛋白胨1%，NaCl 1%，酵母浸粉0.5%，pH7.0-7.2，121℃灭菌20 min，备用。
2.3 实验用具：载玻片、盖玻片、酒精灯，手术剪，镊子，培养皿（Φ9cm），斜面培养基，灭菌水，1% NaClO，打火机。
3 实验方法及步骤3.1 植物样品的采集选取发病初期植株，样本尽量保持完整，至少包含病健交界处；将样品放入纸袋保存或邮寄，并做好记录；需要分离的标本应尽快完成分离工作（1-5d），长期保存需压干，未压干的标本勿装塑料袋。
3.2 发病组织的显微检查准备好洁净的载玻片、盖玻片和水；取小的整块标本洗净、晾干/吸干；切取约2×4mm大小病健交界组织；从上述组织中切取尽可能薄的小片平放在载玻片上；加一滴水，盖好盖玻片，防止气泡；先用低倍镜(4×，10×)检查，看到白色、半透明、雾状的喷菌现象；换用40倍物镜观察，看到杆状、透明、活动的菌体，证明的确为细菌性病害。
3.3 病原物的分离和培养选取镜检有喷菌现象的组织进行划线分离：所取组织用自来水洗净，吸干；（以下进入超净工作台操作）将植物组织剪成1×4mm的大小，1%的次氯酸钠消毒2-10min，灭菌水洗2-3次；将组织从病斑处剪碎放入约0.5-1ml水中，并让组织碎块在水中浸泡5-15min，让细菌释放到灭菌水中；取病汁液1-3环，在LB平板上划线。
28℃温箱中培养，每天观察菌落生长情况并记录：菌落长出的时间、菌落大小、颜色、形态。
3.4 病原物的纯化和保存3-4 d后选取生长量较多且形态一致的菌落，LB平板上划线纯化。
若仍然生长不纯，则需多次纯化。
病原物的分离培养和纯化摘要：本实验采用组织分离法，在无菌操作条件下对一种山茶树叶部病原真菌进行分离培养和纯化。
该实验在PDA平板培养基的四个方向上各放置一片新鲜的病叶组织（3mm×3mm），四片病叶组织用0.1％升汞液消毒，时间分别为10s、15s、20s、25s。
设两组重复4d后观察发现，一个PDA平板培养基四个方向上都长出了菌落，而另一个只有10s和15s方向长出了菌落。
长出的菌落均较为单一，但观察可知消毒15s得到的菌落病原真菌生长最良好，因此15s 的消毒时间比较适合于这种真菌的分离。
在无菌条件下，用接种铲从消毒时间为15s的菌落边缘挑取两小块分别移入两支斜面试管培养基，在25℃左右恒温箱内培养，几天后，都被细菌污染了。
关键词:山茶病叶，真菌，分离培养，纯化，PDA培养基，斜面试管培养基目的意义在研究病原菌的形态、生理、生态以及病原菌对寄主植物的致病性等多种试验中，常常需要病原菌的纯培养物。
然而，在自然情况下，病原菌通常是与其他杂菌混生在一起的，从受病组织或其他基物中将病原菌单独分选出来，叫做分离。
分离和培养是植病实验室最基本的操作技术之一，了解其基本原理及方法，对植物病害描述、鉴定、命名以及植物病害接种体的培养等很多经常接触或者要使用到的试验操作步骤和研究手段都是很有帮助的。
通过本实验，我们可以了解植物病原菌分离培养和纯化的基本原理和方法，掌握实验室常用的消毒与灭菌方法，掌握培养基的制作和无菌操作技术。
1材料与方法1.1 试验材料1.1.1供试材料新鲜山茶树真菌病叶叶片1.1.2 试验仪器与用品真菌培养基、水、超净工作台、灭菌培养皿、试管、玻璃棒、铁架台、棉花、纱布、烧杯、接种铲、70％酒精、0.1％升汞、胶头滴管、天平、无菌水、酒精灯、火柴、镊子、剪刀、试管塞、报纸、扎绳、记号笔、不锈钢锅、电磁炉、高压锅蒸汽灭菌锅、恒温培养箱等。
1.2 试验方法1.2.1试管的制作用棉花和纱布制作试管塞，要求拔出时有明显声音，盖上时端部留3分之一且膨大，能够阻止杂菌的进入，拔出时力度合适。
植物病原真菌的分离培养精选文档TTMS system office room 【TTMS16H-TTMS2A-TTMS8Q8-实验十三植物病原真菌的分离培养一、实验原理植物患病组织内的真菌菌丝体，如果给予适宜的环境条件，除个别种类外，一般都能恢复生长和繁殖。
植物病原菌的分离就是指通过人工培养，从染病植物组织中将病原真菌与其它杂菌相分开，并从寄主植物中分离出来，再将分离到的病原菌于适宜环境内纯化，这个过程总称植物病菌的分离培养。
植物病原真菌的分离一般都是采用组织分离法，就是切取小块病组织，经表面消毒和灭菌水洗过后，移到人工培养基上培养。
二、实验目的：植物病原菌的分离培养是植物病理学实验最基本的操作技术之一，它对原害鉴定，病原形态观察、植物病害接种体的培养等方面都是经常使用的研究手段。
通过本实验，要求植物病原菌分离培养的一般原则和方法。
三、实验材料及准备：1．分离材料：梨黑斑病（Alternaria kikuchiana），柿树圆斑病（Pestnlotia sp）及杉木炭疽病（Glomerella cingolata）新发病的病叶；杨树烂皮病（Cytospora chrysosperma）国槐腐烂病（Dothiorella sp.）的带有新病斑的枝条；油松种子。
