植物病原菌分离方法

病原菌分离方法一、实验原理：植物患病组织内的真丝菌丝体，如果给予适宜的环境条件，除了个别种类外，一般都能恢复生长和繁殖。

植物病原菌的分离就是指通过人工培养，重染病植物组织中将病原真菌与其他杂菌相分开并从寄主植物中分离出来，再将分离得到的病原菌于适宜环境内纯化，这个过程总称植物病原的分离培养。

二、实验用具：酒精灯、手术剪、镊子、75%酒精、3%~5%次氯酸钠、灭菌水、培养皿、封口膜、乳酸等三、实验前的准备工作：1、煮培养基（PDA）：马铃薯200g,葡萄糖20g，琼脂粉(AGAR)20g（10:1:1）水1000ml（1）将去皮称量好的马铃薯切片后加水煮沸15~20min（水可以适量多加200ml 左右，因为在煮的过程中会蒸发一些），待土豆煮软即可。

（2）三层纱布滤去马铃薯后将过滤的水倒入洗净的锅中，加琼脂粉搅拌充分后再加热煮沸，小火使其充分融化。

（3）加入葡萄糖并不断搅拌，待其完全融化后双层纱布过滤，定容到1000ml，分装到500ml的玻璃瓶内，每个玻璃瓶最多装300ml，121℃湿热灭菌30min。

2、培养皿干热灭菌170℃1h;蒸馏水、枪头等湿热灭菌121℃30min。

四、实验步骤：1、用75%酒精擦拭超净工作台，所有器具用紫外灯灭菌30min,分离室要保持清洁。

2、取样，病斑大小约20个（含病缘线）3、分装培养基：（1）融PDA，松盖在微波炉中加热约3min（看量多少而定）（2）待冷却至50℃后在超净工作台指示灯显绿灯时分装(3) 分装时滴入一管乳酸约20滴（每10ml培养基中加3滴乳酸）（4）左手拿培养皿并将皿盖在火焰附近打开一缝，迅速倒入培养基约15m1(300ml一瓶的培养基倒20多个平板)，加盖后轻轻摇动培养皿，使培养基均匀分布在培养皿底部，然后平置于桌面上，待凝后即为平板。

4、表面消毒：（1）75%的酒精3ml~4ml没过样表面10s，快速吸掉酒精（2）3%~5%次氯酸钠（现配现用、避光）10ml消毒2~3min（3）无菌水冲洗2~3次5、转样：（1）器具经酒精灯消毒后无菌水水洗（2）培养皿上写明名称、分离时间后，在酒精灯旁转五点于培养基上。

植物病原菌的检测原理植物病原菌的检测原理主要分为传统检测方法和分子检测方法两大类。

传统检测方法包括病斑观察、显微镜检测、分离培养、生化、免疫学和生物学检测方法等；分子检测方法主要包括PCR、酶联免疫吸附测定法（ELISA）、荧光定量PCR、内参PCR、两步PCR、多重PCR、血清学检测、微阵列分析、测序等。

