蛋白质印迹手册2015

蛋⽩质印迹法（免疫印迹试验，WesternBlot）蛋⽩质印迹法（免疫印迹试验）即 Western Blot。

它是分⼦⽣物学、⽣物化学和免疫遗传学中常⽤的⼀种实验⽅法。

其基本原理是通过特异性抗体对凝胶电泳处理过的细胞或⽣物组织样品进⾏着⾊。

通过分析着⾊的位置和着⾊深度获得特定蛋⽩质在所分析的细胞或组织中表达情况的信息。

蛋⽩免疫印迹（Western Blot）是将电泳分离后的细胞或组织中蛋⽩质从凝胶转移到固相⽀持物NC膜或PVDF膜上，然后⽤特异性抗体检测某特定抗原的⼀种蛋⽩质检测技术，现已⼴泛应⽤于基因在蛋⽩⽔平的表达研究、抗体活性检测和疾病早期诊断等多个⽅⾯。

⼀提起Western blot，⼤家会不禁联想到Southern blot和Northern blot。

其实它们的名字也是个有趣的故事。

1975年，Edwin Southern教授发明了DNA杂交检测技术，故命名为Southern blot。

之后，James Alwine、David Kemp和George Stark三位教授⼜发明了RNA杂交检测技术，因与Southern blot相似，故命名为Northern。

George Stark这位⽜⼈教授在两年后⼜开发出类似的蛋⽩质检测⽅法。

1981年，Neal Burnette将其命名为Western blot。

为什么当时没叫Eastern blot呢？这⽆从考证，不过科学家们还真是挺有创意的。

30年来， Western blot技术已成为蛋⽩质研究中最常⽤的⼯具。

它的标准流程如下：蛋⽩质⾸先通过SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，再通过电泳转移到固相⽀持物上，固相⽀持物包括硝酸纤维素膜、PVDF膜和尼龙膜。

⾸先将膜上未反应的位点封闭起来，以抑制抗体的⾮特异性吸附，这样固定的蛋⽩质即可与特异性的多克隆或单克隆抗体相互作⽤。

最后通过放射、⽣⾊或化学发光的⽅法进⾏定位。

Western Blot原理与Northern Blot、Southern blot类似。

实验四蛋白质印迹分析【实验目的】了解蛋白质印迹法的基本原理及其操作和应用。

【实验原理】蛋白质印迹法又称为免疫印迹法，这是一种可以检测固定在固相载体上蛋白质的免疫化学技术方法。

待测蛋白既可以是粗提物也可以经过一定的分离和纯化, 另外这项技术的应用需要利用待测蛋白的单克隆或多克隆抗体进行识别。

如图所示，可溶性抗原，也就是待测蛋白首先要根据其性质，如分子量，分子大小，电荷以及其等电点等采用不同的电泳方法进行分离；通过电流将凝胶中的蛋白质转移到聚偏二氟乙烯膜上；利用抗体(一抗) 与抗原发生特异性结合的原理，以抗体作为探针钓取目的蛋白。

值得注意的是在加入一抗前应首先加入非特异性蛋白，如牛血清白蛋白对膜进行“封阻” 而防止抗体与膜的非特异性结合。

经电泳分离后的蛋白往往需再利用电泳方法将蛋白质转移到固相载体上, 我们把这个过程称为电泳印迹。

常用的两种电转移方法分别为:1.半干法: 凝胶和固相载体被夹在用缓冲溶液浸湿的滤纸之间,通电时间为10 分钟~30 分钟。

2. 湿法：凝胶和固相载体夹心浸放在转移缓冲溶液中，转移时间可从45 分钟延长到过夜进行。

由于湿法的使用弹性更大并且没有明显浪费更多的时间和原料，因此我们在这里只描述湿法的基本操作过程。

对于目的蛋白的识别需要采用能够识别一抗的第二抗体。

该抗体往往是购买的成品，已经被结合或标记了特定的试剂，如辣根过氧化物酶。

这种标记是利用辣根过氧化物酶所催化的一个比色反应，该反应的产物有特定的颜色且固定在固相载体上，容易鉴别。

因此可通过对二抗的识别而识别一抗，进而判断出目标蛋白所在的位置。

其他的识别系统包括碱性磷酸酶系统和125I 标记系统。

【实验材料】1. 实验器材SDS/PAGE实验相关材料；电转移装置；供电设备；PVDF膜 ( Millipore Immobion-P #IPVH 000 10 ); Whatman 3MM纸；其他工具：镊子、海绵垫、剪子、手套、小塑料或玻璃容器、浅盘。

