PCR-ELISA端粒酶检测法
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端粒酶活性检测方法页数:3
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端粒酶基本原理及技术方法页数:9
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CML端粒酶活性检测的临床意义页数:2
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《端粒酶逆转录酶活性的调节机制》页数:26
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端粒酶活性的检测方法探索
端粒酶活性的检测方法探索端粒酶是一类重要的酶，参与维持染色体稳定性和基因组完整性的功能。
它能够在染色体末端的端粒上加上重复序列，减缓染色体的缩短和衰老过程。
如何准确检测端粒酶活性一直是科学家们关注的研究领域。
本文将探索端粒酶活性的检测方法，以期为相关研究提供参考。
一、端粒酶活性检测方法一：荧光探针法荧光探针法是一种常用的端粒酶活性检测方法。
通过在特定条件下，在待测物中加入有机荧光探针，探针与端粒酶发生作用，从而发出特定的荧光信号。
这种方法基于对荧光信号的监测，能够间接地反映端粒酶的活性水平。
二、端粒酶活性检测方法二：聚合酶链反应法聚合酶链反应法（PCR）是一种常用的DNA扩增技术，也可以用于测定端粒酶活性。
该方法基于端粒酶对模板DNA进行延伸，通过PCR扩增得到的产物进行分析，进而检测端粒酶的活性。
三、端粒酶活性检测方法三：细胞培养法细胞培养法是一种直接检测端粒酶活性的方法。
研究人员通过将待测样本细胞转染至全新培养基中，利用培养过程中对细胞进行观察和分析，评估端粒酶活性的水平。
四、端粒酶活性检测方法四：质谱法质谱法是一种高灵敏度的分析方法，可用于检测端粒酶活性。
通过质谱仪对待测样本进行分析，能够获得准确的质谱图谱，从而判断端粒酶活性的高低。
该方法具有非常高的分析精确度和灵敏度。
五、端粒酶活性检测方法五：电泳法电泳法常用于检测DNA分子的长度和限制性内切酶剪切位点。
端粒酶活性检测也可以借助电泳技术进行。
使用特定试剂对待测物进行限制性内切，然后利用电泳仪进行分析，通过分析DNA片段的长度和数量变化，来推测端粒酶的活性。
六、总结与展望端粒酶活性的准确检测对于揭示细胞衰老、肿瘤等疾病的发生机制以及判断药物的疗效具有重要意义。
本文介绍了荧光探针法、聚合酶链反应法、细胞培养法、质谱法和电泳法等常用的端粒酶活性检测方法。
随着科学技术的不断进步，我们相信将会有更多更准确的方法被开发和应用于端粒酶活性的检测。
这些方法的发展有望为研究人员提供更深入的了解端粒酶活性的机制以及其在疾病治疗中的应用提供更强有力的证据。
PCR-ELISA检测端粒酶活性的方法及其在人体肿瘤中的应用
PCR-ELISA检测端粒酶活性的方法及其在人体肿瘤中的应用蔡春友;张维铭;刘霜;孙保存;于士柱;杨军谦【期刊名称】《中国肿瘤临床》【年(卷),期】2000(027)001【摘要】目的:介绍PCR-ELISA端粒酶活性测定方法,并对不同组织来源肿瘤端粒酶活性检测结果进行分析.方法:采用PCR-ELISA端粒酶活性检测方法对299例不同组织来源肿瘤端粒酶活性进行检测.结果:本组结果显示PCR-ELISA端粒酶活性测定方法在敏感性与特异性方面与国外报道的同位素方法结果一致.在多种人类恶性肿瘤组织中可检出端粒酶活性,而与各种肿瘤对应的正常组织及良性病变中则多为阴性.结论:本组结果提示PCR-ELISA法为一高敏感的半定量评价端粒酶活性的方法,有可能成为评价肿瘤恶性程度的重要参考标志.【总页数】3页(P14-16)【作者】蔡春友;张维铭;刘霜;孙保存;于士柱;杨军谦【作者单位】天津医科大学实验中心分子生物中心,天津市,300070;天津医科大学实验中心分子生物中心,天津市,300070;天津市第二中心医院;天津医科大学病理教研室;天津市神经病学研究所;天津医科大学实验中心分子生物中心,天津市,300070【正文语种】中文【中图分类】R73【相关文献】1.PCR-ELISA和PCR-PAGE法检测血液肿瘤细胞株的端粒酶活性 [J], 何冬梅;张洹2.