白血病微小残留病检测方法及临床意义

微量残留白血病检测方法及对急性白血病的临床意义急性白血病患者经化疗后达到完全缓解可达80%，但5年存活率仅30～40%[1]，究其根源是完全缓解后，体内仍含少量白血病细胞。

因此，对于微量残留白血病（MRD）的检测可更早预测急性白血病的复发。

本文对MRD检测方法以及对急性白血病的临床意义进行综述。

标签：微量残留白血病；检测；急性白血病检测方法：MRD常用的监测方法分以下几类：细胞遗传学方法、分子生物学方法和免疫学方法。

但这些方法都有一定局限性不能理想监测MDR。

1 细胞遗传学方法1.1 染色体核型分析多数白血病细胞伴随染色体核型的异常，如在AML中出现异常分裂象或数量结构的改变。

用此法检测MRD的个体差异大且敏感性差，近年此法研究少在此不多叙述。

1.2 荧光原位杂交技术荧光原位杂交技术（FISH）是利用荧光标记的特异染色体为探针检测白血病细胞中染色体的异常。

改善了传统染色体核型分析的缺点，具有高敏感度且操作简单等优点，可短时间分析较多的骨髓、外周血或组织细胞，检出难以识别的基因异常及断裂点的异常。

由于其检测的靶分子为基因，可避免由于表面抗原的改变造成的假阴性等问题。

荧光原位杂交技术的临床意义：在中国APL在AML中占有很大比例，90%以上的APL具有特征性融合基因PML-RARα，FISH为检测APL-MRD最常用的方法。

黄正刚等[2]用FISH检测了30例已达完全缓解并经三轮巩固治疗后的APL 患者，发现融合基因PML-RARα持续阳性的有3例并最终复发。

张济等[3]用FISH 检测34例完全缓解的APL患者，9例PML-RARα融合基因阳性的患者中3例检测结果为阴性；经巩固维持治疗后，4例PML-RARα融合基因阳性的患者中2例检测结果为阴性。

所以，FISH检测APL-MRD的敏感性有待提高。

2 免疫学方法2.1 多参数流式细胞仪检测（MFC）因成本較低准确度敏感度较高，为目前应用最广的方法，它是依据识别在白血病细胞表面联合表达的特异白血病相关免疫表型（LAIPs）。

世界最新医学信息文摘 2021年 第21卷 第2期5投稿邮箱：zuixinyixue@·论著·WT1基因在监测急性髓细胞白血病微小残留病中的临床意义许飞，李玲，马慧（宁夏医科大学总医院 血液科，宁夏　银川　750004）0　引言急性髓细胞白血病（AML ）是以异常分化的髓系细胞对骨髓，血液和其他组织的浸润为特征的血液系统恶性肿[1]。

虽然目前AML 的完全缓解率（CR ）可达到60%-80%，然而之后仍存在较高的复发率。

而微小残留病（MRD ）是AML 复发的主要原因，MRD 是指AML 经化疗后或骨髓移植后体内残留微量白血病细胞。

准确动态评估AML 患者治疗后的MRD 对尽早预测复发、评价疗效、指导个体化治疗、有效地延长患者生存期均有重要意义[2]。

同时进一步研究MRD 特征性分子标志对监测MRD 具有重要价值。

WT1基因存在于11p13q 染色体，其编码的转录因子通过参与造血干细胞正常分化与促进细胞异常过度增殖两个环节发挥重要作用。

许多血液系统肿瘤及实体肿瘤均高表达WT1基因，特别是在白血病中，WT1基因的表达被作为白血病细胞存在的标志。

同时，有研究报道WT1的mRNA 表达水平与白血病疾病活动情况密切相关[3]。

因此，本研究进一步探讨WT1的mRNA 水平是否可以作为AML 微小残留病的监测指标及其临床意义。

1　对象和方法1.1　研究对象。

2017年 6月至 2019年 6月宁夏医科大学总医院血液内科收治住院64例初发AML 患者。

所有AML 患者均符合国际FAB 诊断标准，经骨髓细胞形态学、免疫表型、细胞核型和分子生物学结果确诊。

其FAB 分型见表1。

诱导治疗及缓解后治疗均参照成人急性髓细胞白血病诊疗指南[4]。

经诱导缓解治疗后，其中46例患者达完全缓解，并进行长期随访，其中15例患者复发。

通过多参数流式细胞术（MFC ）检测完全缓解（CR ）及每次巩固化疗后 MRD 水平 230人次，平均 5 次/例（3-7 次/例），RT-PCR 检测每次巩固化疗后骨髓 WT1 基因表达水平 230人次，平均 5 次/例（3-7 次/例），同时检测骨髓细胞形态学的变化。

