实验三 巨噬细胞(白细胞)移动抑制试验

单核-巨噬细胞移动抑制因子(MIF)
单核-巨噬细胞移动抑制因子(MIF)是1966年发现的一种淋巴因子，可由活化的T淋巴细胞或B淋巴细胞产生。

人的MIF是糖蛋白,包括有23000和55000两种分子量的分子。

在体外试验中,MIF可以抑制在毛细玻璃管中的单核细胞或巨噬细胞向管口外的四周运动,故名。

将MIF 注射于人或动物皮内，局部可发生迟发型超敏反应样的变化，皮肤出现红肿硬结，病理检查表现为以单核细胞浸润为主的炎症。

这说明MIF在迟发型超敏反应过程中具有重要的作用。

MIF产生试验是一种细胞免疫的检测方法,如果待检者的淋巴细胞在某种特异的抗原刺激下，能在细胞培养液中产生MIF,则说明待检者可以对这种抗原发生迟发型超敏反应，或者说此人对该抗原存在特异的细胞免疫力。

一、实验目的1. 观察小鼠腹腔巨噬细胞的吞噬功能。

2. 研究巨噬细胞在小鼠非特异性免疫中的作用。

3. 探讨不同刺激条件下巨噬细胞吞噬功能的变化。

二、实验原理巨噬细胞是机体免疫系统中的重要组成部分，具有强大的吞噬和清除病原微生物、衰老细胞和坏死组织的能力。

吞噬作用是巨噬细胞识别、结合并摄取病原微生物或异物的重要机制。

本实验通过观察小鼠腹腔巨噬细胞对鸡红细胞的吞噬作用，评估其吞噬功能。

三、实验材料与试剂1. 实验动物：6-8周龄健康小白鼠。

2. 实验试剂：鸡红细胞悬液、无菌生理盐水、冷亚甲蓝染色液、甲醇、橄榄油等。

3. 实验仪器：显微镜、离心机、恒温水浴箱、计时器等。

四、实验方法1. 实验分组：将小白鼠随机分为实验组和对照组，每组10只。

2. 实验操作：（1）实验组：每只小鼠腹腔注射1ml鸡红细胞悬液，对照组腹腔注射1ml无菌生理盐水。

（2）注射后30分钟，将小鼠处死，无菌操作取出腹腔液。

（3）将腹腔液离心，弃去上清液，加入适量冷亚甲蓝染色液，混匀后制片。

（4）显微镜下观察巨噬细胞对鸡红细胞的吞噬情况。

3. 数据统计：计算吞噬鸡红细胞的巨噬细胞百分比和吞噬指数。

五、实验结果1. 实验组小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞的百分比和吞噬指数均显著高于对照组（P<0.05）。

2. 在不同刺激条件下，巨噬细胞吞噬鸡红细胞的百分比和吞噬指数存在差异，其中以脂多糖（LPS）刺激组的吞噬功能最强（P<0.05）。

六、实验分析1. 实验结果表明，小鼠腹腔巨噬细胞具有吞噬鸡红细胞的能力，且吞噬功能受到LPS等刺激因素的影响。

2. 巨噬细胞在小鼠非特异性免疫中发挥重要作用，其吞噬功能与机体抵抗力密切相关。

3. 本实验为研究巨噬细胞在免疫调节中的作用提供了实验依据。

七、实验讨论1. 巨噬细胞在小鼠非特异性免疫中的重要作用：巨噬细胞具有广泛的免疫调节功能，不仅能吞噬和清除病原微生物，还能分泌多种细胞因子，参与免疫应答和免疫调节。

一、实验目的1. 了解巨噬细胞的基本生物学特性；2. 掌握巨噬细胞吞噬功能实验的操作方法；3. 分析巨噬细胞吞噬功能的影响因素。

二、实验原理巨噬细胞是免疫系统中的一种重要细胞，具有吞噬、清除病原体、分泌细胞因子等生物学功能。

本实验通过观察巨噬细胞对鸡红细胞的吞噬作用，评估巨噬细胞的吞噬功能。

三、实验材料与试剂1. 实验动物：小鼠；2. 实验试剂：鸡红细胞、生理盐水、冷亚甲蓝染色液、培养皿、显微镜、移液器等。

四、实验方法1. 实验动物处理：取健康小鼠，腹腔注射6%无菌淀粉液1ml，诱导腹腔巨噬细胞产生。

2. 巨噬细胞收获：实验前3小时，将小鼠处死，无菌操作下取出腹腔液，加入等体积生理盐水，混匀后离心（1000r/min，10min），弃上清，用生理盐水洗涤2次，沉淀即为巨噬细胞。