人体涎腺肿瘤细胞端粒酶活性检测 [J], 栗清朝;曹选平;刘学军;吴豪阳;张彦喜3.PCR-ELISA方法在转基因大豆检测中的应用 [J], 单宏4.PCR-ELISA检测尿液中膀胱癌脱落细胞端粒酶活性及临床意义 [J], 高敏5.PCR-ELISA法检测消化道恶性肿瘤端粒酶活性 [J], 赵家明;叶锋;王旭光;关惠军因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
PCR-EIA法检测端粒酶活性及其临床应用
!PCR-EIA法检测端粒酶活性及其临床应用陈卫群1，陈和明2，胡元佳1（1.中南大学湘雅医学院检验系临床生化教研室，长沙410013；2.中南大学湘雅二医院心胸外科，长沙410011）［摘要］目的：探讨用PCR-EIA法检测人端粒酶活性及其临床应用。
方法：利用kim法处理细胞和组织标本及扩增端粒酶产物，引物TS用生物素标记，CX用地高辛标记，PCR产物与包被有链亲和素的酶标板结合，并与酶标抗地高辛抗体反应，用TMB显色。
结果：PCR-EIA法与TRAP-银染色法有很好的相关性，批内变异系数CV为4.138%，在30例各种恶性肿瘤组织中端粒酶活性检出率为90%，28例癌旁组织中为7.1%。
结论：该法具有较好的灵敏度与重复性，无同位素污染，较银染色法更为简便、快速，检测成本低，无需特殊仪器，适合于各级医院推广。
［关键词］端粒酶活性；肿瘤；多聚酶链反应；酶多重免疫测定技术［中图分类号］R446.61［文献标识码］A［文章编号］1000-5625（2002）03-0221-03(uantitation of telomerase activity using the polymerase chain reaction-based enzyme immunoassay and its clinical applicationCHEN Wei-gun1，CHEN He-ming2，HU Yuan-jia1（1.Department of Clinical Biochemistry，Xiangya School of Medicine，Central South Uniuersity，Changsha410013；2.Department of Thoracic and Cardiac Surgery，Second Xiangya Hospital，Central South Uniuersity，Changsha410011，China）Abstract：Objective To investigate detective methodoIogy of teIomerase activity and its cIinicaI appIica-tion.Methods The teIomerase activity was guantitated by poIymerase chain reaction-base enzyme immunoassay （PCR-EIA）.The TS primer was biotinyIated（TS-B），and CX primer was digoxigeninated（CX-D）.The ampIi-cons containing TS-B were combined with microtiter pIate coated streptavidin，then combined with anti-digoxi-genin antibody IabeIed with POD and finaIIy reacted to tetramethyIbenzidine substrate soIution.Results TeIom-erase activity measured by the PCR-EIA method was comparabIe to that obtained from TRAP-siIver stain protocoI.The CV of the