下面将详细介绍传统检测和分子检测方法的原理和应用。

传统检测方法1. 病斑观察法病斑观察是一种最简单、最常用的检测方法。

通过观察植物叶面、茎部等组织上的病斑症状特征，如色素改变、溃疡、软腐、凋萎等症状，判断植物是否感染了病原菌。

该方法通常用于狭义上的病原菌检测，即只能推断出可能存在病原菌，但不具备进一步鉴定病原菌的能力。

2. 显微镜检测法显微镜检测是通过放大被检测样品的细菌菌落、孢子、分生孢子等微观结构，借助显微镜观察和鉴定病原菌的一种方法。

该方法通过观察病原菌的形态、大小、染色性质、分离和生长特征等，与已知的病原菌进行比对，确定植物感染的病原菌种类。

3. 分离培养法分离培养法是通过将被检测的植物组织样品分离培养于富含营养物的培养基上，利用病原菌的生长特性和营养需求进行分离纯化。

通过培养基的选择、温度、湿度、pH值、光照等条件的控制，使病原菌表现出明显的生理与形态特征，便于进一步鉴定和定量检测。

4. 生化检测法生化检测法主要是通过检测病原菌体内的一些特有的生化成分和活性，如酶活性、甘油分解酸生成、酸碱生成、氨氧化等，根据其特异性判断病原菌的类型和数量。

5. 免疫学检测法免疫学检测法主要是利用免疫学原理，通过检测样品中的病原菌抗原或抗体来判断其存在与否。

免疫学检测方法可分为免疫电镜检测、免疫荧光检测、ELISA等。

6. 生物学检测法生物学检测法是利用宿主植物对某一种病原菌的特异性反应来检测病原菌。

常用的生物学检测方法包括种子法、接种法、淫种法、耐病品种鉴定法等。

分子检测方法1. PCR检测法PCR（Polymerase Chain Reaction）是一种分子生物学技术，能在短时间内通过特异引物和聚合酶对DNA模板进行扩增。

植物真菌类病害组织病原菌的分离及抑菌圈实验1、病原菌的分离培养及保存1.1材料：（1）病害组织（2）分离培养基（PDA培养基）：20%土豆煮汁，2%琼脂条，1%葡萄糖，蒸馏水，121℃高温灭菌（3）次氯酸钠（4）试管斜面培养基：成分为PDA培养基，121℃高温灭菌1.2方法：剪取作物病害部位，将病害部位用次氯酸钠表面消毒后，置于分离培养基上，然后放置于28℃恒温培养箱内培养。

7天后取出，通过菌落形态和孢子镜检挑选出所要分离的病原菌转接试管斜面，然后将斜面放置于28℃恒温培养箱内培养。

7天后取出，包好放于4℃冰箱内低温保存。

2、病原菌摇瓶菌丝体的培养及菌液的制备2.1材料：（1）试管斜面孢子（2）摇瓶培养基：20%土豆煮汁，1%葡萄糖，蒸馏水，121℃高温灭菌。

2.2方法：将试管斜面孢子转接到摇瓶培养基，然后将摇瓶放到220转/分的摇床上培养，2—3天后，摇瓶菌丝体长到一定的成熟状态（不同真菌菌丝体不同）后，取下摇瓶，放于4℃冰箱内低温保存，待需要做抑菌圈实验时，将摇瓶从冰箱内取出，用组织捣碎机将摇瓶菌丝体高速捣碎2分钟左右，至菌液状态。

3、供试药剂的抑菌圈实验3.1材料：（1）打碎的病原菌菌液（2）底层培养基：2%琼脂粉、蒸馏水，121℃高温灭菌。

（3）上层培养基：成分同PDA培养基，121℃高温灭菌。

（4）链霉素溶液：2400U/mL3.2方法：（1）融化底层培养基，待温度降至70℃，倒入测定木盘，放平至凝固。

（2）融化上层培养基，待温度降至54℃，用无菌移液管加入1mL链霉素溶液以防杂菌干扰；继续降温至48℃，用无菌移液管加入6—12mL的病原菌菌液后迅速晃匀后，倒入测定木盘，放平，待凝固后，即做成抑菌圈实验所用的测定盘。

