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精氨酸激酶（AK）的提取与纯化报告题目精氨酸激酶（ＡＫ）的提取与纯化作者姓名徐青龙班级学号1005/2010114020208指导教师汪劲松完成时间2013年10月生物学实验教学中心目录１引言 (1)1.1精氨酸激酶（AK） (1)1.2亲和层析法 (2)1.3电泳法 (2)1.4本实验主要工作 (3)2.1实验用品 (3)2.1.1实验材料 (3)2.1.1实验试剂 (3)2.1.2仪器设备 (4)2.2方法 (5)2.2.1活化菌种 (5)2.2.2 扩大培养 (5)2.2.3 IPTG诱导AK基因的表达 (5)2.2.4 蛋白质提取 (5)2.2.5蛋白质的检测 (6)2.2.6 His-tag Ni亲和层析法纯化融合蛋白 (6)3 结果与分析 (7)3.1蛋白质层析图谱 (7)3.2AK诱导表达电泳图 (8)4总结 (9)参考文献 (10)致谢 (10)精氨酸激酶（AK）的提取与纯化朱景鹏（指导老师：汪劲松）（湖北师范学院生命科学学院生物科学1005班湖北黄石435002）摘要：精氨酸激酶（ATP：N-精氨酸磷酸转移酶EC2.7.3.3）存在无脊椎动物中，是参与细胞代谢的磷酸激酶。
本实验采取含有包含AK基因的重组质粒的表达菌体E. coli Rosetta，在含有50 μg/ml 的卡纳霉素的LB 培养基中培养。
当菌体浓度A600达到0.6-0.8 时，加入异丙基硫代-β-D-半乳糖苷（IPTG）,使培养基中的IPTG终浓度为0.2 mM ,诱导培养3 小时后，从菌体中得到精氨酸激酶粗提液。
再通过Ni离子亲和层析柱分离纯化精氨酸激酶，最后通过SDS-PAGE电泳来检测精氨酸激酶的表达以及其纯化程度。
关键词：精氨酸激酶分离与纯化１引言1.1精氨酸激酶（AK）精氨酸激酶（ATP:N-精氨酸磷酸转移酶E.C.2.7.3.3）是磷酸原胍基化合物激酶的一种，主要存在于无脊椎动物体内，是细胞能量代谢中非常关键的的磷酸激酶[1]。
![精氨酸激酶的折叠及其部分结构的研究_1[1].1精氨酸激酶_11_15](https://img.taocdn.com/s1/m/39d0317101f69e31433294dd.png)
第一章引言１．１ 精氨酸激酶 精氨酸激酶(Arginine kinase，AK)(E.C.2.7.3.3)是一种磷酸原胍基化合物的激酶。
它的作用是催化如下可逆反应：将ATP上的磷酸基团转移到精氨酸上，从而形成一种具有高能键的储能分子――磷酸精氨酸。
反应方程式如下：精氨酸＋ATP・磷酸精氨酸＋ADP・Mg + H+AK被发现已经超过70年的历史了, 它属于磷酸原（胍基化合物）激酶这个大家族中的一员。
现在已经在许多种无脊椎动物中发现了AK, 例如有鳌节肢动物(chelicerate arthropod) Limulus polyphemus[1], 腹足动物(gastropod) Cellana grata 和Aplysia kurodai [2]，海参Stichopus japonicus[3]，头足类动物Nautilus pompilius[4]，龙虾(lobster) Homarus vulgaris[5]，海葵（sea anemone）Anthopleura japonicus[6]，海湾对虾（gulf shrimp）penaeus aztecus[7]等无脊椎动物中都已经分离得到了AK。
尽管说基本功能都是催化同样的高能磷酸键转移反应，但是从不同的无脊椎动物体内得到的AK的结构和分子量大小却存在着很大的差异。
这些不同的精氨酸激酶结构和大小有以下类别：（1）单亚基，如海湾对虾（gulf shrimp）penaeus aztecus 的AK[7]，是一种相对分子量约为40 kDa的单亚基的蛋白质。
单亚基的AK是目前研究最多的一种AK。
本论文中用到的AK就是单亚基，相对分子量约为40 kDa。
（2）双亚基，如海参Stichopus japonicus中分离得到的AK就是一种相对分子量约为84 kDa的双亚基蛋白质[3]。
（3）四个亚基，如环节动物（annelid）Sabella pavonina中具有相对分子量在150～160 kDa之间的四亚基AK[8]。
精氨酸激酶（AK）的表达及其纯化报告题目藻精氨酸激酶（AK）的表达及其纯化作者姓名余姣班级学号0801/2008114010130指导教师汪劲松完成时间2011年5月生物学实验教学中心目录摘要........................................................................ 错误！未定义书签。
