禽类原始生殖细胞的研究进展

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201711289911.0(22)申请日 2017.12.07(71)申请人 广西大学地址 530004 广西壮族自治区南宁市西乡塘区大学路100号(72)发明人 陆阳清　谢龙　陆振萍　陈东阳　(74)专利代理机构 广西南宁公平知识产权代理有限公司 45104代理人 杨立华(51)Int.Cl.C12N 5/0735(2010.01)(54)发明名称鸡性腺原始生殖细胞快速分离与建系的方法(57)摘要本发明公开了一种鸡性腺原始生殖细胞快速分离与建系的方法，从7日龄鸡胚的性腺中分离、纯化原始生殖细胞，并将分离到的原始生殖细胞利用culture insert配合饲养层的方法，利用优化的培养系统，在15天内扩增获得100万以上细胞，实现快速扩增建系。

本发明具有成功率高、时间短、稳定高效的特征，并可在15d内扩增获得106以上细胞，为家禽种质资源保存和转基因鸡制备研究奠定了基础。

权利要求书1页 说明书4页 附图3页CN 108384749 A 2018.08.10C N 108384749A1.一种鸡性腺原始生殖细胞快速分离与建系的方法，其特征在于：从7日龄鸡胚的性腺中分离、纯化原始生殖细胞，利用culture insert配合饲养层的方法，将原始生殖细胞置于优化的培养液进行培养，实现快速扩增建系；所述优化的培养液组成为KO -DMEM，0.2％鸡血清，1％胎牛血清，1.2mM丙酮酸钠，100ug/ml肝素钠，1X antibiotic -antimycotic，1X GlutaMax，1XGS nucleoside supplement，0.1mM b -巯基乙醇，4ng/ml hFGFb，1X NEAA，1X B -27Vitamin A，25ng/ml Human Activin A。

2.根据权利要求1所述的鸡性腺原始生殖细胞快速分离与建系的方法，其特征在于：所述培养液在原代培养时2-3d进行半量换液。

家禽遗传与育种的研究进展随着经济的发展和人民生活水平的提高，鸡、鸭、鹅等家禽的需求量日益增加。

然而，家禽的遗传学和育种学研究一直是比较薄弱的环节。

随着科学技术的日益发展，家禽遗传与育种研究方面取得了很大的进展，本文将对家禽遗传与育种的研究进展进行介绍。

一、家禽遗传学的研究进展1. 基因组分析近年来，随着高通量测序技术的发展和普及，家禽基因组学的研究日益活跃。

在鸡、鸭等家禽的基因组研究中，随着基因组测序、注释工作的进行，我们能够全面了解家禽基因组的结构、组成及相关功能。

据悉，近几年来，世界各地的科学家陆续完成了红原鸡、慈禧鸭等家禽基因组的测序和注释工作。

这项工作为家禽的育种和疾病防治提供了强有力的支持和保障。

2. 基因型定位基因型定位是一种比较常见的家禽遗传学研究方法。

该方法能够定位到控制复杂性状的基因座，从而为育种和抗病研究提供有益的指导和帮助。

例如，针对肉鸡生长性状，科研人员成功地利用基因型定位技术，找到了一个控制鸡体重、腿长和心脏质量等性状的基因QTL。

该研究为肉鸡育种和相关疾病的研究提供了有价值的参考和基础。

3. 突变基因的筛选和鉴定突变基因是指在家禽及其后代中发生的基因变异。

该变异能够对家禽的生理和行为特征产生重大影响。

针对这一领域的研究，一些科研人员成功地筛选到了一些功能性基因突变，并通过基因敲除技术，证明了这些基因在家禽生理和遗传过程中起重要作用。

二、家禽育种学的研究进展1. 选择育种选择育种是目前最常用的家禽育种方法之一。

该方法主要是根据某些表型性状进行选择，从而提高家禽的品质和产量。

利用选择育种方法，科研人员成功地利用对EGF家禽进行了6个世代的连续选择，显著提高了EGF的产蛋能力。

这项研究为家禽的育种提供了新思路和方法。

2. 基因编辑基因编辑是一种新兴的育种方法。

该方法主要是在生物体内或外部干预基因序列，从而达到改善或调整家禽性状的目的。

例如，在鸡的研究中，科研人员成功地利用基因编辑技术，制造出了脂肪鸡。

禽原始生殖细胞的分离·培养及应用，由于鸡卵中含有大而多的卵黄，其受精后的整个孵化过程需在含有大量卵清的蛋壳内进行，这些特殊的生理特性使PGCs 成为研究禽类胚胎发生、细胞分化机制、发育相关调控基因等研究的良好模型。