蛋白质免疫印迹实验（Western Blot）蛋白质免疫印迹（Western Blot）实验原理蛋白质免疫印迹（Western Blot）是将蛋白质转移到膜上，然后利用抗体进行检测的一种蛋白质检测方法。

对已知的表达蛋白，可以用相应的抗体作为一抗进行检测，对新基因的表达产物，可以融合部分的已知片段进行检测，如HA-tag，Flag-tag，c-myc-tag等。

Western Blot采用的是聚丙烯酰胺（PAGE）凝胶电泳，被检测的是蛋白质，其中检测探针是相应的抗体，显色是使用的标记后的二抗。

经过PAGE凝胶分离的蛋白质样品，转移到固相载体上，如醋酸纤维素膜，固相载体以非共价键的形式吸附蛋白质。

然后以固相载体上的蛋白质作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，然后再与标记后的二抗起反应，经过底物显色以检测目的蛋白。

蛋白质免疫印迹（Western Blot）原理蛋白免疫印迹法主要分为三个阶段进行第一阶段是SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)在这个阶段，经过变性处理的蛋白质样品经SDS处理后会带上阴性电荷,在聚丙烯酰胺凝胶中在电场的作用下从阴极向阳极泳动,且分子量越小,泳动速度就越快。

所以在此阶段，根据蛋白的泳动速度可以将样品中的蛋白质根据其分子量的大小进行分离，此阶段分离效果肉眼不可见。

如果想观察蛋白的电泳情况，可以在电泳完成后进行考马斯亮蓝染色进行观察；第二阶段为电转移，又称为转膜。

即将在凝胶中已经分离的蛋白质条带通过电场的作用转移至硝酸纤维素膜上, 一般选用恒流300 mA，通电90 min即可将凝胶中的蛋白条带转移到醋酸纤维素膜载体上。

转移到载体上的蛋白条带也是肉眼不可见的，如果想观察转移的效果，可以在转移后对载体进行丽春红染液染色。

第三阶段为酶联免疫显色检测将印有蛋白质条带的硝酸纤维素膜(相当于包被了抗原的固相载体)依次与特异性抗体和酶标第二抗体作用后,加入能形成不溶性显色物的酶反应底物,使目的条带蛋白显色。

蛋白印迹实验报告篇一：实验十二Western印迹鉴定目标蛋白实验十二Western印迹鉴定目标蛋白实验目的1.了解Western blot的原理及其意义，掌握Western blot的操作方法；2.应用Western blot 技术分析鉴定经SDS-PAGE分离后转移到尼龙膜上的重组蛋白。

实验原理Western印迹法简称蛋白质印迹法。

蛋白质样品经SDS-PAGE电泳后，凝胶所含的样品蛋白质区带通过电泳方法转移、固定到载体（如尼龙膜、硝酸纤维素膜）上，固相载体以非共价键的形式与蛋白质结合，从而固定住蛋白质；以膜上的蛋白或多肽为抗原，与相应的第一抗体起免疫反应，再和酶标记或同位素标记的第二抗体反应，用适当的溶液漂洗去未结合抗体后，置含底物的溶液中温育，或通过放射自显影显出谱带，即可检测出样品中的特异蛋白组分。

试剂与器材试剂1.转移缓冲液：甘氨酸（39 mmol/L），Tris 碱（48mmol/L），SDS （%），200ml 甲醇（20%），定容至1,000mL；2.封闭液：5% 脱脂奶粉，% 叠氮钠，溶于PBST溶液中；3.丽春红S（Ponceaus）染液：丽春红S溶于1mL 冰乙酸中，加水至100mL；洗膜液：PBS 缓冲液含% Tween 20；5．DAB浓缩显色液（50X）：DAB （二氨基联苯胺）是根过氧化物酶的底物之一，临用前稀释。

