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太平洋牡蛎过敏原精氨酸激酶的分子克隆、表达纯化和免疫原性鉴定赵晓涵，刘文颖，程青丽，谷瑞增，鲁军*，李国明*（中国食品发酵工业研究院，北京市蛋白功能肽工程技术研究中心，北京 100015）摘要：克隆太平洋牡蛎精氨酸激酶（CG-AK）基因，导入大肠杆菌（BL21（DE3））中，然后筛选重组菌株。
通过SDS-PAGE对重组菌株中太平洋牡蛎精氨酸激酶（CG-AK）的诱导表达条件进行探究，经Ni2+亲和层析柱纯化，通过SDS-PAGE、质谱（MALDI-TOF-MS）、圆二色（CD）光谱等方法从相对分子量、一级结构以及二级结构综合鉴定了重组CG-AK的准确性，同时使用SDS-PAGE和Western blot检测重组CG-AK 的表达，并利用酶联免疫吸附（ELISA）对其免疫原性进行鉴定。
成功克隆表达并鉴定了CG-AK，其最佳诱导表达条件为18℃诱导14h，具有良好的免疫原性。
为国内过敏原的标准化生产提供理论支持，也为后续牡蛎过敏疾病的精准诊断、治疗及脱敏方法奠定了良好的分子生物学基础。
关键词：太平洋牡蛎；精氨酸激酶；分子克隆；表达条件；免疫原性；过敏原中图分类号：R392.11/TS201.6 文献标识码：A 文章编号：1006-2513（2021）02-0100-07doi：10.19804/j.issn1006-2513.2021.02.015Cloning，expression，purification and immunogenicity identification of arginine kinase，the allergen from Crassostrea gigasZHAO Xiao-han，LIU Wen-ying，CHENG Qing-li，GU Rui-zeng，LU Jun*，LI Guo-ming*（China National Research Institute of Food & Fermentation Industry，Beijing Engineering Research Center of Protein and Functional Peptides，Beijing 100015）Abstract：The Pacific oyster arginine kinase（CG-AK）gene was cloned into E.coli（BL21（DE3）），and the recombinant strain was screened. The inducible expression conditions of the recombinant CG-AK were investigated by SDS-PAGE. The recombinant CG-AK was purified by Ni2+ affinity chromatography column，which was comprehensively identified from the relative molecular weight，primary structure and secondary structure by SDS-PAGE，mass spectrometry（MALDI-TOF-MS），circular dichroism（CD）spectroscopy. At the same time，SDS-PAGE and Western blot were used to detect the expression of recombinant CG-AK，and enzyme-linked收稿日期：2020-09-17基金项目：国家自然科学基金项目（31671963）；中国食品发酵工业研究院强院工程培育专项（院强院20-功能肽-505）。
农业经济精氨酸激酶(arginine kinase,AK)是无脊椎动物体内存在一种重要的酶，参与机体的能量代谢、体内离子交换、环境抗逆性和免疫相关等多种生理活动[1-2]，在动物体内发挥着重要作用。
长期以来，人们对精氨酸激酶的研究更集中于昆虫生理生化方面，随着对其研究的不断深入，精氨酸激酶在人类食品安全方面有着密切关系[3]。
水产品是人类重要的食物资源，但每年有大量因水产品食物中毒引发的病患，严重的会导致过敏性休克甚至死亡，严重危及普通消费者的人身健康[3]。
研究发现精氨酸激酶是多种水产品和昆虫食物中导致食物过敏的主要变应原物质之一，因此对精氨酸激酶的进一步研究对水产行业的健康发展起着重要的推动作用，也有利于消费者的身体健康。