（3）稀释供试药剂到制定浓度。

（4）在测定盘内摆放牛津杯。

（5）用P型移液器将稀释好的药剂滴入牛津杯内，滴液量为0.26mL/杯，然后盖上玻璃板，放置于28℃恒温培养箱内培养，培养时间为16—18小时。

新疆棉花枯黄萎病的发生现状及其快速分离技术随着新疆棉花种植规模的不断扩大和化肥农药使用量的增加，棉花枯黄萎病的发生率也不断升高。

棉花枯黄萎病是由灰色霉菌引起的一种全株性病害，能够引起棉花植株的迅速枯死，严重影响棉花产量和质量。

目前，新疆棉花枯黄萎病的病原菌鉴定和快速分离技术已经引起了广泛关注。

棉花枯黄萎病的发生与环境因素、病菌、寄主三者的交互作用有关。

新疆地处干旱、温差大的荒漠化区域，气候条件逐渐变得极端，气象条件对棉花生长和病害的发生都有重要影响。

病菌的存在是病害发生的前提条件，病菌传播途径主要包括种子、土壤、空气、水等多种途径。

寄主作物的品种、年龄、栽培措施等也会影响病害的发生和大面积流行。

因此，如何对新疆棉花枯黄萎病进行病原菌鉴定和快速分离技术的研究具有重要意义。

目前，新疆棉花枯黄萎病的快速分离技术主要包括传统分离法、生物学分离法和分子生物学分离法。

其中，分子生物学分离法已经成为新疆棉花枯黄萎病病原菌鉴定的主要方法。

传统分离法主要是通过分离病植物的病原菌进行鉴定，该方法具有操作简单、成本低廉等优点。

但是，传统分离法存在分离容易出现假阳性或假阴性的情况，同时这种方法只能单独鉴定某个特定的病原菌。

生物学分离法则是通过生物学实验手段将病原菌与其他微生物分离出来。

该方法相对综合性较强，能够一次性鉴定多种病原菌。

但是，生物学分离法存在操作复杂、耗时费力等缺点。

分子生物学分离法则是通过基因分子技术手段进行分离，无需对微生物进行培养，具有高度的特异性和敏感性。

该方法能够对样本进行深度测序和分子鉴定，可以实现大规模病原菌的分离和鉴定。

同时，该方法对样本种类无要求，操作简单、灵敏度高、快速性强、结果准确可靠等优点，已被广泛应用于新疆棉花枯黄萎病的病原菌鉴定中。

总的来说，针对新疆棉花枯黄萎病的发生现状，分子生物学分离法已经成为重要的技术手段，能够实现快速而准确地分离出病原菌，为病害防治提供了重要的科学依据。

未来，随着技术的不断升级和改进，新疆棉花枯黄萎病的防治将更加科学、有效。

【精品】植物病原真菌的分离培养植物病原真菌的分离培养是植物病害学研究中的常规技术，它是诊断病原微生物的重要手段。

通过环境、罹病组织或病株上的真菌分离，可以准确地确定病原物种，病害发生的原因和病害防治的策略。

本文将介绍植物病原真菌的分离培养方法及其注意事项。

一、实验材料1. 植物体、果实或病株。

2. 无菌匀质培养基：具备营养丰富，pH约为7.0，含有适量的蔗糖、氨基酸、维生素和矿物质元素。

3. 无菌器具：试管、培养皿、匀质棒、无菌酒精灯、注射器等。

二、分离方法1. 选材：选择患病植物或病株，减少环境污染的干扰，以便于真菌分离和培养。

2. 分离：在实验室中进行无菌操作，将病株或罹病组织的表皮割去，注意不要带皮层或子叶，然后用30%的酒精或75%的酒精消毒5-10秒，沥干后放入无菌盘中。

3. 培养：将培养基煮沸，冷却后加入抗生素，避免杂菌污染，用培养皿接种盘，置于26℃左右的恒温箱中孵育。

初次孵育检查时间视病原真菌的生长速度而定，通常在1-2周内可见初生菌丝和菌落。