PCR-EIA method was4.138%.TeIomerase activity was detected in90%of various tumer tis-sues.In controI tissues，teIomerase activity was detected onIy in7.1%.Conclusion The PCR-EIA method of-fers a rapid，guantitative，and nonisotopic assay for the determination of teIomerase activity.It is simper than siI-ver stain protocoI.The detection of teIomerase activity may pIay a significant roIe in the diagnosis of cIinicaI tu-mors.Key words：teIomerase activity；neopIasms；poIymerase chain reaction；enzyme-muItypIied im-munoassay technigue［BuII Hunan Med Univ，2002，27（3）：0221-03］端粒酶活性的表达与细胞的衰老凋亡和永生化密切相关，普遍认为端粒酶在肿瘤的发生发展中具有重要作用。
酶联免疫法和pcr
酶联免疫法和pcr
酶联免疫法（ELISA）和聚合酶链式反应（PCR）是两种常用的
生物医学实验技术，它们在医学诊断、生物学研究和生物制药等领
域发挥着重要作用。
首先，让我们来看看酶联免疫法。
酶联免疫法是一种用于检测
特定蛋白质或其他分子的方法。
它利用抗体与待测分子结合的原理，通过酶的作用产生可测量的信号。
ELISA广泛应用于临床诊断，例
如检测HIV抗体、肿瘤标志物等。
它也被用于科研领域，用于检测
蛋白质相互作用、测定蛋白质浓度等。
接下来，让我们来了解一下聚合酶链式反应（PCR）。
PCR是一
种用于扩增DNA片段的技术。
它通过循环反应使得特定DNA区段在
体外被放大，从而能够在实验室中大量复制特定的DNA序列。
PCR
在基因组学研究、医学诊断、法医学和生物学研究中有着广泛的应用。
例如，在病毒检测中，PCR可以被用来检测病毒的DNA或RNA，
从而帮助诊断疾病。
两种技术各有其优势和局限性。
ELISA对于蛋白质的检测具有
高灵敏度和特异性，但不能用于检测DNA或RNA。
而PCR能够扩增
特定的DNA序列，但对于蛋白质的检测能力有限。
因此，在实际应用中，科研人员和临床医生通常会根据具体的研究目的或临床需求选择合适的技术。
总的来说，酶联免疫法和PCR都是生物医学领域中非常重要的实验技术，它们在医学诊断和科学研究中发挥着不可替代的作用。
希望这样的回答能够满足你的需求。
端粒酶活性检测
端粒酶活性检测（TRAP EZE Telomerase Detection Kit）实验前准备1.试剂盒中需要分装保存的试剂：50X dNTP 5ul/管，-20℃保存2.Telomerase positive Cells的处理：用200ul CHAPS Lysis Buffer溶解，然后分装至10ul/管，-85℃至-75℃保存；使用时用CHAPS Lysis Buffer按1：20稀释3.自备试剂：RNase inhibitor，Taq Polymerase（native，without BSA；Fermentas），PBS（Mg2+and Ca2+-free）4.设备及耗材：2.5ul，10ul，100ul加样器及对应Tip，200ul EP管，1.5ul EP管（以上耗材均要求RNase-free）冷冻离心机，PCR仪，PAGE电泳系统，凝胶成象系统。
实验步骤1．PBS洗去残余培养基；2．CHAPS Lysis Buffer 中加入RNase inhibitor，终浓度100-200U/ml（0.1-0.2U/ul）；3．将样本加入CHAPS Lysis Buffer中，浓度200ul/105-106cells，用枪混匀；4．冰浴30mins；5．4℃离心12000g，20mins；6．吸取上清，分装至200ul EP中，约10-15ul/管，冷冻保存于-70℃冰箱。