1精氨酸激酶的性质精氨酸激酶在不同生物体内的存在形式略有不同，其不同亚基的相对分子量也有所差异，但都能催化精氨酸和三磷酸腺苷的可逆反应[4]。
由于广泛参与机体的能量代谢活动，精氨酸激酶在动物肌肉中表达量较多，特别是在甲壳类动物中分布较广，研究发现精氨酸激酶也是中国人摄食虾蟹类较为常见的过敏原，绝大部分水产品中精氨酸激酶均可导致食物过敏的发生[5]，此外，在蟑螂、蚕蛹等昆虫中该过敏原的研究也较多[1-2]。
2精氨酸激酶蛋白的高效制备及结构分析高效制备精氨酸激酶蛋白分子是开展其免疫学分析的重要前提，目前已有多种方法获得了精氨酸激酶并鉴定了其免疫活性。
陈婷[6]等从刀额新对虾中提取制备了精氨酸激酶，并通过大白兔免疫和利用Q Sep-harose TM-XL强阴离子交换色谱获得了多抗，成功鉴定了其免疫活性。
此外，研究人员利用分子克隆与重组表达技术分别制备了来源于刀额新对虾[7]、凡纳滨对虾[8]、锯缘青蟹[9]、德国小蠊[10]、东亚飞蝗[11]等的精氨酸激酶。
通过对精氨酸激酶相关结构的研究，可以确定其产生免疫作用的表位位点，为定点修饰和消除过敏原性提供了依据。
沈海旺[12]等通过分析甲壳类动物精氨酸激酶的结构特性，确定其含有10个抗原表位位点。
精氨酸激酶（AK）的提取与纯化报告题目精氨酸激酶（ＡＫ）的提取与纯化作者姓名徐青龙班级学号1005/2010114020208指导教师汪劲松完成时间2013年10月生物学实验教学中心目录１引言 (1)1.1精氨酸激酶（AK） (1)1.2亲和层析法 (2)1.3电泳法 (2)1.4本实验主要工作 (3)2.1实验用品 (3)2.1.1实验材料 (3)2.1.1实验试剂 (3)2.1.2仪器设备 (4)2.2方法 (5)2.2.1活化菌种 (5)2.2.2 扩大培养 (5)2.2.3 IPTG诱导AK基因的表达 (5)2.2.4 蛋白质提取 (5)2.2.5蛋白质的检测 (6)2.2.6 His-tag Ni亲和层析法纯化融合蛋白 (6)3 结果与分析 (7)3.1蛋白质层析图谱 (7)3.2AK诱导表达电泳图 (8)4总结 (9)参考文献 (10)致谢 (10)精氨酸激酶（AK）的提取与纯化朱景鹏（指导老师：汪劲松）（湖北师范学院生命科学学院生物科学1005班湖北黄石435002）摘要：精氨酸激酶（ATP：N-精氨酸磷酸转移酶EC2.7.3.3）存在无脊椎动物中，是参与细胞代谢的磷酸激酶。
本实验采取含有包含AK基因的重组质粒的表达菌体E. coli Rosetta，在含有50 μg/ml 的卡纳霉素的LB 培养基中培养。
当菌体浓度A600达到0.6-0.8 时，加入异丙基硫代-β-D-半乳糖苷（IPTG）,使培养基中的IPTG终浓度为0.2 mM ,诱导培养3 小时后，从菌体中得到精氨酸激酶粗提液。
再通过Ni离子亲和层析柱分离纯化精氨酸激酶，最后通过SDS-PAGE电泳来检测精氨酸激酶的表达以及其纯化程度。
关键词：精氨酸激酶分离与纯化１引言1.1精氨酸激酶（AK）精氨酸激酶（ATP:N-精氨酸磷酸转移酶E.C.2.7.3.3）是磷酸原胍基化合物激酶的一种，主要存在于无脊椎动物体内，是细胞能量代谢中非常关键的的磷酸激酶[1]。
人C-Src蛋白酪氨酸激酶真核表达、纯化及活性检测徐岚;肖斌;陈慧芹;李晓荣;郝文波【摘要】The objective of this work is to construct a eukaryotic expression vector for the C-Src tyrosine kinase(Csk)gene from human. Total RNA was extracted from HeLa cells. The full-length cDNA sequence of Csk gene was isolated and amplified via RT-PCR,and cloned into a eukaryotic expression vector pENTER,the recombinant pENTER-Csk-his plasmid was constructed. The recombinant plasmid was transfected into 293T cells,after 48 hours,the expression levels of Csk protein were determined by SDS-PAGE and Western blot. The localization of Csk protein was detected via indirect immunofluorescence,and the protein Csk was purified by nickel