3. 巨噬细胞吞噬实验：将收获的巨噬细胞加入培养皿中，加入适量鸡红细胞，37℃培养1小时。

4. 巨噬细胞染色：将培养好的巨噬细胞加入冷亚甲蓝染色液，染色5分钟。

5. 巨噬细胞观察：用显微镜观察巨噬细胞吞噬鸡红细胞的情况，计算吞噬百分率和吞噬指数。

五、实验结果与分析1. 实验结果：显微镜下观察到巨噬细胞吞噬鸡红细胞的现象，部分鸡红细胞被吞噬细胞包裹。

2. 实验分析：（1）吞噬百分率：吞噬鸡红细胞的巨噬细胞数/巨噬细胞总数×100%；（2）吞噬指数：吞噬的鸡红细胞总数/吞噬鸡红细胞的巨噬细胞数。

六、实验结论本实验成功观察到了巨噬细胞吞噬鸡红细胞的现象，说明巨噬细胞具有吞噬功能。

吞噬百分率和吞噬指数可以作为评估巨噬细胞吞噬功能的重要指标。

七、实验讨论1. 巨噬细胞在免疫系统中具有重要作用，吞噬功能是其重要生物学特性之一。

2. 本实验采用腹腔巨噬细胞，操作简便，结果可靠。

3. 影响巨噬细胞吞噬功能的主要因素包括：巨噬细胞的来源、成熟度、环境因素等。

4. 本实验为后续研究巨噬细胞吞噬功能的影响因素提供了基础。

八、实验总结本实验通过观察巨噬细胞吞噬鸡红细胞的现象，成功评估了巨噬细胞的吞噬功能。

实验四白细胞移动抑制试验致敏的T淋巴细胞与相应的抗原反应，能引起代谢活化，并释放出多种有生物活性的物质。

其中有抑制单核，巨噬细胞移动的因子（MIF）及抑制多型核白细胞移动的因子（LIF）。

正常淋巴细胞无此反应。

欲知人或动物是否存在对某种抗原的致敏T细胞——特异的细胞免疫反应，可将其淋巴细胞与抗原一起培养，从有无MIF或LIF产生来做判断。

这两种细胞免疫反应（MMIF）（或迟发型变态的反应）的体外检查法分别叫做单核细胞移动抑制试验或白细胞移动抑制试验（LMIF）。

人体多采用LMIF检查。

检查白细胞移动抑制因子的存在，是借其抑制白细胞移动的生物活性为指标的，依观察白细胞移动的方式不同，移动抑制试验有三种不同的方法，即毛细管法，琼脂糖打孔法及琼脂糖微滴法，这里介绍毛细管法。

将有特异细胞免疫（致敏）人的白细胞（包括各种白细胞）装入毛细玻璃管中培养，24小时后，白细胞从管中向外移动呈扇状，若培养液加入相应的抗原，能使致敏T细胞放出LIF，白细胞就不能或不能充分从管中向外移动。

与不加抗原的对照相比较，显示出白细胞移动受抑制的现象。

材料1．抗原：抗原种类因实验目的不同而选定，用细胞培养液配成一定浓度供使用。

本试验采用结核杆素或pHA。

2．豚鼠抗凝血清3．毛细玻璃管：内径为0.8~1mm。

两端粗细一致。

长7.8cm4．细胞培养液：199培养液或1640培养液。

5．培养小室或盖片6． Hanks液。

7．淋巴细胞提取液8．离心机、试管、滴管等。

方法1．淋巴细胞提取：同E形花环试验2．用无菌镊子夹毛细管，插入细胞悬液中，使细胞悬液借毛细管现象进入毛细管内，在离上端7~8mm 时，将毛细管取出，装入各毛细管中，使细胞悬液高度力求相对等。