引言.. (2)1 实验材料 (2)2 实验方法 (3)2.1菌种活化 (3)2.2扩大培养 (3)2.3 IPTG诱导AK的表达 (3)2.4 AK的提取及其纯化 (3)2.5His-tag Ni亲和层析法纯化融合蛋白 (3)2.6 AK的检测SDS-PAGE电泳 (4)3 结果与分析 (4)3.1 提取物的层析谱图与分析 (5)3.2 提取物SDS-PAGE电泳图与分析 (6)总结 (6)参考资料 (7)藻精氨酸激酶（AK）的表达及其纯化余姣（指导老师：汪劲松）摘要：精氨酸激酶（AK)(E.C.2.7.3.3)是一种磷酸原胍基化合物激酶，存在无脊椎动物中。
本实验是将具有重组有AK基因的质粒的E.coli，在含有50μg/ml卡那霉素的LB液体培养基中活化和扩大培养。
当菌体密度即OD值为0.6-0.8时，用0.5μg/ml IPTG异丙基硫代- -D-半乳糖诱导lac乳糖操纵子表达AK 5h。
接着5000 r/m离心10分钟，弃上清液获得沉淀物重悬加裂解液后用超声波破壁至沉淀变得澄清，再12000 r/m离心，弃沉淀得到AK的粗提液。
采用亲和层析法（含His-tag Ni的树脂层析柱）纯化AK，最后SDS-PAGE电泳，鉴定。
关键词：精氨酸激酶亲和层析光谱分析精氨酸激酶（AK）的表达及其纯化余姣（指导老师：汪劲松）引言：蛋白质的分离纯化是对蛋白质进行研究的一项必需的和基础的工作。
目前常使用的分离纯化的方法或技术都是在了解蛋白质性质和结构特点的基础上建立的。
氨基酸的分离纯化技术化学与材料科学学院2008级*** ***摘要:氨基酸是一种重要的生物化工产品,它广泛应用于食品、化妆品、饲料添加剂以及医药等领域。
在氨基酸的工业生产中,其分离及纯化是的一个重要环节,在总投资费用中占有很大比例。
本文对目前我国工业上常用的氨基酸分离提取方法的研究进展状况作了较全面的总结。
关键词:氨基酸;分离;纯化1 引言氨基酸是组成蛋白质的基本单元,是生物有机体的重要组成部分,具有极其重要的生理功能。
氨基酸广泛应用于食品、饲料添加剂及医药领域,也被用作合成特殊化学物质的中间体,如低热质甜味剂、螯合剂及多肽。
目前,多数氨基酸采用发酵法生产,与氨基酸发酵等生产技术的发展相比,其分离与纯化的成本可占总成本的50%以上,故提高氨基酸分离的选择性和产率及对分离纯化新技术的研究有着极其重要的现实意义。
2 氨基酸的性质氨基酸是一种具有两性官能团的物质。
氨基酸分子既含有氨基又含有羧基,氨基和羧基的电离取决于溶液的pH值和氨基酸的等电点pI:在pH低于等电点pI 时,羧基的电离被抑制,氨基酸带正电荷;在pH值高于等电点pI时,氨基的电离被抑制而带负电荷;在等电点时,氨基酸的溶解度最小,最易从溶液中析出。
按照侧链基团的不同,氨基酸可以分为3类:酸性氨基酸,中性氨基酸,和碱性氨基酸。
而各种氨基酸的等电点不同,(酸性氨基酸<中性氨基酸<碱性氨基酸)。
利用这个性质,可以把它们进行分离纯化。
3氨基酸的分离与纯化几乎所有的氨基酸分离纯化工艺均利用了氨基酸在不同的pH值时电荷量不同这一特性。
氨基酸的分离纯化方法主要有:沉淀法、离子交换法、萃取法、吸附法、膜分离法及结晶法等。
3.1 沉淀法沉淀法是最古老的分离、纯化方法,目前仍广泛应用在工业上和实验室中。
它是利用某种沉淀剂使所需要提取的物质在溶液中的溶解度降低而形成沉淀的过程。
该方法具有简单、方便、经济和浓缩倍数高的优点。
氨基酸工业中常用沉淀法有等电点沉淀法,特殊试剂沉淀法和有机溶剂沉淀法。
l—精氨酸的提取纯化流程注意事项英文回答：Extraction and Purification of L-Arginine: Considerations.L-arginine is a semi-essential amino acid that plays a crucial role in numerous physiological processes, including protein synthesis, nitric oxide production, and immune function. Its extraction and purification from natural sources or fermentation broths require careful attention to specific considerations to ensure high yield and purity.1. Raw Material Selection:Choose high-quality raw materials with low levels of impurities and contaminants.Consider the specific source (e.g., plant, animal, microbial fermentation) based on availability, cost, anddesired