chelate beads;in addition,the activity of the protein was measured via his-pulldown and CO-IP. Results showed that:Double digestion and sequencing reveled that recombinant plasmid pENTER-Csk-his was constructed properly without mutation. Both SDS-PAGE and Western blot detected a 51 kD protein,indicating that Csk protein was expressed successfully in the 239T cells. The indirect immunofluorescence confirmed the expression of Csk protein in cytoplasm. Finally,the purified protein Csk by nickel chelate beads interacted with the IGF1R and SHC1 by his-pulldown and CO-IP. Conclusively,this study successfully acquired the full-length sequence of Csk,the eukaryotic expression vector pENTER-Csk-his was constructed,and the gene was expressed efficiently in 293T cells,moreover,the expressed protein presented bioactivity.%旨在构建人C-Src蛋白酪氨酸激酶（Csk）基因真核表达系统。
昆虫精氨酸激酶研究综述魏玉红;袁伟宁;张新瑞【摘要】治理农业害虫及其抗药性发展,探寻新的防虫杀虫靶标位点非常必要.精氨酸激酶是昆虫能量代谢的关键酶,与飞行活动、识别寄主、消化食物和生长发育等密切相关,而且由于其只存在于无脊椎动物体内而成为热点防虫靶标位点.本文综述了昆虫体内精氨酸激酶的分子和晶体结构特点、分布规律与活性、环境因子影响、精氨酸激酶调节剂,及其在害虫防治中的应用及前景.【期刊名称】《甘肃农业科技》【年(卷),期】2019(000)005【总页数】6页(P69-74)【关键词】精氨酸激酶;结构特征;抑制剂;害虫防治【作者】魏玉红;袁伟宁;张新瑞【作者单位】甘肃省农业科学院植物保护研究所, 甘肃兰州 730070;农业部天水作物有害生物科学观测实验站, 甘肃甘谷 741200;甘肃省农业科学院植物保护研究所, 甘肃兰州 730070;农业部天水作物有害生物科学观测实验站, 甘肃甘谷 741200;甘肃省农业科学院植物保护研究所, 甘肃兰州 730070;农业部天水作物有害生物科学观测实验站, 甘肃甘谷 741200【正文语种】中文【中图分类】Q555.7精氨酸激酶（Arginine Kinase，AK）广泛存在于无脊椎动物体中，与肌酸激酶具有相似功能，是昆虫体内唯一存在的磷酸源激酶［1］，1935 年 Lohmann［2］首次从蟹肌肉中分离获得。
不同来源的精氨酸激酶具有相同功能，即在胍基和ADP之间可逆的转移一份子磷酸基团，缓冲ATP水平［3］。
昆虫体中，精氨酸激酶主要分布在代谢旺盛和能量需求大的组织中，催化如下反应：L-arginine+Mg·ATP= N-phospho-L-arginine+Mg·ADP［4］因此，精氨酸激酶活性和表达与昆虫飞行活动、识别寄主和生长发育等诸多方面息息相关［5-6］。
由于其不存在于脊椎动物中，因此可以作为农业害虫防治中化学药剂和生物药剂新的靶标位点，通过抑制或干扰害虫能量代谢，达到杀伤或杀死害虫的目的。
精氨酸激酶基因研究进展张楠;徐贝贝;王建军【摘要】磷酸原激酶(PKs)在细胞能量代谢过程中起着关键作用,其中在无脊椎动物、原生动物和细菌中普遍存在的精氨酸激酶(AKs)已成为开发新型高选择性杀虫剂的潜在靶标.本文从精氨酸激酶基因的表达及其调控、分子进化与功能以及精氨酸激酶基因在害虫防治中的应用等几个方面介绍了国内外有关精氨酸激酶基因的研究进展.