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![精氨酸激酶的折叠及其部分结构的研究_1[1].1精氨酸激酶_11_15](https://uimg.taocdn.com/39d0317101f69e31433294dd.webp)
第一章引言１．１ 精氨酸激酶 精氨酸激酶(Arginine kinase，AK)(E.C.2.7.3.3)是一种磷酸原胍基化合物的激酶。
它的作用是催化如下可逆反应：将ATP上的磷酸基团转移到精氨酸上，从而形成一种具有高能键的储能分子――磷酸精氨酸。
反应方程式如下：精氨酸＋ATP・磷酸精氨酸＋ADP・Mg + H+AK被发现已经超过70年的历史了, 它属于磷酸原（胍基化合物）激酶这个大家族中的一员。
现在已经在许多种无脊椎动物中发现了AK, 例如有鳌节肢动物(chelicerate arthropod) Limulus polyphemus[1], 腹足动物(gastropod) Cellana grata 和Aplysia kurodai [2]，海参Stichopus japonicus[3]，头足类动物Nautilus pompilius[4]，龙虾(lobster) Homarus vulgaris[5]，海葵（sea anemone）Anthopleura japonicus[6]，海湾对虾（gulf shrimp）penaeus aztecus[7]等无脊椎动物中都已经分离得到了AK。
尽管说基本功能都是催化同样的高能磷酸键转移反应，但是从不同的无脊椎动物体内得到的AK的结构和分子量大小却存在着很大的差异。
这些不同的精氨酸激酶结构和大小有以下类别：（1）单亚基，如海湾对虾（gulf shrimp）penaeus aztecus 的AK[7]，是一种相对分子量约为40 kDa的单亚基的蛋白质。
单亚基的AK是目前研究最多的一种AK。
本论文中用到的AK就是单亚基，相对分子量约为40 kDa。
（2）双亚基，如海参Stichopus japonicus中分离得到的AK就是一种相对分子量约为84 kDa的双亚基蛋白质[3]。
（3）四个亚基，如环节动物（annelid）Sabella pavonina中具有相对分子量在150～160 kDa之间的四亚基AK[8]。
AKTA pure操作说明分子筛层析操作步骤：1. 开机：打开AKTA pure开关，看指示灯，泵同步（泵内有注入液体的声音）。
2. 打开系统：打开电脑：双击Unicorn 7.0打开系统，进入log on 界面，用户名默认为Default，输入密码：default，点ok键，出现提示对话框，继续点确定，进入系统。
注意：进入系统时会弹出三个界面：System Control界面，Evaluation界面和Administration界面。
其中system Control界面为主操作窗口，所有的设置选项都是在该界面下完成：Manual---Execute Manual instructions---......；Evaluation界面为结果数据查看及处理窗口；Administration界面为Unicorn 7.0系统设置界面。
3. 洗泵：把A1泵头从20%乙醇中取出，用去离子水冲洗，放入分子筛缓冲液中，在SystemControl界面下，点击manual---Execute Manual instructions---Pumps---Pump A wash---点开inlet，选择A1---Excuse。
4. 设置系统参数：设柱压：Alams---alam systerm pressure---high alam---设置柱压---Execute；设流速：Pumps---System flow ---设置system flow（1mL/min）---Execute。
注意：流速和柱压设置参照“GE蛋白纯化柱表”，不要超出最高限制。
5. 装柱子(先上后下)：接柱子的上面：拧下连接进样阀和检测器之间的线，等进样阀出口有液体流出时，拧开柱上面线头的螺帽，将它连到进样阀出口；接柱子的下面：去掉柱下端连接的注射器，连上接头，连上一段线，待液体滴出滴出液体滴到检测器上的连接口的洞里，滴满，将接头连到检测器的连接口里。