characteristics.2. Extraction Method:Select an appropriate extraction method based on the solubility and stability of L-arginine in various solvents. Common methods include:Water extraction: Suitable for extracting L-arginine from plant sources.Acid hydrolysis: Breaks down proteins or peptides to release free L-arginine.Enzymatic hydrolysis: Uses enzymes to specifically cleave L-arginine from proteins.3. Solvent Optimization:Determine the optimal solvent or solvent system for efficient extraction.Consider factors such as polarity, solubility, and selectivity for L-arginine.Avoid solvents that can adversely affect the stability or yield of L-arginine.4. pH Control:Maintain the pH of the extraction solution within a range that minimizes degradation or loss of L-arginine.Use pH buffers or adjust the pH using acids or bases as necessary.5. Temperature Management:Control the temperature during extraction to prevent thermal degradation.Use cooling or heating systems to maintain the desired temperature range.6. Purification Techniques:Employ appropriate purification techniques to remove impurities and contaminants from the extracted L-arginine. Common methods include:Ion exchange chromatography: Separates compounds based on their ionic charge.Size exclusion chromatography: Separates compounds based on their molecular size.Crystallization: Induces L-arginine precipitation for further purification.7. Quality Control:Implement rigorous quality control measures to verify the purity and identity of the purified L-arginine.Use analytical techniques such as HPLC, spectrophotometry, or amino acid analysis.中文回答：L-精氨酸的提取纯化注意事项。
精氨酸激酶（AK）的提取与纯化张纯洁（湖北师范学院生物系 湖北黄石 435002）摘要：精氨酸激酶（ATP：N-精氨酸磷酸转移酶EC2.7.3.3）存在无脊椎动物中，是参与细胞代谢的磷酸激酶。
重组有AK基因的E. coli Rosetta，在含有50 μg/ml的卡纳霉素的LB培养基中培养。
当A600达到0.6-0.8时，用终浓度为0.2 mM的异丙基硫代-β-D-半乳糖苷（IPTG）诱导培养3小时。
加裂解液后用超声破壁离心取上清，得到精氨酸激酶粗提液。
通过CM-Cellulose阳离子交换层析，Sephacryl TM-100凝胶过滤层析，Q-Sepharose阴离子交换层析分离纯化得到电泳纯的精氨酸激酶。