2．分离用具（每小组为单位）酒精灯4个，手术剪4把，眼科镊4把，PDA培养基3瓶，培养皿（Φ9cm）24套，小烧杯（5ml）4个，大烧杯1个，斜面培养基12管，灭菌水4瓶，75%酒精瓶1个（内放脱脂棉球）%升汞瓶1个，5%乳酸瓶（60ml）1个，火柴1盒，湿、干纱布各4张。
四、实验方法及步骤：（一）、分离前的准备工作：1．工作环境的清洁和消毒分离培养一般在无菌室、无菌箱或无菌工作台（超净工作台）上进行，无菌室和无菌箱要经过喷雾除尘，并用药物或紫外线照射消毒（常用消毒药物为70%酒精，2%煤酚皂液，5%石炭酸液等喷雾。
若用紫外线灯照射则需20-30分钟）。
病原物的分离与培养病原物的分离与培养在植物病害的研究中具有重要意义;分离、培养病原菌的方法是植物病理学研究工作中最常应用的实验技术..一方面;在一个新的病害研究中;通过分离与培养获得病原物的纯培养;完成柯氏法则;以明确该病病原；研究病原物的生物学特性和病害循环侵染、病程等等..所谓病原物的分离;即把该病原菌从发病组织上与其他微生物分开；所谓病原物的培养;即将分离的病原菌移到可以让这种病原菌正常生长的营养基质即培养基上;从而获得其纯培养..病原物的分离与培养;需经以以几个步骤:1.有关器皿的灭菌和消毒；2.制作培养基；3.病原菌的分离4.病原菌的培养..－、灭菌与消毒灭菌与消毒是两个不同的概念..灭菌则是指杀死一切微生物的营养体和孢子..消毒一般是指消灭病原菌和有害微生物的营养体;在植物病理学实验中;需要进行纯培养;不能有任何杂菌污染;因此对所用器材、培养基和工作场所都要进行严格的消毒和灭菌..消毒与灭菌的方法很多;一般可分为加热、过滤、辐射和使用化学药品等方法..一热力灭菌热力灭菌分干热灭菌和湿热灭菌两类..1．干热灭菌干热灭菌是利用高温使微生物细胞内的蛋白质凝固变性而达到灭菌的目的..细胞内的蛋白质疑固性与其本身的含水量有关..在菌体受热时;当环境和细胞内含水量越大;则蛋白质凝固就越快;反之含水量越小;凝固越慢..因此;与湿热灭菌相比;干热灭菌所需温度高160～170℃;时间长1～2 h..但干热灭菌温度不能超过180 ℃;否则包器皿的纸或棉塞就会烧焦;甚至引起燃烧..干热灭菌使用的仪器是烘箱..干热灭菌有火焰烧灼灭菌和热空气灭菌两种..火焰烧灼灭菌适用于接种环、接种针和金属用具如镊子等;无菌操作时酌试管口和瓶口也在火焰上作短暂烧灼灭菌..涂布平板用的三角玻棒也可在蘸有乙醇后进行灼烧灭菌..通常所说的干热灭菌是在烘箱内利用高温干燥空气160～170℃进行灭菌..此法适用于玻璃器皿如吸管和培养皿等的灭菌..进行干热灭菌要注意以下问题：物品不要摆得太挤;以免妨碍空气流通；灭菌物品不要接触烘箱内壁的铁板;以防包装纸烤焦起火；在升温过程中;如果红灯熄灭;绿灯亮;表示箱内停止加温；电烘箱内温度未降到70℃以前;切勿自行打开箱门以免骤然降温导致玻璃器皿炸裂..2 湿热灭菌1 高压蒸汽灭菌此法是将物品放在密闭的高压蒸汽灭菌锅内;0.1MPa;121℃保持15～30 min进行灭菌..时间的长短可根据灭菌物品种类和数量的不同而有所变化;以达到彻底灭菌..这种灭菌适用于培养基、工作服、橡皮物品等;也可用于玻璃器皿的灭菌..2 常压蒸汽灭菌在不具备高压蒸汽灭菌的情况下：常压蒸汽灭菌是一种常用的灭菌法..对于不宜用高压蒸汽灭菌的培养基如明胶培养基、牛乳培养基、含糖培养基等可采用常压蒸汽灭菌..这种灭菌方法可用阿诺氏流动蒸汽灭菌器进行;也可用普通蒸笼进行灭菌..由于常压;其温度不超过100℃;仅能使大多数微生物被杀死;而芽孢细菌却不能在短时间内杀死;因此可采用间歇灭菌以杀死芽孢细菌;达到彻底灭菌的目的..常压间歇灭菌是将灭菌培养基放人灭菌器内;每天加热100℃;30 min;连续3 d;第一天加热后;其中的营养体被杀死;将培养物取出放室温下18～24 h;使其中的芽孢发育成营养体;第二天再加热100℃;30 min;发育的营养体又被杀死;但可能仍留有芽孢;故再重复一次;使彻底灭菌..二过滤除菌许多材料例如血清、抗生素及糖溶液等用加热消毒灭菌方法;—均会被热破坏;因此采用过滤除菌的方法..应用最广泛的过滤器有：1 蔡氏过滤器该过滤器是由石棉制成的圆形滤板和一个特制的金属银或铝漏斗组成;分上、下两节..过滤时;用螺旋把石棉板紧紧夹在上、下两节滤器之间;然后将溶液置于滤器中抽滤..每次过滤必须用一张新滤板..根据其孔径大小;滤板分为3种型号：K型最大;作一般澄清用；EK滤孔较小;用来除去一般细菌；EK-S滤孔最小;可阻止大病毒通过..