基于此，笔者对PGCs的特性、分离培养及应用等研究研展进行了综述。

1禽类PGCs的特性原始生殖细胞（PGCs）是具有高度未分化的发育全能性细胞。

将刚分离到的PGCs在倒置相差显微镜下观察发现它比体细胞体积大，细胞核较大，位置偏中央，细胞周围有明显光环，有的具有伪足。

此外，PGCs细胞具有集落的显著特征，Wentwrth等发现PGCs细胞在饲养层上呈集落状生长，排列紧密，细胞间界限不清楚，生长特征表现为PGCs集落间常发生聚集现象。

PGCs内含有大量的糖原颗粒，并且具有较高的碱性磷酸酶活性，但是已分化的PGCs糖原含量及AKP活性明显降低。

秦洁等研究发现PGCs凭借其细胞质中大量糖原颗粒的沉积，可通过PAS染色将其余糖原颗粒相对较少的体细胞区分，其染色特征为细胞核不着色，细胞质呈红色。

经过PAS染色后的PGCs细胞形态变化不一，有的由圆变长，有的变为椭圆形，还有个别PGCs细胞仍保持圆形，有的还在顶端伸出伪足，核外胞质呈现许多深染的区域。

对于禽类PGCs，秦洁等报道其为圆形，HE（Hematoxylineosin）染色后精原细胞为圆形，体积较大，核着色较深；支持细胞形状不规则，有圆形、锥形，体积较精原细胞小，着色较浅；间质细胞一般成群分布在曲精细管索之间。

2PGCs的分离培养PGCs在禽胚胎的早期发育过程中有其独特的迁移规律，从而能被分离提取，并可移植到同种胚胎中，发育成有功能的配子。

在血液循环系统建立后，禽类PGCs首先通过血液循环到达原始生殖嵴部位，并在其中分化成配子。

根据禽类PGCs的独特迁移路线，通常在以下3个阶段进行PGCs的分离：①从5期胚的生殖新月区提取；②从10～13期胚的血液中提取；③从生殖腺中提取。

南方农业学报　Journal of Southern Agriculture　2023，54（11）：3340-3348ISSN 2095-1191； CODEN NNXAABDOI：10.3969/j.issn.2095-1191.2023.11.020利用iCaspase9特异性诱导鸡原始生殖细胞消除的研究孙玲玲，黄振文，田奎，张嘉乐，郑基坛，濮黎萍，陆阳清*（广西大学动物科学技术学院/广西畜禽繁育与疾病防控重点实验室，广西南宁530004）摘要：【目的】制备在生殖细胞特异表达iCaspase9的鸡原始生殖细胞系（PGCs），提升外源性PGCs的生殖传递效率，为生产诱导不育的雄性或雌性受体鸡胚打下基础。

【方法】利用piggyBac转座子将iCaspase9片段整合到鸡基因组中，构建稳定转染iCaspase9片段的CAG-iCaspase9-mCherry DF-1细胞系，通过荧光微显镜观察鉴定其在iCaspase9系统诱导底物B/B二聚化配体作用下的细胞消除效果；再利用CRISPR/Cas9技术将iCaspase9片段定点插入DAZL基因第11外显子之后构建Dazl-iCaspase9-EGFP PGCs，经iCaspase9片段插入鉴定和PGCs生殖特性鉴定后，通过荧光微显镜观察鉴定其在B/B二聚化配体诱导下的消除效果。