6．5 x PBS：在1600mL蒸馏水中溶解Na 2HPO4 , Na H2PO4, 40g Na Cl,用/L NaOH调pH至，加水定容至2升。

高压灭菌20 分钟，室温保存。

用前稀释至1x 。

7．SDS-PAGE电泳用溶液和试剂。

器材电泳装置一套;2.电转移膜装置3.抗体-酶反应摇床操作方法〈一〉电转移1．将蛋白质样品进行SDS-PAGE，待溴酚蓝跑出胶后停止电泳（1）。

2．载手套切6-8张定性滤纸和一张尼龙膜，它们的大小应与凝胶的大小相同。

在尼龙膜的一（左）角作一记号（或剪角），与滤纸和海棉（纤维）垫浸泡于转移缓冲液中。

蛋白质印迹(Western blotting)一、实验目的：免疫印迹主要用于蛋白质的结构和活性检测等方面，学生掌握与免疫印迹相关的原理和方法，如电泳技术，转膜技术等。

二、实验原理：蛋白质印迹(Western blotting)是将蛋白质转移并固定在化学合成膜的支撑物上，然后以特定的亲和反应、免疫反应或结合反应及显色系统分析此印迹。

蛋白质印迹(免疫印迹)的实验包括5个步骤：1)固定(immobilization)：蛋白质进行聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)，强度比较差，需要从胶上转移到硝酸纤维素膜上。

2)封闭(blocked)：保持膜上没有特殊抗体结合的场所，使场所处于饱和状态，用以保护特异性抗体结合到膜上,并与蛋白质反应。

3)初级抗体(第一抗体)是特异性的。

4)第二抗体或配体试剂对于初级抗体是特异性结合并作为指示物。

5)适当保温后的酶标记蛋白质区带，产生可见的、不溶解状态的颜色反应。

三、试剂与器材：试剂:(1)人IgG免疫兔的抗血清；(2)辣根过氧化酶一羊抗兔IgG；(3)PBS缓冲液：NaCl 8 g，KCl 0.2 g，KH2P04 O．24 g，Na2HP04·12H20 2.9 g，加蒸馏水至1000 ml，pH值为7.4；(4)PBS-T缓冲液：PBS缓冲液加O.05 9／6 Tween-20；(5)封闭液：0.5％(质量分数)BSA(用PBS缓冲液配制)；(6)底物溶液：A液：溶解30 mg CN在5 ml甲醇中；B液：溶解10 mg DAB在5 ml甲醇中；C液：分别搅拌A液和B液10～15 rain，直到完全溶解，然后将A液和B液混合，加PBS至50 ml，分成10 ml 一份，不用的可冷冻(一20~C)(下次直接化冻运用)；D液：取10 ml C液，运用时加10 ml 30％(体积分数)H202；(7)转移缓冲液：0.025 mol／L Tris，O．192 mol／L甘氨酸(glycine)，20％(体积分数)甲醇(methan01)，pH值为8.3。

蛋白质印迹法一.原理：Western Blot法采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。

经过PAGE(聚丙烯酰胺凝胶电泳)分离的蛋白质样品，转移到固相载体【例如硝酸纤维素薄膜（nc膜）】上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。

以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。

二. 步骤：1.制胶（1）将清洁干净的玻璃板对齐后放入架中卡紧。

然后垂直卡在架子上准备灌胶。

（（2）分离胶制法：先将所需量的蒸馏水、30% AcrBis(29:1)、1 MTris,PH8.8、10%SDS、依次加入离心管中，进行摇匀，再将所需量的10%过硫酸铵、TEMED加入，再次进行摇匀(注：要充分摇匀)。

然后用1ml的微量加样器进行灌胶，灌胶时开始可快一些，胶面快到所需高度时要放慢速度，待胶面升到接触绿带高度时即可，然后将板内气泡赶至顶部，再在胶上加一层水进行液封并置于恒温箱内，约20分钟即凝固。

待分离胶凝固后倒去胶上层水并用吸水纸将水吸干再配制浓缩胶。

（注：操作时胶一定要沿玻璃板流下，这样胶中才不会有气泡。

加水液封时要很慢，否则胶会被冲变形。

1.0mm板每板大约需5ml分离胶，1.5mm板每板大约需8ml分离胶）。

（3）浓缩胶制法：先将所需量的蒸馏水、30% AcrBis(29:1)、1 MTris,PH6.8、10%SDS、依次加入离心管中，然后进行摇匀，再将所需量的10%过硫酸铵、TEMED加入，再次进行摇匀。