如果没有生长或生长极为缓慢，可能需要增加孵育时间或重新分离。

4. 子培养：将孵育的菌落通过匀质棒挑选到其他含有抗生素的培养基中，进行子培养，以保证分离出的真菌种属的准确性。

如培养子菌落中有杂菌或真菌菌落与初步分离的不一致，应重新分离。

5. 稳定培养：对于经过检查并确认是病原真菌的菌株，应进行深层冻存或贮存，以免失掉纯度，同时要做好鉴定记录。

三、注意事项1. 操作要无菌，防止环境污染，避免误诊。

2. 病株样品与周围环境隔离，减少环境干扰。

3. 选用适当的培养基，保证真菌菌落的生长和营养。

4. 操作时注意安全，避免接触真菌孢子、毒素等对人体有害的物质。

5. 菌落的检查应在暗的环境下进行，以免光照影响观察结果。

四、结语植物病原真菌的分离培养是诊断和定位植物病害的一个重要工具。

通过正确的操作方法和注意事项，可以准确地分离出病原菌，并对其性质和特征进行鉴定和确认。

植物病原细菌的分离、纯化及鉴定1实验目的及意义植物病原菌的分离、鉴定是植物病理学实验最基本的操作技术之一，通过本实验，要求掌握植物病原菌分离培养、纯化鉴定的一般原则和方法。

2实验材料及准备2.1 实验材料：新发病的植物组织2.2 培养基准备（LB培养基）：胰蛋白胨1%，NaCl 1%，酵母浸粉0.5%，pH7.0-7.2，121℃灭菌20 min，备用。

2.3 实验用具：载玻片、盖玻片、酒精灯，手术剪，镊子，培养皿（Φ9cm），斜面培养基，灭菌水，1% NaClO，打火机。

3 实验方法及步骤3.1 植物样品的采集选取发病初期植株，样本尽量保持完整，至少包含病健交界处；将样品放入纸袋保存或邮寄，并做好记录；需要分离的标本应尽快完成分离工作（1-5d），长期保存需压干，未压干的标本勿装塑料袋。

3.2 发病组织的显微检查准备好洁净的载玻片、盖玻片和水；取小的整块标本洗净、晾干/吸干；切取约2×4mm大小病健交界组织；从上述组织中切取尽可能薄的小片平放在载玻片上；加一滴水，盖好盖玻片，防止气泡；先用低倍镜(4×，10×)检查，看到白色、半透明、雾状的喷菌现象；换用40倍物镜观察，看到杆状、透明、活动的菌体，证明的确为细菌性病害。

3.3 病原物的分离和培养选取镜检有喷菌现象的组织进行划线分离：所取组织用自来水洗净，吸干；（以下进入超净工作台操作）将植物组织剪成1×4mm的大小，1%的次氯酸钠消毒2-10min，灭菌水洗2-3次；将组织从病斑处剪碎放入约0.5-1ml水中，并让组织碎块在水中浸泡5-15min，让细菌释放到灭菌水中；取病汁液1-3环，在LB平板上划线。

28℃温箱中培养，每天观察菌落生长情况并记录：菌落长出的时间、菌落大小、颜色、形态。

3.4 病原物的纯化和保存3-4 d后选取生长量较多且形态一致的菌落，LB平板上划线纯化。

若仍然生长不纯，则需多次纯化。

植物病原细菌鉴定实验指导一、实验目的了解植物病原细菌的分类与鉴定方法，掌握分离、纯化、鉴定菌种方法，培养技术和生化鉴定技术。

二、实验原理细菌的鉴定包括形态学、生理生化和分子生物学鉴定等。

一般细菌的形态学特征，如生长形态、荧光特性、大小观感、颜色、质地等特征对细菌种属的鉴定非常重要；生理生化鉴定主要通过细菌在不同培养基上的生长特性、代谢途径等指标；分子生物学鉴定主要通过PCR扩增等手段，对细菌基因组的DNA序列进行分析和比对，建立物种特异性的DNA指纹。