【结果】成功建立的CAG-iCaspase9-mCherry DF-1细胞系与野生型DF-1细胞（WT DF-1）的生长增殖无显著差异（P>0.05，下同）；CCK-8法测定发现，0.25~5.00 nmol/L B/B二聚化配体对WT DF-1细胞生长数量无显著影响，但CAG-iCaspase9-mCherry DF-1细胞在添加B/B二聚化配体后，细胞数量较空白对照组极显著降低（P<0.01，下同），且失去正常的细胞形态，逐渐变圆甚至凋亡。

成功建立的DAZL-iCaspase9-EGFP PGCs仍特异性高表达Cvh、Nanog、PouV、DAZL、Cdh和Ddx4等生殖细胞相关基因，在蛋白水平上也能鉴定出DAZL、SSEA1和CVH等蛋白，说明插入iCaspse9片段后并没有改变生PGCs的殖细胞特异性；在0.25 nmol/L B/B二聚化配体诱导作用下，DAZL-iCaspae9-EGFP PGCs数量显著减少，几乎全部消除，说明iCaspase9系统可诱导细胞凋亡而有效消除内源性PGCs。

家禽和家畜生殖的生物学研究随着农业的不断发展，家禽和家畜这些传统农业养殖品种的数量和品种也不断增多，而其中的生殖问题是农业生产中不可忽视的重要环节之一。

由于各种家禽和家畜在生殖方面的特点有很大的差异，因此对它们做出具体分析，就成为研究家禽和家畜生殖的首要任务。

一、家禽生殖的生物学研究在家禽生殖的研究中，最常见的就是鸡和鸭两种家禽的繁殖问题。

在这里先讨论一下鸡的生殖问题。

1、鸡的生殖生理鸡的生殖生理主要包括卵巢的发育和机体内激素水平的变化。

鸡的卵巢分为两个，其中右侧的大卵巢发育得更好。

鸡的卵泡也有大小之分，其中最大的称为“主卵泡”，它包裹着蛋黄，另一边则有卵壳膜囊，卵壳就形成在这里。

当鸡的生殖器官发育成熟后，卵巢中的母细胞就会不断地分化和成熟，这就是鸡每天能下更换卵的原因。

2、鸭的繁殖生理鸭作为另一种常见的家禽，也有其繁殖生理的研究。

鸭子进入性成熟期大约为4-5个月龄时，当其体重增长到1.5kg左右时，就能开始产蛋。

鸭子的卵巢比鸡的更大，其卵泡不像鸡一样分为大小之分，都是成熟的卵泡，因此鸭子能每隔一天下一个蛋。

其次，鸭子繁殖的季节规律性更加明显，春夏季是鸭子最适宜的季节，冬季因温度较低，鸭子的繁殖受到了一定的影响。

二、家畜生殖的生物学研究除了家禽，家畜也是人类日常饮食中不可缺少的一部分。

事实上，对于家畜的生殖方面研究一直是畜牧业的核心领域之一，让我们一起了解一下家畜生殖的生物学研究。

1、猪的繁殖生理猪作为一种产蛋量较高的畜牧品种，其繁殖生理也是研究的重点之一。

猪的繁殖生理可以分为雄猪和母猪两个方面来讨论。

雄猪的性成熟期在4-6个月龄时，当体重增长到20-25kg左右时就可开始配种了。

猪的睾丸比较小，位于阴囊内，而阴茎则长2-3厘米左右，先端呈缩头状。

猪精液的例产时间与马及牛实际上差不多，在5-10分钟左右。

精液中只有50%为正常精子，其他精子则因种种原因畸形或无法运动受精。

母猪的繁殖生理则以其发情与怀孕周期为主要研究方向。

家禽繁殖与育种技术的研究进展随着人类社会的不断发展，家禽作为食品来源之一，其繁殖与育种技术也得到了越来越多的关注与研究。

本文将围绕着这一主题，梳理国内外家禽繁殖与育种技术领域的研究进展，并对未来的发展方向进行探讨。

一、家禽繁殖技术的进展1.1 人工授精技术在家禽生产过程中，人工授精技术已经被广泛应用。

随着技术的不断进步和提高，授精成功率也得到了大幅度提升。