然后用1ml的微量加样器进行灌胶，待胶面升到玻璃板上端时即可，再将梳子插入浓缩胶中，梳子插入浓缩胶时，应确保没有气泡，待浓缩胶凝固约30分钟中后冷却至室温即可用于电泳。

（1.0mm板每板大约需1.5ml浓缩胶，1.5mm板每板大约需2ml浓缩胶）。

蛋白质印迹(Western Blot)【实验目的】通过本实验了解蛋白质印迹(Western Blot)的方法和操作要点。

【实验原理】印迹法(Western Blot)一般由凝胶电泳；样品的印迹和固定化；各种灵敏的检测手段如抗体、抗原反应等三大实验部分组成。

1.生物大分子凝胶电泳分离蛋白质印迹法的第一步一般是将蛋白质进行SDS聚丙烯酰胺平板凝胶电泳，使待测蛋白质在电泳中按相对分子质量大小在板状胶上排列。

2.分子区带的转移和固定第二步就是把凝胶电泳已分离的分子区带转移并固定到一种特殊的载体上，使之形成稳定的、经得起各种处理并容易检出的，即容易和各自的特异性配体结合的固定化生物大分子。

现用得最多的载体材料为硝酸纤维素膜(NC膜)和一种尼龙衬底的膜(ZB膜)，它们和生物大分子都是非共价结合。

3.特异性谱带的检出印迹在载体上的特异抗原的检出依赖于抗体、抗原的亲合反应。

即将酶、荧光素或同位素标记的特异蛋白分别偶联在此特异抗体的二抗上，再分别用底物直接显色，测荧光，放射自显影等方法检测出我们感兴趣的抗原来，考虑到如果无合适抗体用来检测抗原时，可用一般的蛋白染料，如丽春红，检测转移到膜上的蛋白，验证转移是否成功。

I. SDS−PAGE(此部分见实验十二)II. 电转移【仪器、材料与试剂】(一)仪器1．高电流电泳仪(500mA上)2．电泳转移槽及转移夹3．海棉块4．滤纸5．水平摇床(二)材料1．硝酸纤维素膜(NC膜)2．甘氨酸(Gly)3．甲醇4．磷酸二氢钾(KH2P04)5．磷酸氢二钾(K2HP04) 分子生物学实验指导 436．三羟甲基氨基甲烷(Tris)7．牛血清白蛋白(BSA)8．吐温20(Tween-20)9．4-氯萘酚10．过氧化氢(H2O2)11．双蒸水(ddH20)12．氯化钠(NaCl)13．小塑料盒若干14．乳胶手套15．镊子16．普通玻璃器皿(三)试剂1．印迹缓冲液： 25 mmol/L Tris ，192 mmol/L甘氨酸，20% 甲醇，pH 8.3 (现用现配) ，6.05g Tris + 28.83g Gly + 400mL甲醇，用ddH20溶解并定容至2 L。

蛋白免疫印迹(Western Blot)技术指南一、蛋白免疫印迹(Western Blot)技术概览蛋白免疫印迹(Western Blot，以下简称WB)是利用特定抗体能够专一结合其抗原“蛋白质”的原理来对样品进行着色，通过分析着色的位置和着色深度获得特定蛋白质在所分析的细胞或组织中的表达或修饰水平的免疫检测技术。

一般我们使用WB都是为了半定量检测某种目的蛋白的相对表达量，通常要以表达相对稳定的蛋白作为内部对照（内参），然后采用“灰度分析软件”检测目的蛋白及内参条带的表达强度，每组目的蛋白分别以内参作为对照进行比对和相对定量，以使实验结果更加准确。