三、实验步骤1、样品收集和处理收集可能感染病原细菌的植物样品，如叶片、茎、根等，通常选择表现症状明显的植株或部位作为样品。

将植物样品取出，进行表面消毒处理，可使用0.1%次氯酸钠、70%乙醇等消毒液对样品进行表面消毒，去除植物表面微生物的影响。

2、分离与纯化将消毒后的植物样品移植到适宜的培养基中，如普通营养琼脂培养基，选用相应的富营养培养基有利于分离病原菌。

将培养皿放置在适宜的温度和湿度下进行培养，通常选用28℃，相对湿度为60%左右为适宜。

在植物样品污染细菌生长后，从单个菌落中分离纯化，将纯化后的菌株进行保存或进行进一步的鉴定工作。

3、形态学鉴定观察细菌菌落的形态、大小、颜色等特征，对细菌形态特征的精细观察非常重要。

如分泌物、粘质或胞外多糖的分泌，以及生物质塑性、溶胶的形成等细节观察是形态学鉴定的重要参考标准。

4、生理生化鉴定通过生理生化鉴定，了解细菌的生长特性和代谢途径，选用不同的培养基和筛选方法可以判断病原菌的代谢类型。

如选择碳水化合物代谢及活性酶的测定等手段，增加了进一步分类和鉴定细菌的能力。

5、分子生物学鉴定应用PCR技术，对从植物样品中提取到的细菌DNA进行扩增，基于特异性PCR产物筛选与目的DNA序列的核苷酸序列比对，可以非常准确地测定细菌所属属种。

四、实验注意事项1、实验室要保持清洁，保证实验环境卫生。

2、植物样品取自已知病害株，避免误判。

简述植物病原真菌组织分离法和稀释（孢子）分离法的适用材料及优缺点-概述说明以及解释1.引言植物病原真菌是引起农作物疾病的主要病原体之一，研究植物病原真菌的组织分离方法和稀释（孢子）分离方法对于疾病的诊断和防治具有重要意义。

植物病原真菌组织分离法是通过从感染植物组织中分离出纯种的真菌菌落，从而研究其特性和致病机制。

稀释（孢子）分离法则是通过将真菌孢子稀释到一定浓度后分离，利用分离得到的孢子进行研究和防治。

本文将对这两种方法的适用材料、优点和缺点进行简述和总结，以期为植物病原真菌研究提供参考。

）分离法的缺点":{}}}}请编写文章1.1 概述部分的内容1.2文章结构文章结构是指文章的整体架构和组织方式，帮助读者更好地理解和掌握文章的内容。

本文主要介绍植物病原真菌组织分离法和稀释（孢子）分离法的适用材料及其优缺点。

具体的文章结构如下：1. 引言1.1 概述1.2 文章结构1.3 目的2. 正文2.1 植物病原真菌组织分离法2.1.1 适用材料2.1.2 优点2.1.3 缺点2.2 稀释（孢子）分离法2.2.1 适用材料2.2.2 优点2.2.3 缺点3. 结论3.1 总结植物病原真菌组织分离法和稀释（孢子）分离法的适用材料3.2 总结植物病原真菌组织分离法和稀释（孢子）分离法的优点3.3 总结植物病原真菌组织分离法和稀释（孢子）分离法的缺点在文章结构中，逐步展开对植物病原真菌组织分离法和稀释（孢子）分离法的介绍，包括适用材料、优点和缺点等方面的内容。

最后通过结论对两种方法进行总结和概括，使读者对这两种方法有个整体的认识。

1.3 目的本文的目的是对植物病原真菌组织分离法和稀释（孢子）分离法的适用材料及其优缺点进行简要描述和分析。

通过介绍这两种常用的真菌分离方法，旨在帮助读者更好地了解和选择适合的实验方法，提高病原真菌的分离效率。

具体而言，我们将详细介绍植物病原真菌组织分离法的适用材料，包括所需的培养基、植物组织、分离介质等。

病原物的分离与培养病原物的分离与培养在植物病害的研究中具有重要意义，分离、培养病原菌的方法是植物病理学研究工作中最常应用的实验技术。

一方面，在一个新的病害研究中，通过分离与培养获得病原物的纯培养，完成柯氏法则，以明确该病病原；研究病原物的生物学特性和病害循环（侵染、病程等等）。

所谓病原物的分离，即把该病原菌从发病组织上与其他微生物分开；所谓病原物的培养，即将分离的病原菌移到可以让这种病原菌正常生长的营养基质即培养基上，从而获得其纯培养。