使用时可根据需要选用..2 微孔滤膜过滤器这是一种新型滤器;其滤膜是用醋酸纤维酯和硝酸纤维酯的混合物制成的薄膜..微孔滤膜过滤器是由上下二个分别具有出口和入口连接装置的塑料盖盒组成..出口处可连接针头;入口处可连接针筒..使用时将滤膜装入两塑料盖盒之间;旋紧盖盒;当溶液从针筒注入滤器时;此滤器将各种微生物阻留在微孔滤膜上面;从而达到除菌的目的..根据待除菌溶液量的多少;可选用不同大小的滤器..此法除菌的最大优点是可以不破坏溶液中各种物质的化学成分..但由于滤量有限;所以一般只适用于实验室中小量溶液的过滤除菌..实验室中用于除菌的微孔滤膜孔径一般为0.22μm;但若要将病毒除掉;则需更小孔径的微孔滤膜..微孔滤膜过滤除菌的主要操作步骤为：①组装、灭菌将0.22μm孔径的滤膜装入清洗干净的塑料滤器中;旋紧..压平;包装灭菌后待用0.1MPa、121.5℃灭菌：20 min..连接..将灭菌滤器的入口在无菌条件下;以无菌操作方式连接于装有待滤溶液注射器上;将针头与出口处连接并插入带橡皮塞的无菌试管中..②压滤将注射器中的待滤溶液加压缓缓挤压过滤到无菌试管中..滤毕;将针头拨出..压滤时;用力要适当;不可太猛太快;以免细菌被挤压通过滤膜..提示: 整个过程应在无菌条件下严格无菌操作以防污染;过滤时应避免各连接处出现渗透现象..三辐射灭菌紫外线灭菌是用紫外线灯进行的..波长为200～300 nm的紫外线都有杀菌能力;其中以260 nm的杀菌力最强..在波长一定的条件下;紫外线的杀菌效率与强度和时间的乘积成正比..紫外线杀菌机理主要是因为它诱导了胸腺嘧啶二聚体的形成和DNA的交联;从而抑制了DNA的复制..另一方面;由于辐射能使空气中的氧电离成O;再使O2氧化生成臭氧O3;或使水氧化生成过氧化氢H2O2..O3和H2O2有杀菌作用..紫外线穿透力不大;所以只适用于无菌室、接种箱的空气及物体表面的灭菌..注意事项: 紫外线对眼结膜及视神经有损伤作用;对皮肤有刺激作用;故不能直视紫外线灯光;更不能在紫外线灯光下工作..紫外线灯距照射物以不超过1.2 m为宜..此外;采用60Co-γ射线灭菌;也已广泛用于不能进行加热灭菌的纸、塑料薄膜;各种积层材料制作的容器以及医用生物敷料皮等的灭菌..γ射线灭菌的最大优点是穿透力强;可在厚包装完好条件下灭菌..四化学药品灭菌化学药品消毒灭菌法是应用能抑制或杀死微生物的化学制剂进行消毒灭菌的方法..能破坏细菌代谢机能并有致死作用的化学药剂为杀菌剂;如重金属离子等；只是阻抑细菌代谢机能;使细菌不能增殖的化学药剂为抑菌剂;如磺胺类及大多数抗生素等..化学药品对微生物的作用是抑菌还是杀菌以及作用效果还与化学药品浓度的高低、处理微生物的时间长短、微生物的种类以及微生物所处的环境等有关..植物病理学实验室中常用的化学药品有2％煤酚皂溶液来苏尔、0.25％新洁尔灭、0.1％升汞、3％～5％酌甲醛溶液、75％乙醇溶液等..消毒与灭菌不仅是从事植物病理学和整个生命科学研究必不可少的重要环节和实用技术;而且在医疗卫生、环境保护、食品、生物制品等各方面均具有重要的应用价值..根据不同的使用要求和条件选用合适的消毒灭菌的方法..附: 高压灭菌1、目的要求学习灭菌与消毒的基本原理及应用范围;学习高压蒸汽灭菌的操作方法..2、基本原理高压蒸汽灭菌是将待灭菌的物品放在一个密闭的加压灭菌锅内;通过加热;使灭菌锅隔套间的水沸腾而产生蒸汽..待水蒸气急剧地将锅内的冷空气从排气阀中排尽后关闭排气阀;继续加热;此时由于蒸汽不能溢出;而增加了灭菌器内的压力;从而使沸点增高;得到高于100℃的温度;导致菌体蛋白质凝固变性而达到灭菌的目的..在使用高压蒸汽灭菌锅灭菌时;锅内冷空气的排除是否完全极为重要..因为空气的膨胀压大于水蒸气的膨胀压;所以;当水蒸气中含有空气时;在同一压力下;含空气蒸汽的温度低于饱和蒸汽的温度..灭菌的温度及维持的时间随灭菌物品的性质和容量等具体情况而有所改变..例如含糖培养基用0.06 MPa、112℃灭菌15 min;但为了保证效果;可将其他成分先行121℃灭菌20 min;然后以无菌操作手续加入灭菌的糖溶液..又如盛于试管内的培养基以0.1MPa;121℃灭菌20 min；即可;而盛于大瓶内的培养基最好以0.1MPa、122℃灭菌30 min..实验中常用的非自控高压蒸汽灭菌锅有卧式和手提式两种..其结构和工作原理相同;本实验以手提式高压蒸汽灭菌锅为例;介绍其使用方法..全自动高压蒸汽灭菌锅在设定好有关的参数后;加温、放气、灭菌、干燥可一次完成;使用方法可参照厂家说明书..3、材料、试剂与仪器材料马铃薯葡萄糖培养基PDA..仪器与用具培养皿、手提式高压蒸汽灭菌锅、可调式电炉等..4、操作步骤1 首先将内层锅取出;向外层锅内加入适量的水;使水面与三角搁架相平为宜..