同时，同一批样品至少进行技术重复三次，然后方可进行统计学分析。

WB灵敏度可达ng级，用ECL显色法理论上可达pg级。

二、蛋白免疫印迹(WB)实验所需仪器、材料及试剂（一）主要实验仪器制冰机、超声破碎仪、低温冷冻离心机、蛋白电泳/转膜仪、多功能酶标仪、LI-COR Odyssey成像系统（二）主要实验试剂与材料15ml离心管、玻璃组织研磨器、EP管、冰浴、蛋白抽提试剂(改进型RIPA配方，Bioss 产品货号C05-01001)、蛋白酶抑制剂混合物(protease inhibitor cocktail)、BCA蛋白定量试剂盒(Bioss产品货号C05-02001)、30%丙烯酰胺-N,N-亚甲基双丙烯酰胺混合液(29:1)(Bioss产品货号C05-03004)、10%过硫酸铵(APS)(Bioss产品货号C05-03009)、四甲基乙二胺(TEMED)(Bioss产品货号C05-03008)、4×蛋白上样缓冲液(Bioss产品货号C05-03015)、蛋白Marker(Bioss产品货号C05-090006)、电泳缓冲液(Bioss产品货号C05-03010)、转膜缓冲液(Bioss产品货号C05-05003)、考马斯亮蓝染色液(Bioss产品货号C05-04001)、TBST缓冲液(pH7.4)(Bioss产品货号C5049)、PVDF膜(Bioss产品货号C55008)或NC膜(0.22µm)(Bioss产品货号C05-05002)、丽春红染色液(Bioss产品货号C05-04002)、脱脂奶粉(Bioss产品货号C5059)、牛血清白蛋白(BSA)、目的蛋白一抗、WB一抗稀释液(Bioss产品货号C05-07001)、HRP标记二抗(bs-0295G-HRP或bs-0296G-HRP)或荧光标记二抗(Bioss内部操作流程选用荧光二抗，Bioss产品货号bs-40295G-IRDye8或bs-40296G-IRDye8)、WB二抗稀释液(Bioss产品货号C05-07002)、ECL发光液(Bioss产品货号C05-07004)、膜再生液(Bioss产品货号C05-03041)Western Blot操作流程图三、蛋白免疫印迹(WB)实验标准操作流程和技术要点（一）蛋白提取●组织样品蛋白提取方法1.用灭菌（预冷）的工具分离新鲜目的组织50mg-100mg，并用生理盐水或PBS洗涤干净，用洁净的剪刀将组织剪碎至合适大小。

蛋白质印迹/Western blotting实验操作步骤一、总蛋白的提取单层贴壁细胞总蛋白的提取：1)吸除培养液2)每皿细胞加4℃预冷的 PBS。

平放轻轻摇动 1min 洗涤细胞，然后弃去洗液。

重复上操作两次，共洗细胞三次以洗去培养液。

将PBS弃净后把培养瓶置于冰上。

（PBS会降低细胞裂解液的效价和总蛋白的浓度）3)加裂解液于冰上裂解 30 min，为使细胞充分裂解，培养瓶要经常来回摇动（可放置在4℃摇床裂解）。

4)裂解完后，用干净的刮棒将细胞刮于培养瓶的一侧（动作要快），然后用枪将细胞碎片和裂解液移至 1.5mL 离心管中。

（整个操作尽量在冰上进行）5)在EP管中将细胞震碎（10s/次，3次）6)于4℃下 12000rpm 离心 20-30 min。

（离心机提前预冷至4℃）7)将离心后的上清分装转移倒 1.5mL 的离心管中放于－20℃保存。

二、BCA法测蛋白浓度1)将BCA protein assay每孔 A液200μL,B液4μL混合，96孔板每孔加入22.5μLdd水，2.5μL蛋白提取液，200μLA+B混合液2)在烘箱中37℃，90r，孵育30min3)使用酶标仪测出吸光度后，使用公式y=0.9154x-0.118计算出蛋白浓度（浓度需要×10）4)将蛋白配成等浓度等体积（使用配置好的裂解液配），按照4：1加入5X loading buffer然后煮5min（100℃），放入-20℃保存三、SDS-PAGE电泳板子1.5mm，梳子1.5mm1）清洗玻璃板：一只手扣紧玻璃板，另一只手蘸点洗衣粉轻轻擦洗。

两面都擦洗过后用自来水冲洗2）验漏：玻璃板对齐后放入夹中卡紧，然后垂直卡在架子上，加满水验漏3）灌胶：验漏结束后用纸吸干水分，按方法配制下层胶（4mL+4mL+80μLAP),灌胶时，可用 1mL 枪吸取胶沿玻璃放出，待胶面升到绿带中间线高度时即可。