同时，微创技术和精液处理技术的应用也进一步增加了授精成功率。

此外，越来越多的研究也表明人工授精对保护家禽品种纯度和提高育种效果起到了积极的推动作用。

1.2 基因编辑技术基因编辑技术作为生命科学领域的一项革新性技术，被广泛应用于家禽繁殖领域。

基因编辑技术可以精确地修改家禽的基因，用来改善家禽的生长性能、疾病抗性和产品品质等特性，这对于推动家禽产业的可持续发展和提高食品安全和质量至关重要。

1.3 快速筛查技术对于家禽繁殖和育种方面，快速筛查技术在过去的几年中得到了广泛的应用。

这些技术包括：DNA条形码技术、快速筛查技术、移动DNA技术、基因组学技术等等。

这些技术可以非常快速地识别家禽基因组中的差异，从而定位和鉴定细小的差异。

一、家禽育种技术的发展趋势2.1 遗传多样性保护由于导致家禽种群数量下降的原因有很多，包括人类活动、环境因素和育种选择等，因此遗传多样性保护成为了目前国际和国内学者研究的主题之一。

目前，有很多研究着眼于如何保护和改善家禽的遗传多样性，避免以后的家禽资源更加单一。

2.2 基于分子标记的育种基于分子标记的育种技术是近年来发展较快的一种技术方法。

分子标记法是一种DNA标记技术，可以精确测定某个特定基因区域的含量，并快速筛选出高产或者优质的鸟种。

通过这种技术，可以更好地提高家禽农业的生产效率，提高产量和品质。

2.3 现代量化遗传学现代量化遗传学是将变异区域的影响确定到遗传单位的一种方法，是最新的一种繁殖和育种技术，和基于分子标记的育种技术相辅相成。

鸡胚原始生殖细胞的分离培养与转基因研究的开题报告开题报告：鸡胚原始生殖细胞的分离培养与转基因研究一、研究背景鸡是世界上人类重要的畜禽之一，鸡蛋的生产和养殖已成为现代畜牧业的重要组成部分。

鸡的性成熟和繁殖是兽医学和畜牧学研究的重要方向。

而鸡胚原始生殖细胞是鸟类生殖发育研究中的重要组成部分，也是鸡的性成熟和后代繁殖的关键细胞。

因此，鸡胚原始生殖细胞的分离培养和转基因研究对鸡的养殖和生产具有重要意义。

二、研究目的本研究旨在通过对鸡胚原始生殖细胞的分离、培养和转基因研究，探索鸡的早期生殖发育和性细胞的形成机制，并进一步深入了解鸡的繁殖生物学，为提高鸡的生产效益和质量水平提供理论和实践基础。

三、研究内容1. 鸡胚原始生殖细胞的分离和培养方法的优化。

对已有的文献资料进行调研，了解各种鸡胚原始生殖细胞的分离培养方法，总结其优缺点，并优化建立一种简易、高效、稳定的鸡胚原始生殖细胞的分离和培养方法。

2. 鸡胚原始生殖细胞的转基因技术的研究。

通过利用CRISPR/Cas9基因编辑技术和表达载体介导系统，探究鸡胚原始生殖细胞内特定基因的生物功能和调控机制，为研究鸡的性发育和生殖生物学提供新思路。

3. 鸡胚原始生殖细胞的功能和特性的研究。

通过研究鸡胚原始生殖细胞的增殖、分化、凋亡、染色体组成等生物学特性，探讨其在鸟类性发育和生殖发育中的作用和重要性。

四、研究方法1. 分离和培养鸡胚原始生殖细胞。

采用组织分离法和细胞培养技术，选用适宜的培养基和生长因子等添加物，建立起高效、稳定的鸡胚原始生殖细胞的体外培养方法。

2. CRISPR/Cas9基因编辑技术和表达载体介导系统。

通过文献查阅和实验操作，学习并尝试利用CRISPR/Cas9基因编辑技术和表达载体介导系统，对鸡胚原始生殖细胞进行基因编辑和转基因操作。

3. 细胞生物学和分子生物学方法。

通过细胞增殖、分化、凋亡、染色体组成等生物学特性的检测和实验操作，探讨鸡胚原始生殖细胞的生物功能和特性。