提示：切勿忘记加水;同时加水量不可过少;以防灭菌锅烧干而引起炸裂事故..2 放回内层锅;并装入待灭菌物品..提示：注意不要装得太挤;以免防碍蒸汽流通而影响灭菌效果..三角烧瓶与试管口端均不要与桶壁接触;以免冷凝水淋湿包口的纸而透入棉塞..3 加盖并将盖上的排气软管插入内层锅的排气槽内..再以两两对称的方式同时旋紧相对的两个螺栓;使螺栓松紧一致;勿使漏气..4 用电炉加热并同时打开排气阀;使水沸腾以排除锅内的冷空气..待冷空气完全排尽后;关上排气阀;让锅内的温度随蒸汽压力增加而逐渐上升..当锅内压力升到所需压力时;调节电炉控温旋钮;维持压力至所需时间..本实验用0.1Mpa l21.5℃;20 min灭菌..提示：灭菌的主要因素是温度而不是压力..因此;锅内冷空气必须完全排尽后;才能关上排气阀;维持所需压力..5 灭菌所需时间到后;切断电源;让灭菌锅内温度自然下降;当压力表的压力降至“0”后;打开排气阀;旋松螺栓;打开盖子;取出灭菌物品..提示:压力一定要降到“0”后;才能打开排气阀开盖取物..否则会因锅内压力突然下降;使容器内的培养基由于内外压力不平衡而冲出烧瓶口或试管口;造成棉塞沾染培养基而发生污染..6 将取出的灭菌培养基放入25℃温箱培养48 h;经检查若无杂菌生长;即可待用..二、培养基的制作1、目的要求了解培养基的配制原理;掌握培养基的制备方法..2、基本原理在植物病理学研究工作中经常要使用各种不同的培养基..培养基是按照生物生长繁殖所需要的各种营养;用人工方法配制而成的营养基质..其中含有碳源、氮源、无机盐、维生素以及水分等..微生物在培养基上生长繁殖还必须在最适pH范围内才能生长得更好;因此;对不同种类的微生物应将培养基调节到一定的pH范围..－般而言;真菌调节到微酸;细菌调节到微碱..培养基的种类很多;不同的微生物所需要的培养基不同..依物理性状可分为液体的、固体的和半固体的三种..固体培养基是在液体培养基中加入1.5 %～2 %的琼脂;半固体培养基是加入0.2 %～0.5 %的琼脂..琼脂agar 起凝固作用;一般微生物均不能分解利用..根据营养物质来源的不同;培养基可分为天然、半合成和合成培养基三类..天然培养基是以自然界原有的有机物为材料经灭菌后制成;如马铃薯、胡萝卜、水果、大麦粒、高粱粒等..半合成培养基中既有一些天然的有机物质;又有一些成分简单或明确的化合物..如常用的马铃薯葡萄糖培养基PDA、肉汁胨培养基NA等..合成培养基是由一些成分明确的化合物配制而成的;无任何成分不明确的物质;常用于研究微生物的生理生化性状;如查氏Czapek培养基等..根据培养基用途不同;可分为生长繁殖培养基、富集培养基、贮存培养基、选择性培养基和鉴别培养基等..在植物病理学研究中;最常用培养基有马铃薯葡萄糖培养基;主要用于分离培养病原真菌..在培养基配制完之后;必须经过灭菌;以便彻底杀死其中原有的一切微生物..3、材料、试剂与仪器材料马铃薯..试剂葡萄糖、琼脂等..仪器与用品高压蒸汽灭菌锅、pH试纸或酸度计、试管、铝锅、搅拌棒、三角瓶、烧杯、漏斗、量筒、纱布、棉花、天平等..4、操作步骤PDA培养基马铃薯葡萄糖培养基马铃薯去皮200 g 、葡萄糖20 g、琼脂15～20g、蒸馏水1000 ml ;自然pH..在PDA培养基配方中也可用蔗糖代替葡萄糖;这样配制的培养基也称为PSA培养基..1 称量称量去皮马铃薯200 g;葡萄糖20 g;琼脂15～20 g..提示：琼脂加入的量取决于琼脂的质量;质量好的15 g就够了;质量差的应适当增加..另外;在夏天气温较高时;适当增加用量..2 将马铃薯切成小块;放入锅中;加水1000 ml;煮沸30 min..用纱布滤去马铃薯残渣..3 将马铃薯滤液放回锅中;加入琼脂;加热熔化..提示：在琼脂熔化的过程中;需要用玻璃棒不断搅拌;并控制火力不要使培养基溢出或烧焦..4 加入葡萄糖葡萄糖溶解后;加入适量的水以补充加热过程中损失的水分;定容至1000 ml..提示：通常在制作培养基的锅内用红蓝铅笔标记出不同体积的刻度;如1 000 ml、2000 ml等;在定容时直接将水加至已标记的刻度即可..5 分装根据不同的实验目的;可将配制的培养基分装于试管内或三角瓶内..分装试管;其量为管高的1／5;灭菌后制成斜面..分装三角瓶的容量以不超过三角瓶容积之一半为宜..6 加塞在管口或瓶口塞上棉塞..棉塞要用未脱脂的经弹松的棉花;棉塞可过滤空气;防止杂菌侵入并可减缓培养基水分的蒸发;故在植物病理学研究工作中普遍使用..正确的棉塞是形状、划、、松紧与管口或瓶口完全适合;过紧时妨碍空气流通;操作不便；过松则达不到滤菌的目的;且棉塞过小往往容易掉进试管内..正确的棉塞头较大;约有1／3在外;2／3在试管内..