关键词：精氨酸激酶提取与纯化Extraction and Purification of Arginine KinaseAbstract： Arginine kinase（ATP：L-arginine phosphotransferase EC 2.7.3.3），plays an important role in cellular energy metabolism in invertebrate.E. coli Rosetta which contains recombinant AK gene was grown in LBmedium containing kanamycin (Final concentration: 25 μg/mL). Whenabsorbance at 600 nm value was between 0.6 with 0.8, isopropylβ-D-thiogalactopyranoside was added to 0.2 mM and the incubation wascontinued an addition 3 h. The cell was broken and centrifugated, thenthe crude cell extract was harvested. Furthermore it was purified byfollowing three methods in turn: CM-Cellulose positive ion exchangechromatography, Sephacryl TM-100gel filtrate chromatography, andQ-Sepharose anion exchange chromatography. A purified AK was foundto be homogenous by SDS poly -acrylaminde gel electrophoresis.Key words: arginine kinase extraction and purification1引言精氨酸激酶（AK）是一种磷酸原激酶，磷酸原是一种磷酸化的胍基化合物。
AK在体内催化如下反应：Mg2+ATP+Arg Mg2+ADP+Arginine phosphateAK广泛颁布在许多无脊椎动物体内,目前已经研究过的生物包括：节肢动物、腹足动物、海参、头足类动物，龙虾、海葵、海湾对虾等，这些生物体内都可以分离得到AK。
虽然AK在无脊椎动物中分布十分广泛，生理功能也大致相同，但不同来源的AK在结构上表现出了非常大的多样性。
按照蛋白质的四级结构和分子量，可以划分为以下三类：1.单亚基AK，如海湾对虾中Penaeus aztecrs中提取的AK，相对分子量约为40KD，单亚基AK是目前研究最广泛的，本实验中我们所研究的AK就是单亚基，相对分子量为40KD。
2.海参Stichopusjaponicus中提取的AK为双亚基的蛋白质，相对分子质量约为84KD。
3.环节动物Sabellapavonina 中的AK具有四个亚基，分子量为150-160KD。
2实验材料以及实验试剂：2.1实验材料工程菌种：E．coli工程菌株Rossta2.2实验试剂LB培养基：10g胰蛋白胨、5g酵母提取物、10g氯化钠，溶于950ml中，用NaOH调节pH至7.0，补加蒸馏水至总体积为1L，分装后高压蒸汽灭菌。
缓冲液：Buffer A：Tris 0.4 M、EDTA 1 mM、PMSF 25 μM、2-mercaptoethanol 10 mM、NaN3 5 μM，加入浓盐酸调pH 8.0；Buffer B：Tris 10 mM、EDTA 0.1 mM、2-mercaptoethanol 10 mM，加入浓盐酸调pH 8.0;贮存Buffer：Glycine 0.1 M，（NH4）2 SO4 3.2 M、2-mercaptoethanol 10 mM，加入NaOH 调至pH8.6;工作Buffer：Glycine 0.1M、2-mercaptoethanol 10mM，加入NaOH 调至pH8.6以上均为配制1L 溶液所需试剂量。
测活底物：57 mM Arg 2.0 ml、66 mM Mg(AC)2 2.0 ml、指示剂 2.0 ml、ATP 0.0532g，蒸馏水 14 ml加入NaOH调至pH8.2。
3实验方法3.1活化菌种取6支试管，各装有3 ml的LB液体培养基。
再各取工程菌种10 µl接入装有3 ml的LB液体培养基的试管（含有卡那青霉素，其工作浓度为50 µg/ml）中。
于37 ℃摇床振荡培养8-12小时。
3.2扩大培养取6支1L锥形瓶，各装300 ml LB培养基。
将试管中活化的1 ml菌液接种到300 ml LB培养基，同时加入300 µl卡那青霉素（终浓度50 µg/ml）培养基于37 ℃恒温培养箱中培养2-3小时。
3.3 IPTG诱导AK基因的表达实验中在不同的培养时间（用OD值表征菌体密度）加入IPTG诱导表达发现，当OD=0.6-0.8时，各加150 μl的 IPTG至终浓度为0.2 mM时AK的表达量达到最大。