病原物的分离与培养，需经以以几个步骤:1.有关器皿的灭菌和消毒；2.制作培养基；3.病原菌的分离4.病原菌的培养。

－、灭菌与消毒灭菌与消毒是两个不同的概念。

灭菌则是指杀死一切微生物的营养体和孢子。

消毒一般是指消灭病原菌和有害微生物的营养体，在植物病理学实验中，需要进行纯培养，不能有任何杂菌污染，因此对所用器材、培养基和工作场所都要进行严格的消毒和灭菌。

消毒与灭菌的方法很多，一般可分为加热、过滤、辐射和使用化学药品等方法。

(一) 热力灭菌热力灭菌分干热灭菌和湿热灭菌两类。

1．干热灭菌干热灭菌是利用高温使微生物细胞内的蛋白质凝固变性而达到灭菌的目的。

细胞内的蛋白质疑固性与其本身的含水量有关。

在菌体受热时，当环境和细胞内含水量越大，则蛋白质凝固就越快，反之含水量越小，凝固越慢。

因此，与湿热灭菌相比，干热灭菌所需温度高(160～170℃)，时间长1～2 h。

但干热灭菌温度不能超过180 ℃，否则包器皿的纸或棉塞就会烧焦，甚至引起燃烧。

干热灭菌使用的仪器是烘箱。

干热灭菌有火焰烧灼灭菌和热空气灭菌两种。

火焰烧灼灭菌适用于接种环、接种针和金属用具如镊子等，无菌操作时酌试管口和瓶口也在火焰上作短暂烧灼灭菌。

涂布平板用的三角玻棒也可在蘸有乙醇后进行灼烧灭菌。

通常所说的干热灭菌是在烘箱内利用高温干燥空气(160～170℃)进行灭菌。

此法适用于玻璃器皿如吸管和培养皿等的灭菌。

进行干热灭菌要注意以下问题：物品不要摆得太挤，以免妨碍空气流通；灭菌物品不要接触烘箱内壁的铁板，以防包装纸烤焦起火；在升温过程中，如果红灯熄灭，绿灯亮，表示箱内停止加温；电烘箱内温度未降到70℃以前，切勿自行打开箱门以免骤然降温导致玻璃器皿炸裂。

实验十七、病原菌的分离培养、纯化和保存一、目的要求(1)了解分离与纯化微生物的基本原理及方法。

(2)掌握倒平板的方法和组织分离、稀释分离、平板划线分离的基本操作技术。

(3)掌握在平板、斜面及液体培养基上培养病原菌及观察其培养性状的方法。

二、基本原理植物病原菌的分离培养，是植物病理实验室工作中的基本技能。

为了获得某微生物的纯培养，一般是根据该微生物对营养、酸碱度、氧气等条件要求不同，而供给它们适宜的生活条件，即让病原菌生活在适宜的培养基上，或加入某种抑制剂造成只利于此菌生长，而抑制其他菌生长的环境，从而得到纯菌株。