完全缓解急性白血病患者微小残留病的监测及其临床意义的开
题报告
一、研究背景
白血病是血液系统恶性肿瘤疾病之一，特点是骨髓或淋巴组织中存在大量异常细胞，导致正常血细胞受到抑制或代偿性增生，引起贫血、感染和出血等症状，危及生命。

随着白血病治疗的进步，尤其是多种化疗药物和造血干细胞移植等技术的应用，患者的生存期有了显著的提高。

然而，治疗过程中微小残留病的监测却成为了治疗方案制定、疗效判定和预后评估的重要指标。

微小残留病是指在化疗、放疗或干细胞移植等治疗结束后，血液或骨髓中仍存在极少数的癌细胞，虽然病情已经得到缓解，但极易引起复发。

因此，准确监测微小残留病的水平对于制定个性化的治疗方案、评估疗效和预测患者预后至关重要。

二、研究目的
本文旨在探讨完全缓解急性白血病患者微小残留病的监测和临床意义，以期为临床治疗提供参考依据和理论支持。

三、研究内容
1. 微小残留病的概念、类型和分类方法
2. 微小残留病监测的方法、指标和临床应用
3. 微小残留病与疾病预后的关系及其临床意义
4. 微小残留病监测在临床治疗中的应用
5. 微小残留病监测的前景及其存在的问题与挑战
四、研究意义
本文对完全缓解急性白血病患者微小残留病的监测及其临床意义进行了系统的探讨和总结，有利于促进治疗方案的个性化，提高患者的生存率和生命质量。

同时，探索微小残留病监测技术的进展和挑战，为临床医生提供了参考依据。

为了更好地开展研究，需要进一步加强医学科研团队的协作，建立统一的检测标准和质量控制体系，推广微小残留病监测技术的应用。

表观遗传学标记在急性白血病微小残留病检测中的临床意义【中图分类号】 r73 【文献标识码】a【文章编号】1672－3783(2011)05－0007－01随着对白血病发病机制的深入研究及其治疗方案的改进,白血病的完全缓解率也有明显的提高,但仍有一部分患者最终会复发。

近年来的研究发现, 白血病的复发与微小残留病密切相关。

微小残留病(minimal residual disease, mrd )是指经过诱导治疗达临床缓解时，白血病患者体内残留的少量白血病细胞。

对患者进行微小残留病监测对白血病的治疗和预后判断具有非常重要的意义。

检测mrd的关键是寻找分子基因标志。

细胞免疫表型及遗传学的异常改变在急性白血病mrd 检测中占有重要地位。

令人遗憾的是，这些方法只适用于少数患者，大多数患者并不具备遗传学的预后指标。

随着对急性白血病分子生物学发病机制研究的进步，人们把急性白血病的发生归结为抑癌基因和原癌基因通过遗传学和表观遗传学机制的发生异常改变［1］。

dna甲基化作为一种重要的表观遗传调控机制，其与肿瘤发生、发展以及检测相关机制的研究逐步成为研究的热点。

表观遗传学生物标记（epigenetic biomarkers），特别是dna 甲基化相关标记检测拥有遗传学标记、抗体等标志不具备的优势。

本文就mrd细胞分子遗传学的检测方法及dna甲基化检测mrd 的临床应用进行综述。

1 常用白血病mrd检测方法的研究进展1.1 分子生物学方法：遗传学的改变，包括染色体易位/缺失、基因突变等是白血病发生的基础，其所导致的正常基因表达调控紊乱和功能异常是白血病发生的主要原因。