食品科技小龙虾过敏原及其脱敏加工技术的研究进展吴 涛1，吴 彬2，何晓希1，杨荣玲1，邵灿灿1，赵祥杰1*（1.淮阴工学院 生命科学与食品工程学院，江苏淮安 223003；2.淮安市产品质量监督综合检验中心，江苏淮安 223001）摘 要：小龙虾味道鲜美，营养丰富，受到广大消费者的喜爱，但也出现了食用小龙虾过敏的案例，引发社会关注。
小龙虾中含有多种过敏原物质，给消费者安全食用带来健康隐患。
本文概述了引发小龙虾食物过敏的主要过敏原物质及其性质，并从过敏原消减的角度综述了目前应用于小龙虾的各种先进加工技术，探讨了各种脱敏加工技术对过敏原的影响，以期为小龙虾加工技术的开发和应用提供参考。
关键词：小龙虾；过敏原；致敏性；脱敏技术Research Progress on Procambarus clarkii Allergen and Its Desensitization Processing TechnologyWU Tao1, WU Bin2, HE Xiaoxi1, YANG Rongling1, SHAO Cancan1, ZHAO Xiangjie1*(1.College of Life Sciences and Food Engineering, Huaiyin Institute of Technology, Huai’an 223003, China;2.Huai’an Product Quality Supervision and Inspection Center, Huai’an 223001, China)Abstract: Procambarus clarkii has a delicious taste and rich nutrition, which is popular among consumers. However, there have also been cases of allergic consumption of Procambarus clarkii, which has attracted social attention. Procambarus clarkii contains various allergenic substances, which pose health risks to consumers’ safe consumption. This article provides an overview of the main allergenic substances and their properties that cause food allergies in Procambarus clarkii, and reviews various advanced processing technologies currently applied to Procambarus clarkii. It explores the impact of various desensitization processing technologies on allergens, in order to provide reference for the development and application of processing technology for Procambarus clarkii.Keywords:Procambarus clarkii; allergen; allergenicity; desensitization technology食物过敏已成为当前社会发展和食品安全的热点问题之一，对于常见食物的摄入，难以有效去除其过敏性，将给机体健康带来重大隐患。
精氨酸激酶（AK）的表达及其纯化报告题目藻精氨酸激酶（AK）的表达及其纯化作者姓名余姣班级学号0801/2008114010130指导教师汪劲松完成时间2011年5月生物学实验教学中心目录摘要........................................................................ 错误！未定义书签。
引言.. (2)1 实验材料 (2)2 实验方法 (3)2.1菌种活化 (3)2.2扩大培养 (3)2.3 IPTG诱导AK的表达 (3)2.4 AK的提取及其纯化 (3)2.5His-tag Ni亲和层析法纯化融合蛋白 (3)2.6 AK的检测SDS-PAGE电泳 (4)3 结果与分析 (4)3.1 提取物的层析谱图与分析 (5)3.2 提取物SDS-PAGE电泳图与分析 (6)总结 (6)参考资料 (7)藻精氨酸激酶（AK）的表达及其纯化余姣（指导老师：汪劲松）摘要：精氨酸激酶（AK)(E.C.2.7.3.3)是一种磷酸原胍基化合物激酶，存在无脊椎动物中。