植物病原真菌的分离方法主要有组织分离法和稀释分离法两种。

最常用的方法是组织分离法，而稀释分离法主要用于病组织上产生大量孢子的病原真菌的分离。

病原细菌的分离方法以划线分离法为最常用，在有些情况下也采用稀释分离法。

为了获得分离菌的纯培养，必须要进行分离菌的纯化，纯化的方法类似于分离工作中采用的稀释分离法或划线分离法。

三、材料、仪器与用具1．材料(依当地情况进行选择，下列材料供参考)(1)稻瘟病叶、病节、病穗颈(Pyricularia orycae)。

(2)玉米大斑病叶(Exserohilum turcicum)。

(3)玉米弯孢菌叶斑病叶(Curvularia lunata)。

(4)玉米小斑病叶(Bipolaris maydis)。

(5)番茄灰霉病果(Botrytis cineFca)。

(6)黄瓜菌核病果(Sclerotinia sclerotiorum)。

(7)黄瓜细菌性角斑病叶(Pseudomonas syringaepv．1achrymans)。

(8)水稻白叶枯病叶(Xanthomonas campestms pv.oryeue)。

(9)大豆细菌性斑点病叶(Pseudomonas syringaepv．glycinea)。

(10)白菜软腐病叶(Erudnia carotovora subsp．carotovora)。

植物病原菌分离方法（综合版）植物病原细菌分离方法：分离培养基（NA）植物病原细菌的方法一般采用稀释分离法：1.取灭菌研钵加无菌水适量，切去4 mm大小病块组织，经过表面消毒和无菌水冲洗3次后放入研钵中研碎，静置10-15 min，使组织中的细菌进入水中制成悬浮液；2.配制不同稀释度的细菌悬浮液；准备3-5个灭菌培养皿，每个加200 µl无菌水；3.用灭菌移植环从第1个培养皿中移植1-2环细菌悬浮液到第2个培养皿中，充分混匀后再从第2个培养皿移植1-2环到第3个培养皿中，依次类推；4.平板划线分离，28℃培养2-3天；5.挑取单菌落划线再次纯化；菌落形态观察：1.形状和大小、颜色和光泽、表面是否隆起或凹陷、边缘的形状、透明度和粘度、培养基颜色的变化等；2.菌苔表面有光滑的、不平整的和皱褶的、易挑取、质地均匀3.菌苔颜色也不同，质地有粘质的、膜质的或蜡质的。

有透明的、半透明的或不透明的，表面有暗色或发亮的4.菌落正反面或边缘与中央部位颜色一致等特征注：1.若分离成功，平板上菌落形态和大小比较一致，即使出现几种不同形状的菌落，终有一种是主要的；2.如果菌落类型很多，且不分主次，很可能未分离到病原细菌，应考虑重新分离；3.如果不熟悉一种细菌菌落的性状，就应选择几种不同类型的菌落，分别培养后接种测定其致病性，最终确定病原菌；4.一种细菌病害一般由一种病原菌引起的，平板上出现几种不同类型的菌落实质上只有一种是真正的病原细菌；5.腐烂型的细菌病害即使是混合侵染的，但也有一种是主要的。

6.各种植物病原细菌生长快慢不同：假单胞菌属和欧文氏菌属1-2天土壤杆菌属细菌2-3天黄单胞菌属细菌3-4天棒杆菌属的细菌5-8天才出现明显的菌落植物病原细菌生长量测定法直接法测体积粗放的方法，将待测培养液放在刻度离心管中作自然沉降或进行一定时间的离心，然后观察沉降物的体积。

称干重采用离心法或过滤法测定，一般干重为湿重的10%~20%。

普通植物病理学实验十七、病原菌得分离培养与纯化一、目得要求(1)了解分离与纯化微生物得基本原理及方法。

(２)掌握倒平板得方法与组织分离、稀释分离、平板划线分离得基本操作技术。

(3)掌握在平板、斜面及液体培养基上培养病原菌及观察其培养性状得方法。

二、基本原理植物病原菌得分离培养,就是植物病理实验室工作中得基本技能。

为了获得某微生物得纯培养，一般就是根据该微生物对营养、酸碱度、氧气等条件要求不同,而供给它们适宜得生活条件,即让病原菌生活在适宜得培养基上，或加入某种抑制剂造成只利于此菌生长,而抑制其她菌生长得环境,从而得到纯菌株。