异常的遗传学改变，已成为急性白血病临床检验资料的重要组成部分。

实时定量聚合酶链反应( rq-pcr ) 方法结合了pcr和荧光探针两种技术，通过定量检测白血病细胞中标志性基因实时观测mrd，是目前检测mrd最为敏感的方法，灵敏度可达10-4-10-5，已成为临床实验室建立mrd检测方法的首选。

㊃论㊀㊀著㊃∗通讯作者急性白血病完全缓解期检测微小残留病的临床意义赵㊀兰,许惠利∗(上海健康医学院附属嘉定区中心医院血液科,上海,201800)摘㊀要:㊀目的㊀探讨急性白血病(acute leukemia,AL)获得完全缓解(complete remission,CR)后检测微小残留病(minimal residual disease,MRD)的临床意义㊂方法㊀所有患者初诊时均进行骨髓免疫分型检测,从首次诱导缓解治疗结束后第14天开始,每3个月检测一次MRD,并动态监测,同时进行骨髓形态学检查㊂结果㊀MRD <10-4复发率为22．2%,MRD >10-3复发率为77．8%,MRD >10-2复发率为100%㊂结论㊀经过20例患者的MRD 检测显示:MRD <10-4的复发率低,MRD ﹥10-3的复发率高,MRD ﹥10-2提示近期复发㊂因此,MRD 对早期复发的判断㊁及早干预治疗和治疗方案的选择有着明显的指导意义㊂关键词:㊀急性白血病㊀完全缓解㊀微小残留病㊀临床意义[中图分类号]㊀R733．7㊀㊀㊀㊀[文献标志码]㊀A㊀㊀㊀㊀[文章编号]1009-6213(2021)02-0193-03Clinical Significance of Detecting Minimal Residual Diseases in Complete Remission of Acute LeukemiaZHAO Lan,XU Hui-lI ∗(Department of Hematology,Jiading District Central Hospital Affiliated Shanghai University of Medicine &Health Sciences,Shanghai,201800,China)Abstract :㊀Objective ㊀To investigate the clinical significance of detecting microresidual disease(MRD)after complete remission of acute leukemia(AL)．method ㊀All patients were tested for bone marrow immunotyping at the first consultation．From the 14th day after the first induced remission treatment,MRD was tested every 3months,and dynamically monitored．Bone marrow morphology was also performed．Results ㊀MRD <10-4relapse rate of 27%,MRD >10-3recurrence rate is 82%,MRD >10-2The relapse rate of is 100%．Conclusion ㊀The MRD test of 20patients showed that the recurrence rate of MRD <10-4was low,the recurrence rate of MRD >10-3was high,and MRD >10-2suggested a recent recurrence．Therefore,earlydiagnosis,early intervention treatment and treatment options have obvious guiding significance．Key words :㊀Acute leukemia;Complete remission;Minimal residual disease;Clinical significance㊀㊀急性白血病(acute leukemia,AL)确诊时体内的白血病细胞数量大约为1010~1012,随着支持治疗的加强㊁多药联合方案的应用㊁大剂量化疗和HSCT 推广,AL 达到完全缓解(complete remission,CR)期较前有所提高,此时体内的白血病细胞数量降至108~109㊂据国外文献报道,大剂量化疗后完全缓解率约为50%~80%㊂CR 后复发是目前急性白血病面临的难题之一㊂近年来研究发现,微小残留病(minimal re-sidual disease,MRD)与白血病复发密切相关,体内残留的白血病细胞,为疾病复发的根源㊂为争取患者长期无病生存(disease-free survival time,DFS)和痊愈,必须对AL 患者的治疗方案进行优化,同时对MRD 进行动态监测,实时评估疗效,指导治疗及评价预后[1]㊂本研究通过对20例急性白血病缓解后的病人进行MRD 动态监测及分析,评价MRD 在指导治疗及早期预测复发的意义㊂1㊀资料与方法1．1㊀一般资料㊀收集20例患者均为上海健康医学院附属嘉定区中心医院2010年8月至2012年12月住院病人,统计截止日期为2018年12月底㊂根据㊃391㊃㊀血栓与止血学2021年第27卷第2期WHO MICM分型法确诊的AL患者,其中急性髓系白血病(AML)18例,急性淋巴细胞白血病(ALL)2例,年龄17~80岁,平均年龄为44岁,男10例,平均年龄为42．