分装过程中注意不要使培养基沾染在管瓶口上以免浸湿棉塞;引起污染..7 包扎加塞后;将试管用线绳捆好;再在棉塞外包一层牛皮纸;以防止灭菌时冷凝水润湿棉塞;其外再用一道线绳扎好..用记号笔注明培养基名称、配制日期、组别、制作人等..8 灭菌将上述培养基以0.1MPa;121℃;高压蒸气灭菌20 min..9 搁置斜面将灭菌的试管培养基竖置冷至50℃左右以防斜面上冷凝水太多;将试管口端搁在玻棒或其他合适高度的器具上;搁置的斜面长度以不超过试管总长的一半为宜..培养基经灭菌后;必须放在37℃温箱培养24h;无菌生长者方可使用..PDA培养基一般不需要调pH..对于要调节pH的培养基;一般用pH试纸测定其pH..如果培养基偏酸或偏碱时;可用l mol／L NaOH 或l mol／L HCl溶液进行调节..调节时应逐滴加入NaOH或HCI溶液;防止局部过酸或过碱破坏培养基成分..5、流程图培养基配制高压灭菌培养观察三、病原菌的分离培养和纯化1、目的要求1 了解分离与纯化微生物的基本原理及方法..2 掌握倒平板的方法和组织分离、稀释分离、平板划线分离的基本操作技术..3 掌握在平板、斜面及液体培养基上培养病原菌及观察其培养性状的方法..2、基本方法植物病原真菌的分离方法主要有组织分离法和稀释分离法两种..最常用的方法是组织分离法;而稀释分离法主要用于病组织上产生大量孢子的病原真菌的分离..病原细菌的分离方法以划线分离法为最常用;在有些情况下也采用稀释分离法..为了获得分离菌的纯培养;必须要进行分离菌的纯化;纯化的方法类似于分离工作中采用的稀释分离法或划线分离法..3、材料、仪器与用具3.1 材料1 稻瘟病叶、病节、病穗颈Pyricularia oryzae..2 柑桔炭疽病Colletotrichum gloeosporioides..3 黄瓜灰霉病Botrytis cineria..4 番茄灰霉病果Botrytis cinerea..5 黄瓜菌核病果Sclerotinia sclerotiorum..6 黄瓜细菌性角斑病叶Pseudomonas syringaepv．1achryrnans ..7 水稻白叶枯病叶Xanthomonas campestris pv．oryzae ..8 白菜软腐病叶Erwinia carotovora subspp．carotovora..3.2．培养基PDA培养基；肉膏蛋白脉培养基；加寄主组织煎汁的培养基等..3.3．仪器与用品超净工作台、培养箱、培养皿、吸管、吸水纸、三角玻璃棒、剪刀、解剖刀、镊子、接种铲针、接种环铒、70％酒精、0.1％升汞、酒精灯、火柴、记号笔、橡皮筋套、可调式电炉、不锈钢锅等..4、实验操作一病原真菌的分离1．组织分离法其步骤为：1 取灭菌培养皿一个;置于湿纱布上;在皿盖上用玻璃铅笔注明分离日期、材料和分离人的姓名..提示：无菌操作应注意下面几点：工作前将所需的物品都放在超净工作台内；操作前用肥皂洗手;操作时还需用70 ％酒精擦拭双手；无菌操作时;呼吸要轻;不要说话..2 用无菌操作法向培养皿中加入25％乳酸1～2滴可减少细菌污染;然后将融化而冷至60℃左右的PDA培养基倒人培养皿中;每皿倒10～15 ml;轻轻摇动使之成平面..凝固后即成平板培养基..提示：加入25％乳酸1～2滴;可减少平板上出现污染细菌菌落..除乳酸外;在培养基中加入适当的抗菌素抑制细菌的生长;也是常用的方法..加青霉素20μg／m1可以抑制G+ 细菌生长；加多黏霉素B5.0μg／ml..可以抑制G-细菌生长；加链霉素40μg／ml或氯霉素50μg／m1可以抑制大部分细菌的生长..除了氯霉素可在灭菌前加入外;其他抗菌素都应在灭菌后并冷却到45℃左右以手背触三角瓶感到烫;但尚可以忍耐为宜时加入..倒平板过程中只要遵循“稳、轻、快”要领;不必在火焰上方;一般很少污染..3 取真菌叶斑病的新鲜病叶或其他分离材料;选择典型的单个病斑;用剪刀或解剖刀从病斑边缘病健交界处;切取小块每边长3～4 mm病组织数块..提示：选择新患病的组织作为分离的材料;可以减少腐生菌混入的机会..腐生菌一般在发病很久而已经枯死或腐败的部分滋生;因此;一般斑点病害应在临近健组织的部分分离..4将病组织放入70％酒精中浸3～5s后;按无菌操作法将病组织移入0.1％升汞液中分别表面消毒0．5、1、2、3、5 min 也可使用其他表面消毒剂;如植物组织柔嫩;则表面消毒时间宜短；反之则可长些..然后放入灭菌水中连续漂洗三次;除去残留的消毒剂..提示：先用70％的酒精浸2～3 s是为了消除寄主表面的气泡;减少表面张力;70％的酒精亦用于表面消毒;处理的时间较短一般数秒至l min升汞溶液消毒的时间因材料而异;可自30s至30min不等;一般情况下;需时间3～5 min..5 用无菌操作法将病组织移至平板培养基上;每皿内放4～6块..