本实验是将具有重组有AK基因的质粒的E.coli，在含有50μg/ml卡那霉素的LB液体培养基中活化和扩大培养。
当菌体密度即OD值为0.6-0.8时，用0.5μg/ml IPTG异丙基硫代- -D-半乳糖诱导lac乳糖操纵子表达AK 5h。
接着5000 r/m离心10分钟，弃上清液获得沉淀物重悬加裂解液后用超声波破壁至沉淀变得澄清，再12000 r/m离心，弃沉淀得到AK的粗提液。
采用亲和层析法（含His-tag Ni的树脂层析柱）纯化AK，最后SDS-PAGE电泳，鉴定。
关键词：精氨酸激酶亲和层析光谱分析精氨酸激酶（AK）的表达及其纯化余姣（指导老师：汪劲松）引言：蛋白质的分离纯化是对蛋白质进行研究的一项必需的和基础的工作。
目前常使用的分离纯化的方法或技术都是在了解蛋白质性质和结构特点的基础上建立的。
氨基酸的分离纯化技术化学与材料科学学院2008级*** ***摘要:氨基酸是一种重要的生物化工产品,它广泛应用于食品、化妆品、饲料添加剂以及医药等领域。
在氨基酸的工业生产中,其分离及纯化是的一个重要环节,在总投资费用中占有很大比例。
本文对目前我国工业上常用的氨基酸分离提取方法的研究进展状况作了较全面的总结。
关键词:氨基酸;分离;纯化1 引言氨基酸是组成蛋白质的基本单元,是生物有机体的重要组成部分,具有极其重要的生理功能。
氨基酸广泛应用于食品、饲料添加剂及医药领域,也被用作合成特殊化学物质的中间体,如低热质甜味剂、螯合剂及多肽。
目前,多数氨基酸采用发酵法生产,与氨基酸发酵等生产技术的发展相比,其分离与纯化的成本可占总成本的50%以上,故提高氨基酸分离的选择性和产率及对分离纯化新技术的研究有着极其重要的现实意义。
2 氨基酸的性质氨基酸是一种具有两性官能团的物质。
氨基酸分子既含有氨基又含有羧基,氨基和羧基的电离取决于溶液的pH值和氨基酸的等电点pI:在pH低于等电点pI 时,羧基的电离被抑制,氨基酸带正电荷;在pH值高于等电点pI时,氨基的电离被抑制而带负电荷;在等电点时,氨基酸的溶解度最小,最易从溶液中析出。
按照侧链基团的不同,氨基酸可以分为3类:酸性氨基酸,中性氨基酸,和碱性氨基酸。
而各种氨基酸的等电点不同,(酸性氨基酸<中性氨基酸<碱性氨基酸)。
利用这个性质,可以把它们进行分离纯化。
3氨基酸的分离与纯化几乎所有的氨基酸分离纯化工艺均利用了氨基酸在不同的pH值时电荷量不同这一特性。
氨基酸的分离纯化方法主要有:沉淀法、离子交换法、萃取法、吸附法、膜分离法及结晶法等。
3.1 沉淀法沉淀法是最古老的分离、纯化方法,目前仍广泛应用在工业上和实验室中。
它是利用某种沉淀剂使所需要提取的物质在溶液中的溶解度降低而形成沉淀的过程。
该方法具有简单、方便、经济和浓缩倍数高的优点。
氨基酸工业中常用沉淀法有等电点沉淀法,特殊试剂沉淀法和有机溶剂沉淀法。
昆虫精氨酸激酶研究综述魏玉红1,2,袁伟宁1,2,张新瑞1,2（1.甘肃省农业科学院植物保护研究所，甘肃兰州730070；2.农业部天水作物有害生物科学观测实验站，甘肃甘谷741200）收稿日期：2019-01-09基金项目：甘肃省科技重大专项（1062NKDF021）；甘肃省科技支撑计划项目（1604NKCA063）；兰州市科技计划项目（2016-3-95）；甘肃省农业科学院农业科技创新专项（2017GAAS23）。
作者简介：魏玉红（1976—），女，甘肃皋兰人，高级农艺师，主要从事农业昆虫与害虫防治研究工作。
通信作者：张新瑞（1964—），男，甘肃武山人，研究员，博士，硕士生导师，研究方向为农业有害生物综合防治。
Email ：zxr@ 。
摘要：治理农业害虫及其抗药性发展，探寻新的防虫杀虫靶标位点非常必要。
精氨酸激酶是昆虫能量代谢的关键酶，与飞行活动、识别寄主、消化食物和生长发育等密切相关，而且由于其只存在于无脊椎动物体内而成为热点防虫靶标位点。
本文综述了昆虫体内精氨酸激酶的分子和晶体结构特点、分布规律与活性、环境因子影响、精氨酸激酶调节剂，及其在害虫防治中的应用及前景。