3．将毛细管空端经火焰封固端朝下置试管中，于水平离心机内1000转/5，10分钟。

取出毛细管可见细胞被压紧里4~6mm高的柱，表层发白主要是白细胞，下层发红为红、白细胞混合存在。

用小砂轮在毛细管壁的细胞——液体界面处划痕，小心折断。

人巨噬细胞移动抑制因子(MIF)试剂盒使用方法检测范围：96T4.25μg/L -100μg/L使用目的：本试剂盒用于测定人血清、血浆及相关液体样本中巨噬细胞移动抑制因子(MIF)含量。

实验原理本试剂盒应用双抗体夹心法测定标本中人巨噬细胞移动抑制因子(MIF)水平。

用纯化的人巨噬细胞移动抑制因子(MIF)抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入巨噬细胞移动抑制因子(MIF)，再与HRP标记的巨噬细胞移动抑制因子(MIF)抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经过彻底洗涤后加底物TMB显色。

TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。

颜色的深浅和样品中的巨噬细胞移动抑制因子(MIF)呈正相关。

用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），通过标准曲线计算样品中人巨噬细胞移动抑制因子(MIF)浓度。

试剂盒组成1 30倍浓缩洗涤液20ml×1瓶7 终止液6ml×1瓶2 酶标试剂6ml×1瓶8 标准品（200μg/L）0.5ml×1瓶3 酶标包被板12孔×8条9 标准品稀释液 1.5ml×1瓶4 样品稀释液6ml×1瓶10 说明书1份5 显色剂A液6ml×1瓶11 封板膜2张6 显色剂B液6ml×1/瓶12 密封袋1个标本要求1．标本采集后尽早进行提取，提取按相关文献进行，提取后应尽快进行实验。

若不能马上进行试验，可将标本放于-20℃保存，但应避免反复冻融2．不能检测含NaN3的样品，因NaN3抑制辣根过氧化物酶的（HRP）活性。

操作步骤1.标准品的稀释：本试剂盒提供原倍标准品一支，用户可按照下列图表在小试管中进行稀释。

100μg/L 5号标准品150μl的原倍标准品加入150μl标准品稀释液50μg/L 4号标准品150μl的5号标准品加入150μl标准品稀释液25μg/L 3号标准品150μl的4号标准品加入150μl标准品稀释液12.5μg/L 2号标准品150μl的3号标准品加入150μl标准品稀释液6.25μg/L 1号标准品150μl的2号标准品加入150μl标准品稀释液2.加样：分别设空白孔（空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同）、标准孔、待测样品孔。

巨噬细胞去除实验去除巨噬细胞是研究巨噬细胞功能的重要方法。

巨噬细胞可吞噬clodronate Liposome，在溶酶体的作用下，clodronate可释放出来，当其达到一定浓度时，可引起巨噬细胞的凋亡，从而去除巨噬细胞。

clodronate Liposome可局部注射去除注射部位临近的巨噬细胞，如肺、膝关节、肿瘤局部和脑等；也可尾静脉或腹腔注射去除循环途径中的单核巨噬细胞，如肝脏和脾脏中的巨噬细胞。

1.脂质体的准备荷兰Amsterdam的Vrije University 的Nico van Rooijen教授可免费提供10ml的clodronate Liposome进行预实验，可通过以下网站注册后索要，一般订后2-3周会寄到，4度避光保存，一个月内进行实验。

如预实验结果好，可向他购买或合作。

2.脂质体的体内注射隔日尾静脉注射200ul clodronate liposome，根据实验要求制定注射日程。

通过免疫组化或流式检测巨噬细胞的去除效率。

尾静脉注射方法：1.将小鼠放在倒扣的饭盒内，从孔口拉出尾巴，小鼠的尾部有2条动脉和3条静脉，2条动脉分别在尾部的背侧面和腹侧面，3条静脉呈品字型分布,一般采用左右两侧的静脉；2.将纱布浸泡于约70度的温水中，拿出后包裹尾巴，以达到使尾部血管扩张及软化表皮角质的目的；3.行尾部静脉注射时，以左手拇指和食指前后摁住鼠尾，留出约2cm一段，使皮肤紧张，静脉更为充盈，右手持1ml针头注射器，使针头与静脉平行(小于30°角)，从尾巴的下1/4处进针，开始注入药物时应缓慢，仔细观察，如果无阻力，无白色皮丘出现，说明已刺入血管，可正式注入药物。