%Phosphagen kinases (PKs) play key roles in cellular energy metabolism,among which arginine kinases (AKs) are widely distributed in invertebrates,protozoan,and bacteria,and have been proposed as a potential molecular target of innovative and highly-selective insecticides.This review introduced the progress in AK gene at home and abroad,including the expression of AK gene and its regulatory mechanisms,molecular evolution and function of AK gene,as well as the application of AK gene in the insect pest control.【期刊名称】《环境昆虫学报》【年(卷),期】2017(039)003【总页数】5页(P730-734)【关键词】精氨酸激酶;基因表达及其调控;分子进化与功能;害虫防治【作者】张楠;徐贝贝;王建军【作者单位】扬州大学园艺与植物保护学院,江苏扬州225009;扬州大学园艺与植物保护学院,江苏扬州225009;扬州大学园艺与植物保护学院,江苏扬州225009【正文语种】中文【中图分类】Q965;S433精氨酸激酶(Arginine Kinase，AK)属于磷酸原激酶(胍基激酶)家族。
精氨酸激酶（AK）的表达及其纯化报告题目藻精氨酸激酶（AK）的表达及其纯化作者姓名余姣班级学号0801/2008114010130指导教师汪劲松完成时间2011年5月生物学实验教学中心目录摘要........................................................................ 错误！未定义书签。
引言.. (2)1 实验材料 (2)2 实验方法 (3)2.1菌种活化 (3)2.2扩大培养 (3)2.3 IPTG诱导AK的表达 (3)2.4 AK的提取及其纯化 (3)2.5His-tag Ni亲和层析法纯化融合蛋白 (3)2.6 AK的检测SDS-PAGE电泳 (4)3 结果与分析 (4)3.1 提取物的层析谱图与分析 (5)3.2 提取物SDS-PAGE电泳图与分析 (6)总结 (6)参考资料 (7)藻精氨酸激酶（AK）的表达及其纯化余姣（指导老师：汪劲松）摘要：精氨酸激酶（AK)(E.C.2.7.3.3)是一种磷酸原胍基化合物激酶，存在无脊椎动物中。
本实验是将具有重组有AK基因的质粒的E.coli，在含有50μg/ml卡那霉素的LB液体培养基中活化和扩大培养。
当菌体密度即OD值为0.6-0.8时，用0.5μg/ml IPTG异丙基硫代- -D-半乳糖诱导lac乳糖操纵子表达AK 5h。
接着5000 r/m离心10分钟，弃上清液获得沉淀物重悬加裂解液后用超声波破壁至沉淀变得澄清，再12000 r/m离心，弃沉淀得到AK的粗提液。
采用亲和层析法（含His-tag Ni的树脂层析柱）纯化AK，最后SDS-PAGE电泳，鉴定。
关键词：精氨酸激酶亲和层析光谱分析精氨酸激酶（AK）的表达及其纯化余姣（指导老师：汪劲松）引言：蛋白质的分离纯化是对蛋白质进行研究的一项必需的和基础的工作。
目前常使用的分离纯化的方法或技术都是在了解蛋白质性质和结构特点的基础上建立的。
中国农业科学 2006,39(11):2354-2361 Scientia Agricultura Sinica收稿日期：2005-12-27；接受日期：2006-03-18基金项目：国家自然科学基金(30370805;B30080023)，国家重点基础研究发展计划“973”(2005CB121003)，浙江省自然科学基金(Y304352)作者简介：王华兵(1981-)，男，江苏洪泽人，硕士研究生，研究方向为基因工程与生物反应器。
whbwry@ 。
通讯作者徐豫松（1962-），浙江兰溪人，副教授，博士，研究方向为基因工程与生物反应器。
Tel: 0571- 86971658; E-mail: xuyusong@家蚕精氨酸激酶基因的克隆、基因结构与表达分析王华兵，徐豫松（浙江大学动物科学学院，杭州 310029）摘要：【目的】克隆家蚕精氨酸激酶基因，分析其基因结构与表达特性,为揭示无脊椎动物体内能量代谢调节规律提供重要基础。
【方法】通过分析家蚕EST、利用RACE 法和基因组文库筛选法克隆了家蚕精氨酸激酶（Bm AK,Bombyx mori arginine kinase）基因,并对其基因结构和表达特性进行了分析。