提示：在将病组织小块移放到平板表面之前;应将其在无菌吸水纸上吸去多余的水;以大大减少病组织附近出现细菌污染..6 将培养皿倒置放入25℃左右恒温箱内培养..一般3～4 d后观察待分离菌生长结果..7 若病组织小块上均长出较为一致的菌落;则多半为要分离的病原菌..在无菌条件下;用接种针铲自菌落边缘挑取小块移入斜面培养基上;在25 ℃左右恒温箱内培养;数日后;观察菌落生长情况;如无杂菌生长即得该分离病菌纯菌种;便可置于冰箱中保存..提示：除根据菌落的一致性初步确定长出的菌落是否目标菌外;还要在显微镜下检查;进一步确定..如果是对未知病原菌的组织分离;则要将长出的菌落分别转出;通过进一步的接种实验明确哪一种为其病原菌..在组织分离工作中;如果植物材料体积较大且较软如患灰霉病的番茄果实;在分离过程中可直接挖取内部患病组织移入平板培养基上;完成分离工作..2. 稀释分离法1 取灭菌培养皿三个;平放在湿纱布上;编号;并注明日期、分离材料及分离人姓名..2 用灭菌吸管吸取灭菌水;在每一皿中分别注入0.5～1.0 ml..3 用移植环蘸一滴孢子悬浮液;与第一个培养皿中的灭菌水混合;再从第一个培养皿移三环到第二个培养皿中;混合后再移三环到第三个培养皿中..4 将熔化并冷却到45～50℃的培养基;分别倒在三个培养皿中为防止细菌污染;也可以向每个培养皿中事先加入1～2滴25％乳酸;摇匀;凝固;要使培养基与稀释的菌液充分混匀..提示：倒平板时的培养基温度一定要掌握好;过热易将病原菌烫死而使分离失败;过冷则倒入培养皿中后难以形成平板;不利于分离..5 将培养皿翻转后置恒温箱25℃中培养;数日后观察菌落生长情况..6 挑菌将培养后长出较为整齐一致的单个菌落分别挑取;接种到斜面培养基上;置25℃左右培养..待菌长出后;检查菌是否单纯;若有其他菌混杂;就要再一次进行分离纯化;直到获得纯培养..二病原细菌的分离病原细菌的分离方法以稀释分离法和划线分离法为最常用..在进行分离之前;首先应对病组织材料进行细菌学初步诊断;即经过镜检确认有喷菌现象以后;才对该病组织作分离工作..稀释分离法是最经典的标准分离法;方法同上述真菌分离..除去上述稀释分离法以外;较为方便的是划线分离法：1 预先把熔化好的肉膏蛋白胨培养基倒入培养皿中;凝成平板后;翻转放在30℃恒温箱中2～4 h;使表面无水滴凝结..也可凝成平板后直接使用..2 将病组织先用0.1％升汞表面消毒0.5～2 min;再用无菌水换洗3次后;放在灭菌培养皿中的灭菌水中;用灭菌玻棒研碎;并让组织碎块在水中浸泡20～60 min;让细菌释放到灭菌水中..3 用灭菌的接种铒;接种环；蘸取浸泡液在干燥的培养基平板表面划线;尽量不要把平板表面划破..划过第一批线后的接种环应放在火焰上烧灼;冷却后直接在第一批划线的末端向另一方向划线..灭菌后再划第三次线..提示：划过第一批线后接种铒放在火焰上烧过这一步骤非常重要;这样做可以使第一批线和第二批线上的细菌数量相差很大..4 用玻璃铅笔在培养皿上写上分离材料、日期和分离者姓名后;翻转培养皿;放在26～28℃恒温箱中培养..1～3 d后观察有无细菌生长;在哪些地方有单菌落生长出来其中的优势单菌落应为待分离菌形成的..5 仔细挑取病原菌的单菌落;并移植到斜面培养基上..同时;再把单菌落用灭菌水稀释成悬浮液作第二次划线分离;经培养后出现的菌落在形态特征都趋于一致;并与典型描述的特征相一致时;即表明已获得纯培养..最好要经过连续三次单菌落的分离;才能确保纯化..三真菌、细菌培养性状。
实验三植物病原菌的分离和培养一、实验目的在研究病原菌的形态、生理、生态以及病原菌对寄主植物的致病性等多种试验中，常常需要病原菌的纯培养物。
然而，在自然情况下，病原菌通常是与其他杂菌混生在一起的，从受病组织或其他基物中将病原菌单独分选出来，叫作分离。
分离和培养是植病实验室最基本的操作技术之一。
通过本次实验学习植物病原菌分离培养的原理和常用的方法。
二、内容、材料和方法(一)分离材料的选择分离材料的选择对分离培养的成败有着决定的影响，因为在感病植物受害部位的内外，要有多种腐生菌，为减少腐生菌的污染，分离所用的病害材料应尽可能新鲜，并且最好在病、健交接处选材取样。
病、健交接处，除材料新鲜，污染的可能性小外，病原菌的生活力强、比较活跃，容易分离成功。
(二)分离方法病原菌分离的方法因材料不同而异，植病实验室最常见的方法有组织分离法和稀释分离法两种。
1.组织分离法：这种方法适用于大部分病菌的分离，此法又分为小块组织分离和大块组织分离两种方法。
分别以玉米大斑病、小麦根腐病和梨褐腐病为试材进行。
(1)叶斑病类病原菌的分离（玉米大斑病病菌的分离）取玉米大斑病病叶，在病、健交界处剪取2—3毫米长的病组织。