关键词：精氨酸激酶；结构特征；抑制剂；害虫防治中图分类号：Q555.7文献标志码：A 文章编号：1001-1463（2019）05-0069-06doi ：10.3969/j.issn.1001-1463.2019.05.016Research Summary on Arginine Kinase in InsectsWEI Yuhong 1，2，YUAN Weining 1，2，ZHANG Xinrui 1，2（1.Institute of Plant Protection ，Gansu Academy of Agricultural Sciences ，Lanzhou Gansu 730070，China ；2.Scientific Observing and Experimental Station of Crop Pests in Tianshui ，Ministry of Agriculture ，Tianshui Gansu 741200，China ）Abstract ：In order to control agricultural pests and pest resistance development ，the exploring of new insecticidal target sites is importantly necessary.Arginine kinase is a key functional enzyme relate to energy metabolism of insects ，flight activities ，identifying host ，digestion ，the growth and development ，etc ，as well ，because of its exist in invertebrates merely ，Arginine kinase becomes a famous pest control target.Thus ，This study summarized the arginine kinase molecular and crystal structure characteristics ，distribution and activity and ，influences of environmental factors ，regulator of arginine kinase ，application in pest control and the application prospect ，so as to make a steppingstone to the future study and new pesticide development with arginine kinase.Key words ：Arginine Kinase ；Sstructure traits ；Inhibitors ；Pest control精氨酸激酶（Arginine Kinase ，AK ）广泛存在于无脊椎动物体中，与肌酸激酶具有相似功能，是昆虫体内唯一存在的磷酸源激酶［1］，1935年Lohmann ［2］首次从蟹肌肉中分离获得。
A K蛋白纯化系统操作精选文档TTMS system office room 【TTMS16H-TTMS2A-TTMS8Q8-AKTA蛋白纯化系统操作AKTA蛋白纯化系统是当前蛋白纯化工作经常用到的一组设备，自动化程度很高。
AKTA系统依据不同的配置，可以分为AKTA EXPLORER、AKTA PILOT、AKTA PURIFIER等多种型号的设备。
以下以AKTA EXPLORER为例简单介绍AKTA蛋白纯化系统的一般操作。
1、认识AKTA。
AKTA explorer 是为方法开拓及研究应用而设计的全自动液相色谱系统。
该色谱系统的分离装置有三个主要组件，在底部平台的左侧整齐堆起（Fig 1）。
它们是：FIG 1、AKTA EXPLORER主机Pump-900 为双通道高效梯度泵系列。
在AKTAexplorer 100，流速范围0.01-100 ml/min，压力高达10 Mpa（泵名为P-901）。
在AKTA explore10，流速范围0.001-10 ml/min，压力高达25 Mpa（泵名为P-903）。
Monitor UV-900，同时监控190－700 nm 范围内高达3 个波长的多波长紫外-可见（UV-Vis）监测器。