【结果】克隆了Bm AK 基因, cDNA全长为1 268bp,编码355个氨基酸，具有精氨酸激酶典型的酶活性部位氨基酸序列，酶活性中心位点氨基酸和能形成离子偶结构氨基酸；该基因由2个外显子和1个内含子组成；5′调控序列存在BRCZ、E74A、FTZ 等多个潜在转录因子结合位点，但没有TATA 盒启动子序列；该基因的表达在不同组织和不同发育时期存在明显差异。
【结论】Bm AK 具有精氨酸激酶的典型特征，Bm AK 基因表达随发育时期不同而发生变化，基因的表达可能受蜕皮激素调控。
关键词：家蚕；精氨酸激酶；基因结构；表达；转录因子cDNA Cloning, Genomic Structure and Expression ofArginine Kinase Gene from Bombyx mori (L.)WANG Hua-bing, XU Yu-song(College of Animal Sciences, Zhejiang University, Hangzhou 310029)Abstract : 【Objective 】In order to clarify regulation mechanisms of energy metabolism of invertebrates, the arginine kinase gene in the silkworm,Bombyx mori was cloned and analyzed.【Method 】Based on the information of silkworm ESTs, the full-length cDNA of arginine kinase gene was cloned using the strategy of rapid amplification of cDNA ends, and then the genomic structure of Bm AK was analyzed. Further, the expression of Bm AK was examined.【Results 】Bm AK cDNA has 1268 bp and contains an open reading frame encoding a 355 amino acid protein. Bm AK contains the active sequence, the active site and a pair of highly conserved amino acids that form an ion pair. The Bm AK gene contains only 2 exons and 1 intron. The Bm AK promoter contains no TATA box, but potential binding sites for the transcription factors in both forward and reverse orientation:BRCZ 、E74A 、FTZ, etc. The expression level of Bm AK in different stages and tissues was obviously different.【Conclusion 】Bm AK has typical character of arginine kinase. The analysis on the transcription factor binding sites and the expression pattern of Bm AK showed that the developmental expression of Bm AK gene might be under control of ecdysone.Key words : Bombyx mori ; Arginine kinase; Gene structure; Expression; Transcription element0 前言【本研究的重要意义】精氨酸激酶是无脊椎动物体内主要的磷酸原激酶，它通过催化精氨酸和ATP 之间的可逆性反应，将能量存储于磷酸精氨酸的高能磷酸键中，或将磷酸精氨酸分解产生ATP [1]。
精氨酸激酶（AK）的提取与纯化生物学实验教学中心目录１引言 (1)1.1精氨酸激酶（AK） (1)1.2亲和层析法 (2)1.3电泳法 (2)2.1材料 (2)2.1.1实验材料与试剂 (2)2.1.2仪器设备 (3)2.2方法 (3)2.2.1活化菌种 (3)2.2.2 扩大培养 (4)2.2.3 IPTG诱导AK基因的表达 (4)2.2.4 蛋白质提取 (4)2.2.5蛋白质的检测 (4)2.2.6 His-tag Ni亲和层析法纯化融合蛋白 (5)3 结果与分析 (6)3.1蛋白质层析图谱 (6)3.2AK诱导表达电泳图 (7)4总结 (7)参考文献 (8)致谢 (8)精氨酸激酶（AK）的提取与纯化陈蕾（指导老师：汪劲松）（湖北师范学院生命科学学院生物科学0902班湖北黄石435002）摘要：精氨酸激酶（ATP：N-精氨酸磷酸转移酶EC2.7.3.3）存在无脊椎动物中，是参与细胞代谢的磷酸激酶。