用10%漂白粉（次氯酸钙）溶液消毒（漂白粉溶液现用现配）3-5min，时间长短依病组织不同而异，然后直接移至PSA平板培养基上(为防止细菌污染，可在培养基中加入1000ppm链霉素10毫升)，倒置于20—25℃室温下，待菌落长出后挑取前缘菌丝，回接于PSA斜面培养基上，在25℃温箱中培养，待菌落颜色变深后，在无菌条件下镜检是否是玉米大斑病菌，弱仅有玉米大斑病菌的孢子，则说明已获得了纯培养，否则，则需要继续转至斜面培养基上进行纯化，直至获得纯培养。
(2)种子内部病原菌的分离（小麦根腐病菌的分离）选择典型的小麦黑胚粒3—4个，在70%的酒精中浸2—3秒钟后，以镊子夹住投入0.1%升汞溶液中表面消毒2—3分钟（处理时间可自30秒至30分钟不等），然后取出小麦粒，以灭菌水冲洗3次，再移至已倒好的马铃薯琼脂平板培养基上，注意要以小麦的黑胚部位着靠在培养基上，倒置在25℃温箱中培养，待菌落长出后，挑取前缘菌丝于马铃薯斜面培养基上培养，培养3-4天后，无菌条件下镜检是否获得纯培养。
植物真菌类病害组织病原菌的分离及抑菌圈实验1、病原菌的分离培养及保存1.1材料：（1）病害组织（2）分离培养基（PDA培养基）：20%土豆煮汁，2%琼脂条，1%葡萄糖，蒸馏水，121℃高温灭菌（3）次氯酸钠（4）试管斜面培养基：成分为PDA培养基，121℃高温灭菌1.2方法：剪取作物病害部位，将病害部位用次氯酸钠表面消毒后，置于分离培养基上，然后放置于28℃恒温培养箱内培养。
7天后取出，通过菌落形态和孢子镜检挑选出所要分离的病原菌转接试管斜面，然后将斜面放置于28℃恒温培养箱内培养。
7天后取出，包好放于4℃冰箱内低温保存。
2、病原菌摇瓶菌丝体的培养及菌液的制备2.1材料：（1）试管斜面孢子（2）摇瓶培养基：20%土豆煮汁，1%葡萄糖，蒸馏水，121℃高温灭菌。
2.2方法：将试管斜面孢子转接到摇瓶培养基，然后将摇瓶放到220转/分的摇床上培养，2—3天后，摇瓶菌丝体长到一定的成熟状态（不同真菌菌丝体不同）后，取下摇瓶，放于4℃冰箱内低温保存，待需要做抑菌圈实验时，将摇瓶从冰箱内取出，用组织捣碎机将摇瓶菌丝体高速捣碎2分钟左右，至菌液状态。
3、供试药剂的抑菌圈实验3.1材料：（1）打碎的病原菌菌液（2）底层培养基：2%琼脂粉、蒸馏水，121℃高温灭菌。
（3）上层培养基：成分同PDA培养基，121℃高温灭菌。
（4）链霉素溶液：2400U/mL3.2方法：（1）融化底层培养基，待温度降至70℃，倒入测定木盘，放平至凝固。
（2）融化上层培养基，待温度降至54℃，用无菌移液管加入1mL链霉素溶液以防杂菌干扰；继续降温至48℃，用无菌移液管加入6—12mL的病原菌菌液后迅速晃匀后，倒入测定木盘，放平，待凝固后，即做成抑菌圈实验所用的测定盘。
（3）稀释供试药剂到制定浓度。
（4）在测定盘内摆放牛津杯。
（5）用P型移液器将稀释好的药剂滴入牛津杯内，滴液量为0.26mL/杯，然后盖上玻璃板，放置于28℃恒温培养箱内培养，培养时间为16—18小时。
普通植物病理学实验十七、病原菌的分离培养和纯化一、目的要求(1)了解分离与纯化微生物的基本原理及方法。
(2)掌握倒平板的方法和组织分离、稀释分离、平板划线分离的基本操作技术。
(3)掌握在平板、斜面及液体培养基上培养病原菌及观察其培养性状的方法。
二、基本原理植物病原菌的分离培养，是植物病理实验室工作中的基本技能。
为了获得某微生物的纯培养，一般是根据该微生物对营养、酸碱度、氧气等条件要求不同，而供给它们适宜的生活条件，即让病原菌生活在适宜的培养基上，或加入某种抑制剂造成只利于此菌生长，而抑制其他菌生长的环境，从而得到纯菌株。
植物病原真菌的分离方法主要有组织分离法和稀释分离法两种。
最常用的方法是组织分离法，而稀释分离法主要用于病组织上产生大量孢子的病原真菌的分离。
病原细菌的分离方法以划线分离法为最常用，在有些情况下也采用稀释分离法。
为了获得分离菌的纯培养，必须要进行分离菌的纯化，纯化的方法类似于分离工作中采用的稀释分离法或划线分离法。
三、材料、仪器与用具1．材料(依当地情况进行选择，下列材料供参考)(1)稻瘟病叶、病节、病穗颈(pyricularia orycae)。
(2)玉米大斑病叶(exserohilum turcicum)。
(3)玉米弯孢菌叶斑病叶(curvularia lunata)。
(4)玉米小斑病叶(bipolaris maydis)。
(5)番茄灰霉病果(botrytis cinefca)。
(6)黄瓜菌核病果(sclerotinia sclerotiorum)。
(7)黄瓜细菌性角斑病叶(pseudomonas syringaepv．1achrymans)。