（针对部分AKTA PURIFIER机型，尚有UPC-900监测器可供选择，光源为汞灯光源，一次可以监控一个波长，安装滤光片后，可以在选择的波长范围内进行切换。
）Monitor pH/C-900，在线电导和pH 监测的组合监测器。
Fig 2、AKTA EXPLORER硬件模式图AKTA EXPLORER系统的主要组成部件可以用模式图表示（Fig 2）。
组成部件，如混合器、柱及不同的阀安装在右边部分。
打开装阀的门可全部看到。
柱被挂在装阀的门的外侧。
分离装置由UNICORN 软件控制。
软件安装于一独立的电脑主机之中，在电脑与色谱系统之间的通信由数据采集装置CU950进行控制。
生产精氨酸工艺流程生产精氨酸工艺流程精氨酸（L-arginine）是一种重要的氨基酸，广泛应用于医药、食品、化妆品和饲料等领域。
下面将介绍一种常见的精氨酸工艺流程。
首先，精氨酸的生产通常采用微生物发酵的方法。
选用产精氨酸能力强、耐高温、耐酸碱的微生物菌株，如大肠杆菌、蛮荒态放线菌等，以这些微生物为种子菌，通过菌种培养的方式扩大种群。
接下来是发酵过程。
首先，将选用的微生物菌种接入发酵罐中，在一定的培养基、酸碱条件和温度下生长和繁殖。
发酵罐中的培养基是由大豆蛋白、葡萄糖、氯化钠、磷酸二氢钾等原料按一定比例混合而成。
在发酵过程中，还需要控制培养基的pH 值、温度、氧气供应以及搅拌速度等因素，以保证微生物菌株的正常生长和产氨酸的效果。
随着发酵过程的进行，微生物会消耗培养基中的养分，同时产生精氨酸。
经过一段时间的发酵，发酵液中的精氨酸逐渐积累，达到一定的浓度后，可进行下一步的分离纯化工序。
分离纯化是精氨酸生产过程中的关键步骤之一。
一般采用离心、滤液、酸碱沉淀、透析等技术方法将发酵液中的粗制精氨酸与其他杂质进行分离。
其中，酸碱沉淀是一种常用的分离技术，通过调节发酵液的pH值，使得经过酸碱处理后，精氨酸以固体形式沉淀下来，悬浮液中的杂质则可被沉淀物分离开。
最后，对精氨酸进行精制和干燥处理。
这一步骤主要是通过蒸馏、结晶、洗涤、再结晶等工艺操作，去除其中的余量杂质，得到纯度更高的精氨酸产物。
将精制后的产物进行干燥，以降低水分含量，保证产品的贮存稳定性和品质。
在整个生产工艺过程中，需要严格控制各个环节的操作条件，保证菌种的活力和稳定性，控制发酵条件和分离纯化过程的技术参数。
同时，要做好卫生防护工作，确保产品的质量和安全。
总之，精氨酸的生产工艺流程主要包括菌种培养、发酵、分离纯化和精制干燥等步骤。
通过合理控制各个环节的操作，能够高效地生产出优质的精氨酸产品，满足市场需求。
AKTA pure操作说明分子筛层析操作步骤：1. 开机：打开AKTA pure开关，看指示灯，泵同步（泵内有注入液体的声音）。
2. 打开系统：打开电脑：双击Unicorn 7.0打开系统，进入log on 界面，用户名默认为Default，输入密码：default，点ok键，出现提示对话框，继续点确定，进入系统。
注意：进入系统时会弹出三个界面：System Control界面，Evaluation界面和Administration界面。
其中system Control界面为主操作窗口，所有的设置选项都是在该界面下完成：Manual---Execute Manual instructions---......；Evaluation界面为结果数据查看及处理窗口；Administration界面为Unicorn 7.0系统设置界面。
3. 洗泵：把A1泵头从20%乙醇中取出，用去离子水冲洗，放入分子筛缓冲液中，在SystemControl界面下，点击manual---Execute Manual instructions---Pumps---Pump A wash---点开inlet，选择A1---Excuse。
4. 设置系统参数：设柱压：Alams---alam systerm pressure---high alam---设置柱压---Execute；设流速：Pumps---System flow ---设置system flow（1mL/min）---Execute。
注意：流速和柱压设置参照“GE蛋白纯化柱表”，不要超出最高限制。
5. 装柱子(先上后下)：接柱子的上面：拧下连接进样阀和检测器之间的线，等进样阀出口有液体流出时，拧开柱上面线头的螺帽，将它连到进样阀出口；接柱子的下面：去掉柱下端连接的注射器，连上接头，连上一段线，待液体滴出滴出液体滴到检测器上的连接口的洞里，滴满，将接头连到检测器的连接口里。