6岁,女10例,平均年龄为55岁㊂1．2㊀治疗方案㊀AML诱导缓解方案采用标准DA (柔红霉素+阿糖胞苷)㊁HA(高三尖杉酯碱+阿糖胞苷)㊁IA(去甲氧柔红霉素+阿糖胞苷)方案,ALL诱导缓解方案采用CVDP方案㊂巩固化疗AML采用DA㊁MA㊁HA㊁HD-Ara-C等,ALL采用CVDP㊁MA㊁HD-MTX 等方案,缓解期定期常规鞘注预防中枢神经系统白血病(CNSL)㊂1．3㊀临床完全缓解标准参照‘实用内科学“(第十五版)急性白血病CR 标准㊁成人急性髓系白血病中国诊疗指南(2017年版)㊁中国成人急性淋巴细胞白血病诊断与治疗指南(2016年版)㊂1．4㊀研究方法1．4．1㊀标本及仪器㊀抽取诱导治疗或强化治疗后患者的骨髓液进行骨髓涂片行细胞形态学分析,同时取EDTA抗凝骨髓液约3ml进行MRD检测㊂标本统一按照要求送达上海复旦大学新培晶临床分子研究中心,仪器采用美国BD公司FACS Calibur流式细胞仪㊂1．4．2㊀主要试剂㊀单克隆抗体购自美国BD公司,利用三色荧光(PE㊁FITC㊁PerCP)抗体直接标记法标记㊂1．4．3㊀MRD检测㊀所有患者初诊时均进行骨髓免疫分型检测,从首次诱导缓解治疗结束后第14天开始,每3个月检测一次MRD,并动态监测,同时进行骨髓形态学检查,收集100000个细胞㊂1．4．4㊀检测MRD的同时测定外周血血小板(PLT)计数和骨髓巨核细胞(MK)的变化判断白血病预后㊂2㊀结㊀㊀果2．1㊀MRD水平与复发的关系(表1)表1㊀20例AL患者CR后MRD水平与复发之间的关系MRD<10-492722．2% MRD<10-392277．8% MRD<10-2220100．0%㊀㊀MRD<10-4组一例M2患者,染色体检查示t(8;21),AML1/ETO融合基因表达㊂自认为预后良好,化疗未满三年即放弃治疗,回单位上班,9个月后复发㊂另一例M4患者CR近五年,行MRD检测提示MRD> 10-2,骨髓涂片原始细胞5%,随访骨髓检查,两个月后骨髓涂片原始细胞>20%㊂2．2㊀PLT㊁MK水平与复发的关系(表2)表2㊀PLT、MK水平与复发的关系MRD水平血象WBC Hb Plt骨髓象骨髓增加度原始细胞幼巨颗粒巨产板巨MRD<10-4CR5．8121133活跃0．5122314 MRD<10-4复发9．991133极度活跃2410189 MRD<10-3CR6．1113119活跃0．8132112 MRD<10-3复发11．18579极度活跃45978 MRD<10-2CR7．0104106活跃2．5111411 MRD<10-2复发10．57665极度活跃57753㊀㊀根据表1经过20例患者的MRD检测显示:MRD <10-4的复发率低,MRD﹥10-3的复发率高,MRD﹥10-2提示近期复发㊂因此,对早期复发的判断㊁及早干预治疗和治疗方案的选择有着明显的指导意义,并初步取得了良好的效果㊂根据表2急性白血病CR期,血小板在正常值㊁巨核细胞数量明显增加,以颗粒㊁产板巨增加为主㊂复发时血小板㊁巨核细胞总数减少,以幼巨㊁颗粒巨为主,产板巨减少明显㊂3㊀讨㊀㊀论AL患者初发时体内约有1012个白血病细胞,经过化疗后杀伤4个对数级后即可达到临床完全缓解(complete remission,CR),实际体内还有约108个白血病细胞,如果白血病细胞对化疗药物敏感,体内白血病细胞可以降得更低,例如白血病细胞﹤105㊂然而,目前常规检测白血病细胞数量为骨髓涂片计数的方法,原始细胞﹤5%即认为CR,实际体内残留的白血病细胞数无法计算㊂易造成AL患者的治疗不足或过度治疗㊂治疗不足易造成复发,过度治疗易出现致命性并发症[2]㊂因此,AL治疗后体内有多少残留白血病细胞,巩固治疗如何实施成为目前AL治疗的瓶颈㊂新近提出的微小残留病(minimal residual disease, MRD)是指恶性血液病经过治疗达到血液学完全缓解㊃491㊃㊀Chinese Journal of Thrombosis and Hemostasis2021Vol27No2㊀后体内残存的通过形态学等传统方法无法检测到的任何水平的微量肿瘤状态[3-4]㊂MRD能准确定量残留白血病细胞数,敏感度达到10-4~10-5㊂而基于MRD指导下的个体化治疗可以使不同危险度分层组中的患者避免过度治疗或治疗不足,以提高患者的长期生存率[5]㊂临床根据MRD水平高低,可以判断AL 患者对治疗的反应和预后,同时能早期预测复发,为早期干预提供有力依据㊂研究表明:MRD可作为AL 缓解和治愈的标准[6]㊂本研究中,我们对AL病人进行FCM(flow cytom-etry)的白血病细胞标记,然后观察AL患者经过治疗获得CR后骨髓中MRD的变化情况,定期监测CR病人的MRD变化情况,根据其变化选用合适的治疗方案㊂MRD作为白血病独立的预后因素,使AL的缓解标准由细胞水平提升到分子水平[7]㊂本研究的目的就是探讨MRD在监测AL复发前期的改变和及时干预治疗的应用价值㊂参照国外研究现状:San Miguel等根据MRD检测水平将AML获得CR的患者分为4组,即:MRD< 10-4㊁10-4~10-3㊁10-3~10-2㊁>10-2,随访观察发现,各组3年复发率分别为:0㊁14%㊁45%㊁85%[8]㊂Coustan Smith等应用多参数FCM研究MRD与预后的关系,发现以MRD检测10-4为标准,其5年复发率<10-4以下组为6．1%㊁>10-4以上组高达23%[9]㊂意大利学者Renato Bassan．