重组有AK 基因的E. coli Rosetta ，在含有 50 μg/ml 的卡纳霉素的LB 培养基中培养。
当A600 达到 0.6-0.8 时，用终浓度为0.2 mM 的异丙基硫代-β-D-半乳糖苷（IPTG）诱导培养3 小时。
加裂解液后用超声破壁离心取上清，得到精氨酸激酶粗提液。
通过Ni离子亲和层析柱分离纯化精氨酸激酶，最后通过SDS-PAGE电泳来检测精氨酸激酶的表达以及其纯化程度。
关键词：精氨酸激酶分离与纯化１引言1.1精氨酸激酶（AK）精氨酸激酶（AK）是一种磷酸原激酶，磷酸原是一种磷酸化的胍基化合物。
AK在体内催化如下反应：Mg2+ATP+Arg Mg2+ADP+Arginine phosphateAK广泛颁布在许多无脊椎动物体内,目前已经研究过的生物包括：节肢动物、腹足动物、海参、头足类动物，龙虾、海葵、海湾对虾等，这些生物体内都可以分离得到AK。
虽然AK在无脊椎动物中分布十分广泛，生理功能也大致相同，但不同来源的AK在结构上表现出了非常大的多样性。
按照蛋白质的四级结构和分子量，可以划分为以下三类：1.单亚基AK，如海湾对虾中Penaeus aztecrs中提取的AK，相对分子量约为40KD，单亚基AK是目前研究最广泛的，本实验中我们所研究的AK就是单亚基，相对分子量为40KD。
2.海参Stichopusjaponicus中提取的AK 为双亚基的蛋白质，相对分子质量约为84KD。
3.环节动物Sabellapavonina中的AK具有四个亚基，分子量为150-160KD。
1.2亲和层析法亲和层析法（aflinity chromatography）是分离蛋白质的一种极为有效的方法，它经常只需经过一步处理即可使某种待提纯的蛋白质从很复杂的蛋白质混合物中分离出来，而且纯度很高。
这种方法是根据某些蛋白质与另一种称为配体(Ligand）的分子能特异而非共价地结合。
其基本原理：蛋白质在组织或细胞中是以复杂的混合物形式存在，每种类型的细胞都含有上千种不同的蛋白质，因此蛋白质的分离（Separation），提纯（Purification）和鉴定（Characterization）是生物化学中的重要的一部分，至今还没的单独或一套现成的方法能移把任何一种蛋白质从复杂的混合蛋白质中提取出来，因此往往采取几种方法联合使用。
本实验将采用Ｎｉ离子亲和层析柱进行精氨酸激酶的初步分离与纯化。
1.3电泳法各种蛋白质在同一pH条件下，因分子量和电荷数量不同而在电场中的迁移率不同而得以分开。
值得重视的是等电聚焦电泳，这是利用一种两性电解质作为载体，电泳时两性电解质形成一个由正极到负极逐渐增加的pH梯度，当带一定电荷的蛋白质在其中泳动时，到达各自等电点的pH位置就停止，此法可用于分析和制备各种蛋白质。
本实验将用SDS-PAGE电泳来检测精氨酸激酶的表达以及其纯化程度。
２材料与方法2材料与方法2.1材料2.1.1实验材料与试剂工程菌种：E．coli工程菌株RosstaLB培养基：10g胰蛋白胨、5g酵母提取物、10g氯化钠，溶于950ml中，用NaOH调节pH至7.0，补加蒸馏水至总体积为1L，分装后高压蒸汽灭菌。
2.1.2仪器设备● YC-1型层析实验冷柜（北京博医康实验仪器司）；● CXG-1型电脑恒温层析柜（上海沪西分析仪器厂有限公司）；● TGL-16LA高速冷冻离心机（星科仪器厂有限公司）；● GL-2M型冷冻离心机（湖南星科仪器有限公司）；● 超声破壁仪；（上海之信仪器厂有限公司）● 雪山制冰机（北京长洋科学仪器公司）● 超纯水机AYJ1-0501-U（颐洋企业发展有限公司）● SDS-PAGE电泳仪● 电子天平TE412-L，TE2101-L，CP64（德国Satorins公司）● BS-1E振荡培养箱(江苏省金坛市亿通电子仪器厂)● SW-CJ-1FD单人单面净化工作台（苏州净化设备有限公司）● 3FG-01B电热恒温鼓风干燥箱● 漩涡混合器XH-C（江苏省金坛市医疗仪器厂）● 高压灭菌锅YXQ-LS-50S（上海博迅有限公司）酒精灯、培养皿、移液枪、枪头、接种环、酒精棉球、离心管、恒温水浴锅等。
2.2方法2.2.1活化菌种取工程菌种100µl接入装有6ml的LB液体培养基的试管（含有6ul卡那青霉素，其工作浓度为50µg/ml）中。
于37℃摇床振荡培养8-12小时。