3.4蛋白质提取（1）将上述各管于4 ℃，5000 r/m离心10 min；（2）弃上清，使沉淀物质重悬，每1 g沉淀加3 ml裂解液；（3）在冰上进行间隔为2秒钟的超声波破壁,直到沉淀变得澄清为止；（4）于4℃，12000 rpm，离心10 min，取上清，得到AK的粗提液。
3.5蛋白质的检测◆测定AK的活性：新鲜配制测活底物，保存于4℃取5 μl上清加入装有1mlAK底物塑料比色皿迅速混匀，通过紫外分光光度法测A575下降值◆ SDS-PAGE电泳[3.4]：（1）安装双垂直板电泳槽；（2）配12%的分离胶15ml，浓缩胶5ml；（3) 制样：取样品10 µ1加样品缓冲液以40µ1混合，100℃加热5 min ， 15000×g，4℃离心1 min；（4）上样：用微量注射器加样15-20 µ1；（5）电泳：在凝胶上加80 V/cm电压，待染料进入分离胶后将电压提高到140 V/cm继续电泳直到染料到达底部；（6）固定和染色：用考马斯亮蓝R-250染色液浸泡，加热几分钟；（7）脱色：半小时更换一次脱色液，处理3-5次，直到胶板呈现淡蓝色。
3.6蛋白质的纯化（1）CMC阳离子交换层析平衡：3倍柱床体积Buffer A（pH=8.0）平衡上样：插A280滤光片，调A值、T值；打开采集器；打开电脑蛋白核酸检测系统，保存文档并按开始采集。
将粗提液34ml上柱，流速约为1.4ml/min。
洗脱：Buffer A (pH=8.0)洗柱，同时在280nm处进行连续紫外检测，收集洗脱峰。
（2）S-100凝胶过滤层析平衡：3倍柱床体积Buffer B 透析平衡上样：待插A280滤光片，调A值、T值；打开采集器；打开电脑蛋白核酸检测系统，保存文档并按开始采集。
稳定后将过CMC的洗脱液85 mL浓缩到50 mL 上柱，流速约1 ml/min。
洗脱：Buffer B (pH=8.0)洗柱，同时在280 nm处进行连续紫外检测，根据电脑监测波峰收集蛋白并留样测活、电泳。
（3）Q-Sepharose阴离子交换层析平衡：3倍柱床体积Buffer B 透析平衡上样：待插A280滤光片，调A值、T值；打开采集器；打开电脑蛋白核酸检测系统，保存文档并按开始采集。
稳定后将经过S-100处理的蛋白上柱，流速约1 ml/min。
洗脱：Buffer B (pH=8.0)洗柱将Buffer B溶液和1mol/L NaCl的Buffer B溶液各300mL于梯度混合仪的两容器中逐步混合由低浓度到高浓度进行洗脱蛋白。
流速0.98mL/min同时在280nm处进行连续紫外检测，设定每根收集试管收集流出蛋白时间，根据微电脑记录仪显示曲线，分别收集峰值的洗脱液根据波峰对每管收集蛋白测活并留样、电泳检测纯化程度。
4结果与分析4.1蛋白质层析图谱图1-1. AK经CMC离子交换后的层析谱图如图1-1所示，由于CMC是阳离子交换树脂，而精氨酸（AK）在Buffer A（pH=8.0）下带负电荷，所以不被吸附在其上；带正电荷的杂蛋白会被吸附，因此可以我们得到的是一个主要由带负电荷形成的单一的峰。
图1-2 S-100凝胶层析谱图如图1-2 所示，将经CMC纯化后的蛋白溶液经浓缩，上样到分子筛S-100进一步分离纯化，得到几个洗脱峰。
分步收集每个峰的蛋白溶液进行活性检测，发现第一个峰含AK。
图1-3. AK经Q-sepharose离子交换后的层析谱图如图1-3 所示，将合并后的含AK蛋白溶液经Q－sepharose 纯化后得到如图，由于不同的蛋白在pH=8.0的BufferB缓冲液中所带电荷不同，与树脂的结合能力有差别，所以用盐进行洗脱时梯度时，会出现连续几个峰，所示结果。
活性检测显示第二个洗脱主峰含AK。
4.2 AK诱导表达电泳图1 2 3 4 5 MW(KD)2-1 AK经各步纯化与诱导表达对比电泳图1、经Q-sepharose离子交换后AK2、经S-100凝胶层析后AK3、经CMC离子交换后AK4、破壁后上清5、标准蛋白质5结果及讨论根据以上实验结果总结数据，我们计算得出在大肠杆菌Rossta中提取AK的各项得率如表5-1所示：Purification step V olume/mlTotalactivity/UTotalprotein/mgSpecificactivity/U·mg-¹PurificationfoldRecovery(％)上清 34 7309．32274．73 26．61 1 100 过CMC 85 6890．30235．98 29．20 1．10 94．27 过S-100 73 6373．78193．36 32．96 1．24 87．20 过Q 36．5 4393．1852．31 83．98 3．15 60．10表5-1由上表可以看出，在AK提取过程中，总的活力是逐级流失的，活力单位是递增的。