等根据MRD结果分为:MRD阴性(﹤10-4)㊁MRD阳性(﹥10-4)[10]㊂MRD阴性者结束巩固治疗后进入为期2年的维持治疗㊂MRD阳性患者最好接受异基因干细胞移植,不能接受干细胞移植者,可以进行强化治疗+自身外周血干细胞支持㊂国内研究现状:在过去的10年中,随着FCM水平的不断提高,特别是8~10色MP-FCM在MRD检测中体现出敏感性高㊁特异好㊁适用范围广的优势,MRD的FCM检测从小规模样本的临床研究发展到大规模样本的临床验证,目前已成为恶性血液病临床疗效判断和预后分层的重要依据㊂初治AL患者经标准化疗后,虽然5年生存率达到40%~50%,但部分患者在2~3年内相继复发,其根源是患者体内残留的白血病细胞㊂学术界一致推荐把MRD检测作为白血病个体化治疗和预后判断的重要依据㊂与传统的形态学比较其创新点是能精确地定量残存白血病细胞数,敏感度达到10-4~10-5,而且该方法具有快捷㊁简便㊁敏感㊁特异的特点,值得推广和应用㊂参考文献[1]㊀MAURILLO L,BUCCISANO F,SPAGNOLI A.Monitoring ofminimal residual disease in adult acute myeloid leukemia u-sing peripheral blood as an alternative source to bone mar-row.HAEMATOLOGICA,2007[2]㊀M.J.BOROWITZ,M.DEVIDAS,S.P.HUNGER,et al.Clinical significance of minimal residual disease in child-hood acute lymphoblastic leukemia and its relationship toother prognostic factors:a Children s Oncology Group stud-y.Blood,June15,2008;111(12):5477-5485. [3]㊀HOKLAND P,OMMEN HB,MULE MP,et al.Advancing theMinimal Residual Disease Concept in Acute Myeloid Leuke-mia[J].Semin Hematol,2015,52(3):184-192. [4]㊀OSSENKOPPELE GJ,SCHUURHUIS GJ.MRD in AML:Itis time to change the definition of remission[J].Best PractRes Clin Haemetol,2014,27(3-4):265-271.DOI:10.1016/j.beha.2014.10.008.[5]㊀WOOD BL.Principles of minimal residual disease detectionfor hematopoietic neoplasms by flow cytometry[J].Cytome-try B Clin Cytom,2016,90(1):47-53.DOI:10.1002/cyto.b.21239.[6]㊀AL-MAWALI,D.GILLIS,I.LEWIS The Role of Multipa-rameter Flow Cytometry for Detection of Minimal ResidualDisease in Acute Myeloid Leukemia Am J Clin Pathol,Janu-ary1,2009;131(1):16-26.[7]㊀D.CAMPANA Minimal Residual Disease in Acute Lympho-blastic Leukemia Hematology,December1,2010;2010(1): 7-12.[8]㊀SAN-MIGUEL JF,VIDRIALES MB,L6PEZ-BERGESC,etal.Early Immunophenotypical evaluation of minimal residualdisease in acute nueloicl.Leukemia identifies different pa-tient risk groups and may contribute to postinduction treat-ment stratification.Blood.2001,98(6):1746-1751. [9]㊀COUSTAN-SMITH E.BEHM FG,SANCHEZ J,et al.Immu-nological detection of minimal residual disease in childrenwith acute lymphoblastic ncet.1998.351(9102):550-4.[10]RENATO BASSAN.et al.Improved risk classification forrisk-specific therapy based on the molecular study of mini-mal residual disease(MRD)in adult acute lymphoblasticleukemia(ALL) 2009by The American Society of He-matology(收稿日期:2020-10-20)㊃591㊃㊀血栓与止血学2021年第27卷第2期。