(8)水稻白叶枯病叶(xanthomonas campestms pv.oryeue)。
(9)大豆细菌性斑点病叶(pseudomonas syringaepv．glycinea)。
(10)白菜软腐病叶(erudnia carotovora subsp．carotovora)。
资料范本本资料为word版本，可以直接编辑和打印，感谢您的下载植物病原真菌的分离培养地点：__________________时间：__________________说明：本资料适用于约定双方经过谈判，协商而共同承认，共同遵守的责任与义务，仅供参考，文档可直接下载或修改，不需要的部分可直接删除，使用时请详细阅读内容实验十三植物病原真菌的分离培养一、实验原理植物患病组织内的真菌菌丝体，如果给予适宜的环境条件，除个别种类外，一般都能恢复生长和繁殖。
植物病原菌的分离就是指通过人工培养，从染病植物组织中将病原真菌与其它杂菌相分开，并从寄主植物中分离出来，再将分离到的病原菌于适宜环境内纯化，这个过程总称植物病菌的分离培养。
植物病原真菌的分离一般都是采用组织分离法，就是切取小块病组织，经表面消毒和灭菌水洗过后，移到人工培养基上培养。
二、实验目的：植物病原菌的分离培养是植物病理学实验最基本的操作技术之一，它对原害鉴定，病原形态观察、植物病害接种体的培养等方面都是经常使用的研究手段。
通过本实验，要求植物病原菌分离培养的一般原则和方法。
三、实验材料及准备：1．分离材料：梨黑斑病（Alternaria kikuchiana），柿树圆斑病（Pestnlotia sp）及杉木炭疽病（Glomerella cingolata）新发病的病叶；杨树烂皮病（Cytospora chrysosperma）国槐腐烂病（Dothiorella sp.）的带有新病斑的枝条；油松种子。
2．分离用具（每小组为单位）酒精灯4个，手术剪4把，眼科镊4把，PDA培养基3瓶，培养皿（Φ9cm）24套，小烧杯（5ml）4个，大烧杯1个，斜面培养基12管，灭菌水4瓶，75%酒精瓶1个（内放脱脂棉球）0.1%升汞瓶1个，5%乳酸瓶（60ml）1个，火柴1盒，湿、干纱布各4张。
四、实验方法及步骤：（一）、分离前的准备工作：1．工作环境的清洁和消毒分离培养一般在无菌室、无菌箱或无菌工作台（超净工作台）上进行，无菌室和无菌箱要经过喷雾除尘，并用药物或紫外线照射消毒（常用消毒药物为70%酒精，2%煤酚皂液，5%石炭酸液等喷雾。
植物病原菌的分离培养是植物病理学实验最基本的操作技术之一，它对原害鉴定，病原形态观察、植物病害接种体的培养等方面都是经常使用的研究手段。
(一)分离材料的选择分离材料的选择对分离培养的成败有着决定的影响，因为在感病植物受害部位的内外，要有多种腐生菌，为减少腐生菌的污染，分离所用的病害材料应尽可能新鲜，并且最好在病、健交接处选材取样。
病、健交接处，除材料新鲜，污染的可能性小外，病原菌的生活力强、比较活跃，容易分离成功。
(二)分离方法病原菌分离的方法因材料不同而异，植病实验室最常见的方法有组织分离法和稀释分离法两种。
1.组织分离法：这种方法适用于大部分病菌的分离A:分离前的准备工作：1．工作环境的清洁和消毒分离培养一般在无菌室、无菌箱或无菌工作台（超净工作台）上进行，无菌室和无菌箱要经过喷雾除尘，并用药物或紫外线照射消毒（常用消毒药物为70%酒精，2%煤酚皂液，5%石炭酸液等喷雾。
若用紫外线灯照射则需20-30分钟）。
在没有上述设备条件时，在清洁房间里关闭门窗，避免空气流动，经过喷雾除去空气及地面灰尘后进行操作，也可获得较好的结果。
工作前擦净桌面，最好铺上湿纱布。
将所需用的物品按次序放在工作台上，避免工作时走动，工作人员最好穿上灭菌后的工作服，带上口罩，并用肥皂洗手，用70%酒精或0.1%新洁尔灭擦手。
2．分离用具的消毒凡是和分离材料接触的器皿（刀、剪、镊、针等）都要随时（至少在使用时）保持无菌，将这些用具浸于70%酒精中，使用时在灯焰上灭菌烧去酒精，如此2-3次（刀、剪、镊等不宜在灯焰上烧时过长，以防退火）。
再次使用时必须重复灭菌。
培养皿、试验等要经过干热灭菌。
培养基及洗涤或稀释用蒸馏水都需要事先经过高压蒸气灭菌。
3．分离材料的选择用新发病的植株、器官或组织做为分离材料，可以减少腐生菌的污染。
任何植物坏死部分的内部或表面，都可能有腐生微生物的孽生，所以一般斑点病害应从邻近健全组织，即从病、健组织交界处获得分离材料B、植物病原菌的分离1．叶斑类和枝杆病斑类（非维管束侵染）病原菌分离：首先选择具有典型症状的新鲜病叶作为分离材料，按下述步骤操作：①培养基平板制备：将PDA培养基在微波炉中加热熔化验，以无菌操作法将溶化过的培养基倾注入灭过菌的培养基中，每皿经12毫升，可形成2-3毫米厚的平板。