*可取一小管样品测定蛋白浓度，具体方法见《蛋白质浓度测定（BCA TM Protein Assay Kit）》7．配制反应液：（25ul体系）10X TRAP Reaction Buffer 2.5ul50X dNTP Mix 0.5ulTS Primer 0.5ulTRAP Primer Mix 0.5ulTaq Polymerase （5units/ul）0.2ul（1unit）dH2O 19.8ulTemplate 1.0ul每次反应都应包括：①样本（蛋白含量＜1.5ug per assay），②样本热敏对照（85℃，10mins），③阳性对照（可用试剂盒自带的Telomerase positive Cells，也可用其他公认有端粒酶活性的细胞，如Hela细胞），④阳性热敏对照（85℃，10mins），⑤阴性对照，⑥空白对照（CHAPS Lysis Buffer）8．将混合好的反应管置于PCR仪中反应，程序：30℃，30min s→94℃，30s→59℃，30s↖70℃，1mins↙30-33cycles9．12%非变性PAGE电泳，上样4ul每孔，400V，1.5-2h10．银染：①将凝胶小心倒入染色槽中，加入500ml固定液，盖好盖子放在水平摇床上轻摇10-15mins②小心倒掉固定液，用二蒸水洗一遍再加入500ml银染液，盖好盖子放在水平摇床上轻摇10-15mins③小心倒掉银染液，用二蒸水洗一到两遍再加入500ml显色液，放在水平摇床上轻摇至条带显色④小心倒掉显色液，用二蒸水洗一遍，然后用保鲜膜包好凝胶至凝胶成相系统中拍照。
PCR-ELISA检测尿液中脱落细胞端粒酶活性及临床意义
１．３脱落细胞 取受检者新鲜尿液１０ｍｌ作细胞学 患者的检出率较低，达（２９．４％），在肾癌患者中检出
万方数据
１０
壶盘匿堂捡堕塑！生笠１２鲞筮！塑
的５例端粒酶阳性标本中，手术中发现癌肿均已侵 的分子生物方法，为了更进一步证实其可行性，还需
犯到肾盂。３０例其它泌尿系感染者中，５例肾结核 要积累更多、更好的临床病例。
１．２组织标本６２例膀胱癌组织，取自膀胱镜活 病呈正相关（Ｐ＜０．０１）。
检肿块及手术切除肿瘤组织块。均已经病理证实。 ３．２尿液脱落细胞中端粒酶活性检测结果（见表
根据ＷＨＯ标准将肿瘤组织分级、分期。标本取后 １）。１２４份尿标本中，６２例膀胱癌患者的尿液脱落
置一８０℃保存。
细胞端粒酶活性表达最强，达（７５．８％）。１７例肾癌
１．１标本来源采集来自门诊及住院病人的新鲜 ３结果
晨尿１２４份尿液标本，其中膀胱癌患者６２例，肾癌 ３．１ 膀胱癌组织标本中端粒酶活性的表达６２例
患者１７例，其它泌尿系炎性患者３０例，正常人对照 膀胱癌肿块标本中，５９例表达端粒酶活性（９５．
１５例。患者年龄在３８—８１岁，平均年龄在５９．５岁。 ２％）。组织肿块中端粒酶活性的表达与膀胱癌的发
ｆｒｏｍ ｈｅａｌｔｈｙ ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌｓ ａｎｄ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｓｙｓｔｅｍｉｃ ｌｕｐｕｓ ｅｒｙ－
ｔｈｅｍａｔｏｓｍ（ＳＬＥ）．Ｃｌｉｎ ＥＸＰ Ｉｍｍｕｎｏｌ，１９９６，８７：４２２—４８８
ＰＣＲ—ＥＬＩＳＡ检测尿液中脱落细胞端粒酶活性及临床意义
山东东阿县人民医院 （２５２２０１） 张桂英邓法文
临床病理分期
ｐＴｉｓ／ｐＴａ
ｐＴｌ
例数
４０ １４
阳性数
pcr-elisa
PCR 定量技术--PCR ELISA来源：互联网 作者：未知 发布时间：2006-10-18PCR 自诞生以来，人们就在努力探索PCR 定量的方法。
荧光素染色凝胶电泳在PCR 最初的一段时间是唯一的检测技术，因此人们在凝胶电泳的基础上使用扫描照片进行光密度分析，以求实现PCR 的相对定量。
但是由于普通凝胶电泳检测本身的不特异性，只能进行粗略的相对定量，难以满足人们日益对精确定量的渴望，不过由于普通凝胶电泳光密度分析简捷易行，成本低，目前还是科研还很常用。