然后胶上加1 mL水，液封后的胶凝的更快。

蛋白免疫印迹(Western blotting)一般由凝胶电泳、样品的印迹和免疫学检测三个部分组成。

第一步是通过SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳，使待测样品中的蛋白质混合物按分子量大小在凝胶中分成条带。

第二步把凝胶中已分成条带的蛋白质转移到一种固相支持物上，使用较多的是硝酸纤维素膜(NC膜)和PVDF膜，蛋白转移的方法多用电泳转移。

第三步是用特异性的抗体检测出已经印迹在膜上的目标抗原。

免疫检测的方法可以是直接的和间接的。

现在多用间接免疫酶标的方法，在用特异性的第一抗体杂交结合后，再用酶标的第二抗体(碱性磷酸酶(AP)或辣根过氧化物酶(HRP)标记的二抗杂交结合，再加酶的底物显色或者通过膜上的颜色或X光底片上暴光的条带来显示抗原的存在。

该技术被广泛应用于蛋白表达水平的检测中。

蛋白样本提取制备
蛋白提取的质量直接决定着WB结果的好坏，根据标本类型和检测类型选择合适的蛋白制备方法是至关重要的。

可使用适当的裂解液裂解细胞或组织样本。

需要注意以下几个方面：
1.尽可能提取完全或降低样本复杂度只集中于提取目的蛋白(通过采用不同提取方法或选择不同的试剂盒产品);
2.保持蛋白处于溶解状态(通过裂解液的PH、盐浓度、表面活性剂、还原剂等的选择);
3.提取过程中防止蛋白降解、聚集、沉淀、修饰等(低温操作，加入合适的蛋白酶和磷酸酶抑制剂);
4.尽量去除核酸、多糖、脂类等干扰分子(通过加入核酸酶或采取不同提取策略);
5.样品分装，长期于-80℃中保存，避免反复冻融。

对于某些特定的亚细胞组份蛋白，例如核蛋白、线粒体蛋白、膜蛋白、细胞浆蛋白等，可以参考相关文献提取，也可以使用商业化的试剂盒抽提。

蛋白印迹摘自：忆立赋。

蛋白印迹，也称Western，Western blot、Western blotting、Western印迹，是检测蛋白的重要方法之一。

经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。

以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。

该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。

（一）蛋白样品的制备可以选用适当的裂解液，裂解贴壁细胞、悬浮细胞或组织样品。

对于某些特定的亚细胞组份蛋白，例如细胞核蛋白、细胞浆蛋白、线粒体蛋白等，可以参考相关文献提取这些亚细胞组份蛋白，也可以使用试剂盒进行抽提。

为确保每个蛋白样品的上样量一致，收集的蛋白样品均应测定其蛋白浓度。

在微量离心管中，用2×SDS加样缓冲液按1:1(v/v)稀释待测蛋白质样品，于100℃煮沸5-10min。

以充分变性蛋白。

使用浓缩的蛋白上样缓冲液可以减小上样体积，在相同体积的上样孔内可以加入更多的蛋白样品。

（二）SDS-PAGE电泳1. SDS-PAGE凝胶配制（1）取出玻璃板，用自来水洗净后，蒸馏水冲洗一次，置37 度烘干或晾干（戴手套操作），梳子应用水洗净，临用前用乙醇擦拭，挥发至干。

组装电泳装置中的玻璃平板夹层，并固定在灌胶支架上，确保不漏胶。

（2）按表1配制分离胶液体并脱气，其中AP和TEMED灌胶前再加入，轻轻摇匀，以免产生气泡。

表1 凝胶的制备按所需分离的蛋白质分子大小配制合适浓度的凝胶（表2），将凝胶溶液平稳地注入两层玻板中（以平稳流速从垫片的边缘注入），缓慢持续注入至液面距梳齿2-3厘米处，再在液面上小心注入一层水饱和异丁醇（厚约1cm），以隔绝空气，静置直至凝胶的形成（聚合后，可见在异丁醇与凝胶的界面间有一清晰的折光线）。

蛋白印迹法（Western-blot）一、基本原理细胞色素P450是一组含亚铁血红素，结构与功能相关的超家族基因编码的同工酶，因还原型P450与一氧化碳有特殊的亲和力，且形成的复合物在波长450nm处有一特异吸收峰而得名。