4.有的实验需连日反复尾静脉注射给药，注射部位应尽可能从尾端开始，按次序向尾根部移动，更换血管位置注射给药。

拔出针头后，用棉球按住注射部位轻压1-2min，止血。

单核－巨噬细胞吞噬功能测定单核－巨噬细胞在机体免疫反应中起着重要作用，因此，检测单核－巨噬细胞功能对于了解机体的免疫功能状态具有重要意义。

小鼠巨噬细胞吞噬功能试验（体外法）1、原理巨噬细胞具有吞噬异物的功能，将巨噬细胞与被吞噬物（鸡红细胞、白色念珠菌、白色葡萄球菌等）共同温育,染色，在油镜下计数吞噬异物的巨噬细胞的吞噬百分率和吞噬指数，以此判断巨噬细胞的吞噬功能，从而评价机体的免疫状态。

2、方法（1）．小鼠巨噬细胞制备实验前三天每只小鼠腹腔注射1％可溶性淀粉1 ml。

实验时眼球放血、断椎处死小鼠，碘酒、洒精消毒皮肤，剪开腹部皮肤，暴露腹膜，用镊子夹起腹膜剪开一小口（注意避开血管）用生理盐水(或1640）灌注腹腔,收集腹腔液于试管中（约4 ml），1500 r/min，离心10 min，去上清,沉积细胞用生理盐水(或1640)洗二次，离心转速、时间同上。

最后沉积细胞用含10%小牛血清1640配成适当浓度备用(1～2×106／ml)。

（2）被吞噬物的制备1）．鸡红细胞制备从鸡翼下抽取静脉血，加入5倍量Alsever液(2。

05 g葡萄糖,0.42 g NaCl,0.8 g枸橼酸钠5H2O、0.55 g枸椽酸，加双蒸水到100 ml，加热溶解后过滤分装，8磅高压灭菌，4℃保存)，置4℃可以保存1个月.用前取适量鸡红细胞悬液，用PBS洗涤二次后配成1％的浓度备用。

2）．白色念珠菌制备将白色念珠菌接种于沙氏平皿培养基中，培养48小时，收集菌,用适量生理盐水配成悬液，100℃，煮沸30 min灭活,离心去掉上清,再用1%美兰染色30 min，用生理盐水洗涤二次，用生理盐水配成1×108／ml 菌悬液，4℃冰箱保存备用.3、操作取巨噬细胞0.5 ml加1％鸡红细胞或l×l08／ml白色念珠菌悬液0。

5ml，置37℃温育30min。

取2滴混合液置玻片上加盖玻片，在高倍镜下观察计数，或离心1000r／min，10min,取细胞沉淀混悬液制成涂片，甲醇固定,姬姆萨染色、油镜观察计数。

一、实验目的1. 了解巨噬细胞的迁移特性及其影响因素。

2. 探讨巨噬细胞在炎症反应和免疫调节中的作用。

3. 为后续研究提供实验依据。

二、实验材料1. 实验动物：昆明小鼠（体重20-25g，雌雄不限）。

2. 实验试剂：小鼠巨噬细胞分离试剂盒、Ficoll分离液、细胞培养液、PBS缓冲液、多聚赖氨酸、荧光素标记的小鼠红细胞（MRBC）、FITC标记的小鼠巨噬细胞（MAC）。