2.2.2 扩大培养将试管中活化的1ml菌液接种到300mlLB培养基，同时加入300µl卡那青霉素（终浓度50µg/ml）培养基于37℃恒温培养箱中培养2-3小时。
2.2.3 IPTG诱导AK基因的表达实验中在不同的培养时间（用OD值表征菌体密度）加入IPTG诱导表达发现，当OD=0.6-0.8时,加IPTG150μl至终浓度为0.2mM时AK的表达量达到最大。
2.2.4 蛋白质提取（1）将上述各管于4℃，6000r/m离心10min；（2）弃上清，加入蒸馏水使沉淀物质重悬，再于4℃，6000r/m离心10min；（3）弃上清，使沉淀物质重悬，每1g沉淀加5ml裂解液使其重悬；（4）在冰上进行10min,间隔为2秒钟的超声波破壁, 反复破壁直到沉淀变得澄清为止；（5）于4℃，12000 r/m，离心15min，取上清，得到AK的粗提液；2.2.5蛋白质的检测测AK的活性：新鲜配制测活底物，保存于4℃取5μl上清加入装有1mlAK下降值。
底物塑料比色皿迅速混匀，通过紫外分光光度法测A575SDS-PAGE电泳检验： 1）安装双垂直板电泳槽；2）配12%的分离胶15ml，浓缩胶5ml；3) 制样：取样品10µ1加样品缓冲液以40µ1混合，100℃加热5min ， 15000×g，4℃离心1 min；4）上样：用微量注射器加样15-20 µ1 ；5）电泳：在浓缩胶上加80V/cm电压，待染料进入分离胶后将电压提高到140V/cm继续电泳直到染料到达底部；6）固定和染色：用考马斯亮蓝R-250染色液浸泡，加热几分钟；7）脱色：半小时更换一次脱色液，处理3-5次，直到胶板呈现淡蓝色。
2.2.6 His-tag Ni亲和层析法纯化融合蛋白Ni柱预处理：（1）用50mLStripping Buffer洗10min，水洗20min ；（2）用1.5mol/LNaOH和1mol/LNaCL30ml混合液洗15min,水洗20min；（3）用Binding Buffer洗15min,水洗20min；（4）用0.1MNiSO4洗15min,水洗20min平衡：用Binding Buffer平衡Ni柱。
滤光片，调A=0值、T=100值；打开采集器；打开电脑蛋白核酸检上样：插A280测系统，保存文档并按开始采集。
将粗提液60ml上柱，流速约为1.4ml/min 洗脱：上样完后，用Binding Buffer淋洗。
待杂蛋白峰回落走平之后开始用不同梯度的咪唑（10 mM、250 mM）洗脱，在280 nm处进行连续紫外检测，根据微电脑记录仪显示曲线。
分别收集峰值的洗脱液根据波峰对每管收集蛋白测活并留样、电泳检测纯化程度。
3 结果与分析3.1蛋白质层析图谱图1 AK经Ni柱纯化的层析图谱由谱图可知：在上样前是用Binding Buffer平衡，上样后00:06—00:09曲线走向依然持平，说明此时流出液是Binding Buffer；00:09时曲线基本上以直线上升出峰，说明此时的穿流液中有大量的蛋白质（杂蛋白）；峰回落并基本持平后，分别用10mM、250mM咪唑洗脱，分别出峰，说明均有蛋白被洗脱下来。
3.2 AK诱导表达电泳图图2 SDS-PAGE电泳图由图可知：（1）第1道是上清液，即蛋白的粗体液。
有较强的目标蛋白带，同时也有许多杂带，说明上清液中有很多杂蛋白；（2）第2道是穿流液，除大量的与上清液相对应的杂蛋白带外，强带相比上清液浅，说明大部分AK已结合在Ni柱上;(3)第3道是10mM咪唑洗脱液，目标蛋白带较弱，说明较少AK被洗脱下来;(4)第4道是250mM咪唑洗脱液，目标蛋白带最强，说明大量AK被洗脱下来。
4总结我们以通过IPTG诱导精氨酸激酶基因在E.Coli菌株中表达，通过His-tag Ni 亲和层析法技术分离纯化得到较纯的活性精氨酸激酶，为精氨酸激酶结构与功能的研究提供基础。
诱导条件，层析系统的选择对以后的研究有着重要借鉴意义。
参考文献[1] 潘继承精氨酸激酶的折叠及其部分结构的研究博士学位论文北京：清华大学F2004(4):1-2[2] 陆健等蛋白质纯化技术及应用化学工业出版社第一版 2005 ：22-24.[3] 汪家政，范明 .蛋白质技术手册.科学出版社.2005：77－110[4]鲍时翔姚汝华蛋白质分离纯化与层析技术进展华南理工大学学报（自然科学版）1996.12:99-102[5]芳秋赵权武建国单祥年重组人亲环素A的表达，纯化及活性测定微生物学报 38(3)，1998：193-196[6]金哲洙蔡英姬抗真菌蛋白质的分离纯化中国生物制品学杂志2000.1:30-32[7]吴永革金春生人参中蛋白质的分离纯化吉林大学自然科学学报 1994年第2期:106-108致谢感谢汪老师对本实验的耐心指导，以及石玉林学长和实验室同学对本实验的帮助！。