但是难以满足临床应用的要求。
由于固相捕获技术的成熟和应用，特别是酶联免疫吸附试验（ELISA ）的成功，给核酸定量提供了一个思路。
此后，应用固相捕获的PCR 定量技术应运而生。
即在PCR 扩增以后，在微也板上借用酶联免疫吸附试验（ELISA ）的原理，使用酶标抗体，进行固相杂交来实现定量。
被称为PCR －ELISA ：PCR －ELISA 原理：首先，使用亲和素包被微孔板，再用生物素标记捕获探针3`端（捕获探针5`端和待检靶序列5`端的一段互补）通过生物素和亲和素的交联作用将捕获探针固定在微孔上，制成固相捕获系统。
其次，在扩增时，引物用抗原（生物素、地高辛、荧光素酶等）标记，这样扩增产物中就会代有抗原。
用扩增产物与微孔上的捕获探针杂交，靶序列被捕获。
再在微孔中加入用辣根过氧化物酶标记的抗体，抗体与靶序列上的抗原结合，再加入底物使之显色。
从而实现定量。
虽然PCR 经过长时间的探索，PCR －ELISA 逐渐成熟，并有了不同的改进版本，但总的还是没有脱离固相分离、酶标抗体的经典范畴。
PCR －ELISA 的步骤：1.核酸提取和制备2.进行PCR 扩增3.微孔预杂交4.产物杂交5.显色6.检测分析PCR－ELISA的优点：PCR－ELISA相对于凝胶光密度定量，无论是灵敏度、特异性、准确度上都是很大的提高，能满足临床要求。
它为PCR提供了第一个严格意义上的定量方法。
人端粒酶测定ELISA方法
pre-coated with streptavidin and post-coated with blocking reagent
Cover foil
• 3 foils • To prevent evaporation during incubation of
the MP modules
Preface
1.2 Kit Storage and Stability
• The unopened kit will remain stable at Ϫ15 to Ϫ25°C until the expiration date printed on the label.
• The kit will be shipped on dry ice.
with the same sequence as a telomerase product with 8 telomeric repeats (TS8)
Control template, high
• 35 l, 0.1 amol/l • Ready-to-use solution • Contains a positive control template DNA
4.1 Data Analysis
20
4.2 Typical Results
21
5. References .................................................................................................................... 23
standard (IS)
Washing buffer, • 50 ml
Cover foil
• 3 foils • To prevent evaporation during incubation of
the MP modules
Preface
1.2 Kit Storage and Stability
• The unopened kit will remain stable at Ϫ15 to Ϫ25°C until the expiration date printed on the label.
• The kit will be shipped on dry ice.
with the same sequence as a telomerase product with 8 telomeric repeats (TS8)
Control template, high
• 35 l, 0.1 amol/l • Ready-to-use solution • Contains a positive control template DNA