已知的细胞色素P450超家族中，主要有CYP1、CYP2、CYP3三个基因家族，是生物体参与内外源性化合物生物转化酶系的主要成员，并与肿瘤的发生密切有关。

其中CYP1家族中的CYP1A1与多种前致癌物、致突变物的代谢活化及肿瘤的发展密切相关，所以对CYP1A1的研究有重要的意义。

本实验采用蛋白免疫印迹（western blotting , WB）技术分析小鼠肝，肾两个器官中的CYP1A1的含量。

WB的原理如下。

Western blotting 常用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺电泳（SDS —PAGE）法分离蛋白质。

SDS是一种阴离子去污剂，它能与绝大多数蛋白质结合。

无论与SDS结合前蛋白质的等电点是多少，结合后蛋白质将带上等量的负电荷，通常SDS与蛋白质结合的比例为：1g 。

同时结合后蛋白质的分子构象发生改变，行成长椭圆棒状，其短轴大约为18nm,其长轴与分子量有关（一定范围内成正比），此时蛋白质的电泳迁移率仅与蛋白质的分子量有关。

另外，SDS—PAGE过程中还加入了二硫苏糖醇和?-巯基乙醇等强还原剂，破坏二硫键使得蛋白质的原有空间结构充分破坏，因此SDS—PAGE能将不同分子量的蛋白质分离开。

分离后的蛋白质带有负电荷，因而用电转移的方法能有效地将蛋白质转移至固相载体上（如硝酸纤维素膜）。

用于承载蛋白质的各种膜均具有一个特点，它们都能与蛋白质发生非特异的共价结合，因而结合较为牢固，不易被后续的洗膜等操作洗脱.Western blotting所用的探针为针对靶蛋白某段氨基酸序列的抗体。

能直接与靶蛋白发生抗原抗体结合的抗体称为第一抗体（简称一抗），通常由于较难大量获得该抗体，使得对其进行标记很困难。

蛋白免疫印迹2.6.1 提取细胞胞浆蛋白及核蛋白(1) 首先用枪头吸去培养皿中的培养液，将皿倒扣在滤纸上，尽可能吸干培养基，用4 o C PBS洗涤三遍，洗净培养基。

(2) 将含有RIPA、磷酸酶抑制剂和PMSF的裂解液均匀加入培养皿中，用细胞刮快速刮取细胞，将细胞刮至一侧，用裂解液混匀，吸出移入EP管中。

(3) 将含有细胞和裂解液的EP管置于冰上15分钟摇匀，每5分钟震荡一次。

(4) 预冷超速离心机，4 o C 14000rpm 20分钟，吸取上清液即为胞浆蛋白，并分装于EP管中做好标记，置于冰上，将样品分别取2μl用BCA法测蛋白浓度。

(5) 将剩下的沉淀加入含有RIPA、磷酸酶抑制剂和PMSF的裂解液继续裂解，将含有沉淀物和裂解液的EP管置于冰上15分钟摇匀，每5分钟震荡一次。

(6) 预冷超速离心机，4 o C 14000rpm 20分钟，吸取上清液即为胞核蛋白，并分装于EP管中做好标记，置于冰上，将样品分别取2μl用BCA法测蛋白浓度。

2.6.2 蛋白浓度测定(1) 按BCA试剂盒( p0010s 碧云天) 说明书配平标准蛋白，最终浓度为0.5 mg/ml。

(2) 将标准蛋白按0，1，2，4，8，12，16，20 μl分别加到96孔板中，加去离子水补足到20 μl。

加2 μl样品到96孔板的样品孔中，加蒸馏水补足到20 μl，各孔加入200 μl BCA反应液，其中标准蛋白相对应的浓度分别0，0.025，0.05，0.1，0.2，0.3，0.4，0.5 (单位mg/mL)。

(3) 37 o C温箱孵育30 min。

(4) 在多功能微孔板检测仪(酶标仪00075393)上测定吸光度值，按照吸光度值和已知的标准品浓度做图，并得出标准曲线和方程，再根据目的蛋白所测得的吸光度值带入方程计算得出相应样品的蛋白浓度，乘以稀释倍数(10倍)即为样品实际浓度。

(5) 将样品配成等体积等浓度，加入总体积五分之一的蛋白上样缓冲液(碧云天，P0015)，煮沸10 min，放入-20o C保存。