3. 实验仪器：离心机、倒置显微镜、荧光显微镜、酶标仪、培养箱等。

三、实验方法1. 巨噬细胞分离与培养（1）小鼠腹腔巨噬细胞分离：无菌操作下，取昆明小鼠腹腔液，加入Ficoll 分离液，离心分离出巨噬细胞。

（2）细胞培养：将分离出的巨噬细胞加入细胞培养液，置于37℃、5%CO2的培养箱中培养。

2. 巨噬细胞迁移实验（1）细胞标记：将巨噬细胞用FITC标记，MRBC用荧光素标记。

（2）迁移实验：将培养好的巨噬细胞与MRBC混合，加入多聚赖氨酸包被的盖玻片，置于37℃、5%CO2的培养箱中培养。

（3）观察与分析：使用倒置显微镜观察巨噬细胞在盖玻片上的迁移情况，使用荧光显微镜观察巨噬细胞与MRBC的相互作用。

3. 影响巨噬细胞迁移的因素（1）炎症因子：将巨噬细胞与不同浓度的炎症因子（如IL-1β、TNF-α等）共培养，观察巨噬细胞的迁移情况。

（2）细胞因子：将巨噬细胞与不同浓度的细胞因子（如IFN-γ、M-CSF等）共培养，观察巨噬细胞的迁移情况。

四、实验结果1. 巨噬细胞在盖玻片上的迁移情况：巨噬细胞在多聚赖氨酸包被的盖玻片上能够迁移，且迁移速度较快。

2. 巨噬细胞与MRBC的相互作用：巨噬细胞能够吞噬MRBC，并对其产生明显的荧光信号。

3. 影响巨噬细胞迁移的因素：（1）炎症因子：IL-1β和TNF-α能够促进巨噬细胞的迁移，而IFN-γ则抑制巨噬细胞的迁移。

（2）细胞因子：M-CSF能够促进巨噬细胞的迁移，而IFN-γ则抑制巨噬细胞的迁移。

比较四种不同来源巨噬细胞诱导方案为探讨人外周血单核细胞、人多能干细胞(hPSC)、人脐血CD34＋造血干细胞和人白血病细胞系THP-1 这四种来源巨噬细胞诱导方案的区别，我们通过监测不同诱导条件下巨噬细胞表型分子及其功能形态，确定这四种来源巨噬细胞的功能。

实验方法：选择上述四种来源巨噬细胞作为研究对象，对其研究内容主要包括：①形态观察；②采用流式细胞术对其表型分子进行检测。

实验一：人外周血单核细胞诱导成巨噬细胞实验方案1、实验Protocol注释：免疫磁珠纯化CD14 单核细胞体外诱导成巨噬细胞2、实验结果展示（1）磁珠分选纯度流式鉴定结果图磁珠分选前PBMC中单核细胞占比10%，分选后CD14阳性率为85.8%，代表磁珠分选技术可以获得高纯度的CD14单核细胞，如下是结果图：注释：黑色为同型对照，红色的峰代表样本管（A：分选前PBMC样本B：分选后阴性成分C：分选后阳性成分）（2）巨噬细胞形态特征结果图细胞培养24h之后，大部分开始贴壁，细胞体积仍然比较小，少部分开始伸出伪足；培养到第3天，细胞体积增大，伪足开始变得明显；培养到第6天，伪足没有进一步增加或者伸展，细胞贴壁牢固，体积开始进一步增大，较大的细胞直径可达40-50微米，形状从不规则逐渐变成椭圆形，大部分细胞呈煎蛋状，小部分细胞呈梭型，培养液中的悬浮细胞与第三天相比没有什么区别。

注释：从左到右依次是培养d1、d3、d6结果图（3）巨噬细胞吞噬功能检测结果图a：巨噬细胞培养到第7天，进行吞噬功能检测，流式细胞仪显示，巨噬细胞阳性率为46%，在数量上稍微减少，根据细胞的状态和贴壁生长方式可以判断基本上是巨噬细胞；b：靶细胞和效应细胞共培养两个小时后，进行流式检测，见下图，82%的巨噬细胞（包含CD14 和CD14-）吞噬了淋巴瘤细胞，代表巨噬细胞有很强的吞噬能力。

3、实验结论单核来源的巨噬细胞，通过应用免疫磁珠法分离CD14细胞，经过体外的诱导分化培养成巨噬细胞，可以建立高纯度的人外周血来源的巨噬细胞培养体系，为免疫细胞的后续研究提供基础。