4.1 Data Analysis
20
4.2 Typical Results
21
5. References .................................................................................................................... 23
standard (IS)
Washing buffer, • 50 ml
PCR-ELISA端粒酶检测法
PCR-ELISA端粒酶检测法发布日期:2007-6-27 热门指数:782 收藏端粒是真核生物染色体末端的特异D NA-蛋白结构，端粒DNA是一系列重复的富含G的DNA 序列，这一序列在生物进化中有高度的保守性（人重复序列为TTAGG G）。
已确认端粒在保护基因组DNA不被降解、防止染色体有害的结合（如染色体末端融合、重排、染色体移位和染色体缺失）中起重要作用。
由于DNA聚合酶不能复制线性DN A的最末端，多数正常体细胞的端粒末端每经一个复制循环就进行性缩短。
这一现象在体内和体外都得到证实，并且可能与高级真核生物的正常体细胞有限的繁殖能力有关。
这一活性可能在与细胞衰老有关的情况中起作用。
与体细胞相对照，生殖细胞是永生性的，它需要为将来器官形成保存全部的遗传信息。
因此它必须对抗端粒缩短。
这一工作通过在基因组染色体的末端添加新的端粒重复序列而完成。
端粒酶是一种核糖核蛋白，它们用自身的RNA成份的互补序列作模板，催化TTAG GG 重复序列加到染色体末端。
在大多数永生性细胞株和肿瘤细胞株中也可见端粒酶活性的表达。
端粒酶反应超越了细胞的增殖限制，这可能是恶性肿瘤发生的一个先决条件。
传统的端粒酶研究方法是以探针延伸为基础测定端粒酶活性。
由于需要大量的样品材料，且检验灵敏度受局限, 这一方法已被端粒重复扩增法（Telome ric Repeat Amplif icati on Protoc ol, TRAP）所取代。
标准的TRA P测定是通过PCR扩增端粒酶反应的产物，使用放射性标记，经凝胶电泳后，通过放射自显影显示结果。
这里介绍使用非放射性标记的检测端粒酶的新方法：活性光密度酶联免疫测定法。
这种方法具有如下特点：安全，无需使用放射性同位素一步反应，使用即用的混合物使端粒酶介导的引物延伸和P CR扩增可在一个试管中进行。
端粒酶活性检测
端粒酶活性检测什么是端粒酶活性检测端粒酶活性检测是一种用于测量细胞端粒酶活性的方法。
端粒酶是一种特殊的酶，它负责维持染色体末端的保护性结构，被称为端粒。
每次细胞分裂时，染色体末端的端粒会缩短一小段，导致细胞老化和损伤。
而端粒酶能够加上丢失的端粒序列，从而保持染色体的完整性和稳定性。
端粒酶活性检测可以帮助科研人员了解端粒酶在细胞中的表达和功能，进而揭示细胞老化、癌症等相关疾病的发生机制。
端粒酶活性检测的原理端粒酶活性检测的原理主要基于PCR（聚合酶链式反应）技术，结合端粒酶的特异性，通过测量PCR扩增产物的长度来间接判断细胞中端粒酶活性的强弱。
端粒酶活性检测通常采用两种主要的方法：1.TRAP（端粒重复序列扩增）方法：该方法通过PCR扩增端粒酶作用后产生的DNA片段。
首先，从细胞中提取总DNA，然后用端粒特异引物和通用引物进行PCR扩增。
PCR的产物是一个长度可变的DNA产物，在琼脂糖凝胶电泳或毛细管电泳分析后，可以通过观察DNA产物的长度来获得端粒酶活性的信息。
2.TRF（终端限制片段长度）方法：该方法通过限制性酶切和Southern blot等技术来测量端粒长度。
首先，从细胞中提取总DNA，然后用限制性酶切割DNA，产生一系列端粒片段。
然后，使用Southern blot技术将DNA片段转移到膜上，并与端粒特异性探针杂交。
最后，通过观察酶切后的DNA片段长度来推断细胞中端粒的长度和端粒酶的活性。
端粒酶活性检测的应用端粒酶活性检测在许多研究领域具有广泛的应用。
以下是一些常见的应用领域：1.细胞老化研究：端粒酶活性检测可以帮助研究者了解细胞老化的机制。
随着细胞的老化，端粒长度会逐渐变短，端粒酶活性也会随之下降。
通过测量端粒酶活性的变化，可以揭示细胞老化过程中端粒酶的作用和调控机制。