植物病原真菌得分离方法主要有组织分离法与稀释分离法两种。

最常用得方法就是组织分离法,而稀释分离法主要用于病组织上产生大量孢子得病原真菌得分离。

病原细菌得分离方法以划线分离法为最常用，在有些情况下也采用稀释分离法。

为了获得分离菌得纯培养,必须要进行分离菌得纯化,纯化得方法类似于分离工作中采用得稀释分离法或划线分离法。

三、材料、仪器与用具1.材料(依当地情况进行选择,下列材料供参考)(1)稻瘟病叶、病节、病穗颈(pyricｕｌaｒia orycａe)。

（２)玉米大斑病叶(exserohilum ｔurcicuｍ)。

(3)玉米弯孢菌叶斑病叶(cｕｒvｕlarｉa lｕｎａtａ)。

(４)玉米小斑病叶(bipoｌaris mayｄiｓ)。

(5)番茄灰霉病果（botrytｉs cinefcａ)。

(６)黄瓜菌核病果（sclerotinia sｃｌerotioｒum）。

(7)黄瓜细菌性角斑病叶(pseuｄomoｎas syringaｅｐｖ.1acｈｒｙmans)。

（8)水稻白叶枯病叶(xantｈｏmoｎas campeｓｔms pv、ｏｒｙeue)。

(9)大豆细菌性斑点病叶(pseｕdomonas syringaepv.ｇlyｃiｎea)。

(10)白菜软腐病叶（eｒｕdnia cａｒｏtovｏra suｂsp.cａrotovora)。

植物病原菌的分离培养是植物病理学实验最基本的操作技术之一，它对原害鉴定，病原形态观察、植物病害接种体的培养等方面都是经常使用的研究手段。

(一)分离材料的选择分离材料的选择对分离培养的成败有着决定的影响，因为在感病植物受害部位的内外，要有多种腐生菌，为减少腐生菌的污染，分离所用的病害材料应尽可能新鲜，并且最好在病、健交接处选材取样。

病、健交接处，除材料新鲜，污染的可能性小外，病原菌的生活力强、比较活跃，容易分离成功。

(二)分离方法病原菌分离的方法因材料不同而异，植病实验室最常见的方法有组织分离法和稀释分离法两种。

1.组织分离法：这种方法适用于大部分病菌的分离A:分离前的准备工作：1．工作环境的清洁和消毒分离培养一般在无菌室、无菌箱或无菌工作台（超净工作台）上进行，无菌室和无菌箱要经过喷雾除尘，并用药物或紫外线照射消毒（常用消毒药物为70%酒精，2%煤酚皂液，5%石炭酸液等喷雾。

若用紫外线灯照射则需20-30分钟）。

在没有上述设备条件时，在清洁房间里关闭门窗，避免空气流动，经过喷雾除去空气及地面灰尘后进行操作，也可获得较好的结果。

工作前擦净桌面，最好铺上湿纱布。

将所需用的物品按次序放在工作台上，避免工作时走动，工作人员最好穿上灭菌后的工作服，带上口罩，并用肥皂洗手，用70%酒精或0.1%新洁尔灭擦手。

2．分离用具的消毒凡是和分离材料接触的器皿（刀、剪、镊、针等）都要随时（至少在使用时）保持无菌，将这些用具浸于70%酒精中，使用时在灯焰上灭菌烧去酒精，如此2-3次（刀、剪、镊等不宜在灯焰上烧时过长，以防退火）。

再次使用时必须重复灭菌。

培养皿、试验等要经过干热灭菌。

培养基及洗涤或稀释用蒸馏水都需要事先经过高压蒸气灭菌。

3．分离材料的选择用新发病的植株、器官或组织做为分离材料，可以减少腐生菌的污染。

任何植物坏死部分的内部或表面，都可能有腐生微生物的孽生，所以一般斑点病害应从邻近健全组织，即从病、健组织交界处获得分离材料B、植物病原菌的分离1．叶斑类和枝杆病斑类（非维管束侵染）病原菌分离：首先选择具有典型症状的新鲜病叶作为分离材料，按下述步骤操作：①培养基平板制备：将PDA培养基在微波炉中加热熔化验，以无菌操作法将溶化过的培养基倾注入灭过菌的培养基中，每皿经12毫升，可形成2-3毫米厚的平板。