白血病微小残留病的检测方法及其意义蒋惠【摘要】目的:研究微小残留病(MRD)的检测在白血病复发预测以及临床治疗指导方面的意义.方法:选取40例白血病患者标本,通过多参数流式细胞术(FCM)检测MRD,从诱导化疗治疗后的第21天开始,每个月检测一次.按照首次接受诱导治疗后的第21天检测的MRD水平,将40例AL分为低(MRD＜ 10-4)、中(MRD:0.01 ～ 10-4)、高(MRD＞0.01)三个组.结果:低、中、高三组三年的复发率分别为0、20.0％、85.71％.其中MRD ＞0.01组3年复发率最高,MRD＜ 10-4组预后好,两组复发率的差异有统计学意义(P＜0.05).在随后MRD动态监测的过程中,形态学完全缓解时的MRD阳性组与阴性组的复发概率具有明显差异(P＜0.05).结论:MRD ＞0.01提示复发具有高概率,MRD阳性比形态学复发出现早,连续的MRD监测对于个体化治疗以及预测复发具有重要的临床应用意义.【期刊名称】《中国民族民间医药》【年(卷),期】2012(021)002【总页数】2页(P18,20)【关键词】白血病;微小残留病;免疫表型分析【作者】蒋惠【作者单位】四川省凉山州第二人民医院检验科,四川凉山615000【正文语种】中文【中图分类】R733.7微小残留病 (MRD)指的是白血病患者经过骨髓移植治疗或者诱导化疗获得完全缓解，体内残有的少量白血病细胞的一种状态［1］。

为了能够提前的预测白血病的复发，以及指导临床用药或骨髓抑制效果，目前出现了流式细胞术 (FCM)检测微小残留病 (MRD)的试验。

本研究跟踪40例急性白血病病人的140例骨髓标本进行微小残留病的动态监测分析，证明微小残留病在急性白血病复发的预测中有重要的临床指导意义。

1 资料与方法1.1 一般资料选取2008年8月至2010年1月缓解后急性白血病患者40例，男22例，女18例，年龄27～73岁，平均年龄为50岁，共140份骨髓标本，进行MRD检测。