2.癌症研究：端粒酶在癌症细胞中常常被过度表达，维持了癌细胞的无限增殖能力。
端粒酶活性检测可以帮助研究者评估癌细胞中端粒酶的活性水平，从而了解癌细胞生长和扩散的机制，并为癌症的治疗提供新思路。
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PCR-ELISA端粒酶检测法
发布日期:2007-6-27 热门指数:782 收藏
端粒是真核生物染色体末端的特异DNA-蛋白结构，端粒DNA是一系列重复的富含G的DNA序列，这一序列在生物进化中有高度的保守性（人重复序列为TTAGGG）。
已确认端粒在保护基因组DNA不被降解、防止染色体有害的结合（如染色体末端融合、重排、染色体移位和染色体缺失）中起重要作用。
由于DNA聚合酶不能复制线性DNA的最末端，多数正常体细胞的端粒末端每经一个复制循环就进行性缩短。
这一现象在体内和体外都得到证实，并且可能与高级真核生物的正常体细胞有限的繁殖能力有关。
这一活性可能在与细胞衰老有关的情况中起作用。
与体细胞相对照，生殖细胞是永生性的，它需要为将来器官形成保存全部的遗传信息。
因此它必须对抗端粒缩短。
这一工作通过在基因组染色体的末端添加新的端粒重复序列而完成。
端粒酶是一种核糖核蛋白，它们用自身的RNA成份的互补序列作模板，催化TTAGGG 重复序列加到染色体末端。
在大多数永生性细胞株和肿瘤细胞株中也可见端粒酶活性的表达。
端粒酶反应超越了细胞的增殖限制，这可能是恶性肿瘤发生的一个先决条件。
传统的端粒酶研究方法是以探针延伸为基础测定端粒酶活性。
由于需要大量的样品材料，且检验灵敏度受局限, 这一方法已被端粒重复扩增法（Telomeric Repeat Amplification Protocol, TRAP）所取代。
标准的TRAP测定是通过PCR扩增端粒酶反应的产物，使用放射性标记，经凝胶电泳后，通过放射自显影显示结果。
这里介绍使用非放射性标记的检测端粒酶的新方法：活性光密度酶联免疫测定法。
这种方法具有如下特点：
安全，无需使用放射性同位素
一步反应，使用即用的混合物使端粒酶介导的引物延伸和PCR扩增可在一个试管中进行。
应用广泛，扩增后可适用于不同分析法。
灵敏，与放射性同位素TRAP测定相当。
可靠，准确、重复性好。
快速，6-8小时得到结果。
现介绍如下：
1.原理：
本法是建立在Kim等人描述的TRAP方法的基础上的，它将端粒酶介导的衍生产物进行PCR 扩增, 并与后序的ELISA法结合在一起。
本法可分如下几步：
（1）延伸/扩增：
第一步：端粒酶将端粒重复序列（TTAGGG）加到带有生物素标记的P1-TA引物的3’末端。
第二步：利用引物P1-TS和T2通过PCR扩增这些延伸出的产物，产生出的PCR产物带有特异的端粒酶-6-核苷酸的延伸产物。
（2）ELISA测定：
PCR产物变性后与Dig标记的端粒特异的重复检测探针杂交。
终产物可经生物素标记的探
针固定到亲和素包被的微量滴定板上。
固定的PCR产物可用与过氧化物酶交联的抗地高辛复合物（anti-Dig-POD）检出。
最后，经过分解底物TMB形成一种有色的反应物，再用酶标仪进行检测。
2.应用：
本法可用于从培养细胞和其他生物样品的抽提物进行端粒酶活性的高敏感性检测。
3.检测步骤：
3.1样品制备：
3.1.1细胞提取物的制备：
—按标准方法采集并进行细胞记数（trygan染色，使用血细胞计数器。
）
—每个反应取2*105细胞移入一个新的试管。
—2-8℃下以3000g离心10分钟形成细胞团。
—小心移去上清液，将细胞在PBS中重悬并重复离心步骤。
—小心移去上清液，细胞小团可放在-80℃下储存。
—若准备细胞提取物，将细胞小团在200ul裂解试剂中重悬，冰上预冷并提吸至少3次，冰中孵育30分钟。
如果将冷冻细胞团用于提取，加入裂解液前在冰上融化细胞团。
—2-8℃，16000g离心裂解物20分钟。
—小心移去上清液并移入新的离心管中。
保证将细胞残渣带入，我们推荐仅抽吸175ul 细胞提取物。
—继续进行TRAP反应。
—如不立即进行TRAP反应，将小份细胞抽提物在液氮中休克性冷冻，将提取物储存在-80℃。
3.1.2组织中提取物的制备：
—测定端粒酶活性的组织标本准备，需要小心的采样并保存临床材料，因为肿瘤细胞的污染可产生正常组织中的假阳性信号，而由于不恰当的保存也可在肿瘤样本中产生阴性信号。
如不是立即用于端粒酶PCR ELISA组织样本应以小片在液氮中休克性冷冻，并保存在-80℃。
—冰上孵育30分钟。
—2-8℃，16000g离心细胞裂解液20分钟。
可用冷冻台式离心机及离心管。
—小心将上清液移入新的离心管中，确保无组织残片被带入，我们建议仅抽提175ul组织提取物，以标准方法测定蛋白浓度，在液氮中休克性冷冻小份组织提取物，将提取物存放在-80℃。
3.2端粒酶重复序列扩增步骤（TRAP反应）。
—对于每一待例检测样本，先将25ul反应复合物加入适合PCR扩增的管中，加入1-3ul 细胞提取物（相当于1*103-3*103细胞或1-50ug总蛋白）。
并加入无菌水至总体积50ul，所有吸取步骤在冰上进行。
—将离心管置于PCR仪中，照下列步骤进行引物延伸/扩增反应。
3.3杂交及ELISA反应流程：
—每个样品取20ul变性试剂加入适宜的离心管中，若有大量样本，建议使用无核酸酶包被的微孔板MTP。
—加入5ul扩增产物，15-25℃孵育10分钟。
—每个离心管内加入225ul杂交缓冲液，用振荡器完全混匀。
（如需要，杂交混合物量可以用于二次检测扩增产物。
）
—取出100ul混合物加入试剂盒中已包被的微孔板的每个孔中，并用盖子盖住小孔以防蒸发。
—将MTP微孔板置于37℃，300rpm的振荡器中孵育2小时。
—弃去全部杂交液，以清洗缓冲液洗三次，每孔250ul每次至少30秒，小心弃去冲洗液。
—每孔加入100ul抗-DIG-POD工作液，用盖子盖上MTP，15-25℃（18-22℃）置于300rpm 的摇床上孵育30分钟。
—完全弃去溶液，以每孔250ul清洗缓冲液冲洗5次，每次至少30秒，小心弃去冲洗缓冲液。
—每孔加入100ulTMB底物溶液预热至室温，盖上盖子，在300rmp的摇床上孵育10-20分钟。
——不要移去反应底物，每孔加入100ul终止试剂以终止反应。
注意：加入终止液后等已反应的POD底物的颜色从蓝转黄，这是取得最高敏感度所必要的。
——使用ELISA酶标仪，测定加入终止液后30分钟内标本450nm吸收值（参照波长为690nm）。
4.结果分析：
吸光值为A450nm，参照空白对照读数（A690nm）。
4.1阴性对照：
将细胞提取物与无DNA酶的RNA酶预孵育，降解端粒酶内源性RNA作为检测端粒酶的阴性对照，另一种方法为热处理以取得阴性对照。
用RNA酶处理标本，阴性对照最大的吸收值为0.25A450nm-690nm，如果数值较高，整个实验包括TRAP反应需重新进行。
4.2阳性对照：
阳性对照的吸收值在底物反应20分钟后检测，应高于1.5（A450nm-A690nm），相当于使用1*103细胞进行检测。
如果数值较低，整个实验包括TRAP反应需重新进行。
4.3样本：
将样本的吸收值减去阴性对照的值。
如果吸收值的差异（ΔA）高于0.2（A450nm-A690nm）可认为端粒酶阳性。
5.常见问题分析及解决方案
1阳性对照信号过低或无
Ø 所用热循环仪的型号不适合所设的热循环程序，选择适宜的循环条件。
Ø 引物延长、扩增所用的水含有核酸酶。
必须使用无核酸酶的重蒸水（DEPC或Velcorin处理）来制备试剂。
Ø 试剂受核酸酶污染。
另换阳性对照细胞提取物及样本重复全部检测。
仔细检查是否污染了DNA酶及RNA酶。
Ø 孵育步骤未在300rmp振荡器下进行。
选用合适的振荡器。
Ø 抗DIG-POD工作液失效，必须使用新准备的抗DIG-POD工作液，检查抗DIG-POD工作液的酶活性是否失效并准备新鲜的工作液。
2阴性对照信号过高
Ø 阴性对照、裂解试剂、或反应混合物被端粒酶阳性细胞提取物污染，以RNA酶处理或65℃热处理10分钟是阴性对照失活。
重复包括扩增在内的整个实验。
Ø 阴性对照、裂解试剂、反应复合物、或其它试剂可能被以前实验的扩增产物所污染。
Ø 在检测步骤中，冲洗不充分，增加冲洗步骤。
Ø 与TMB底物溶液的孵育过长，加入TMB底物溶液20分钟内停止底物反应。