一、实验目的1. 了解精氨酸激酶的基本性质和作用。
2. 掌握精氨酸激酶的活性测定方法。
3. 分析不同条件对精氨酸激酶活性的影响。
二、实验原理精氨酸激酶（Arginase）是一种非特异性酶，主要存在于哺乳动物细胞中，能够催化精氨酸与鸟苷三磷酸（GTP）反应生成鸟氨酸和焦磷酸（PPi）。
本实验通过测定精氨酸激酶催化反应的速率，来评价其活性。
三、实验材料与仪器1. 实验材料：- 精氨酸激酶- 精氨酸- GTP- 磷酸缓冲液- 丙酮- 丙酮酸钠- 氯化钠- 氨水- 氢氧化钠- 硫酸铜- 氯化钡- 氢氧化钠溶液- 精氨酸激酶底物溶液- 比色计- 移液器- 电子天平- 恒温水浴锅2. 实验试剂：- 0.1mol/L磷酸缓冲液（pH 7.4）- 0.1mol/L GTP溶液- 0.1mol/L精氨酸溶液- 0.1mol/L丙酮溶液- 0.1mol/L丙酮酸钠溶液- 0.1mol/L氯化钠溶液- 0.1mol/L氨水溶液- 0.1mol/L氢氧化钠溶液- 0.1mol/L硫酸铜溶液- 0.1mol/L氯化钡溶液四、实验方法1. 配制精氨酸激酶底物溶液：- 称取一定量的精氨酸和GTP，溶解于0.1mol/L磷酸缓冲液中，配制成一定浓度的底物溶液。
2. 精氨酸激酶活性测定：- 取一定量的精氨酸激酶溶液，加入底物溶液，混匀后置于恒温水浴锅中，在特定温度下反应。
- 在反应过程中，每隔一定时间取样，测定反应液中的GTP浓度。
- 通过比较不同时间点GTP浓度的变化，计算精氨酸激酶的活性。
3. 影响因素分析：- 研究不同pH、温度、底物浓度、酶浓度等因素对精氨酸激酶活性的影响。
五、实验结果与分析1. 精氨酸激酶活性测定结果：- 在实验条件下，精氨酸激酶的活性为X U/mL。
2. 影响因素分析结果：- pH：精氨酸激酶的最适pH为7.4。
- 温度：精氨酸激酶的最适温度为37℃。
- 底物浓度：在一定范围内，底物浓度越高，精氨酸激酶活性越高。
锯缘青蟹精氨酸激酶的分离纯化、分子克隆及过敏原性研究食物过敏是人类常见的一种免疫性疾病,随着社会进步和全球化进程的不断发展,食物过敏的发病率越来越高,成为全球关注的食品安全问题。
食物过敏主要由食物中蛋白质引起,主要症状有哮喘、荨麻疹等,严重的甚至会危及到生命。
水产品是最常见的过敏食物,水产食品中原肌球蛋白、小清蛋白等作为主要过敏原已得到国内外学者的广泛研究,而对于精氨酸激酶(Arginine Kinase,AK)是否为过敏原,其理化特性及致敏性如何,仍有待于进一步的研究证实。
锯缘青蟹(Scylla serrata)肉质鲜美,营养丰富,是我国蟹类增养殖的重要对象,深受我国消费者喜爱,同时其远销日本、东南亚等国家,也是全球的主要经济蟹类。
本研究以国内产量丰富的锯缘青蟹为研究对象,从分离纯化、抗体制备、分子克隆、原核表达、过敏原性等方面对精氨酸激酶进行了研究。
首先采用70-90 %硫酸铵沉淀及HiTrap Q亲和层析方法,从锯缘青蟹肌浆蛋白中分离得到分子量为40 kDa的天然蛋白(nAK),SDS-PAGE(Sodium Dodecyl Sulfate-Polyacrylamide Gel Electrophoresis,SDS-PAGE)及2D-PAGE(Two dimensional-PAGE,2D-PAGE)分析结果显示该蛋白的分子量为40 kDa、等电点为6.5,这与虾类精氨酸激酶Pen m 2性质相近。
兔抗白虾精氨酸激酶IgG抗体及兔抗锯缘青蟹精氨酸激酶IgG抗体的Western-blot结果表明纯化的锯缘青蟹40kDa蛋白为精氨酸激酶。
通过分子生物学技术方法,克隆得到锯缘青蟹精氨酸激酶开放阅读框基因序列。
测序结果显示,该开放阅读框基因的序列长度为1071 bp,编码356个氨基酸残基,该序列登录Genbank(GQ:851626)。
序列比对结果显示,锯缘青蟹精氨酸激酶基因与凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)精氨酸激酶基因的序列同源性高达94 %,与岸蟹(Carcinus maenas)、中华绒鳌蟹(Eriocheir sinensis)等甲壳类动物的精氨酸激酶也有较高的同源性(均>90 %)。
l—精氨酸的提取纯化流程注意事项下载提示：该文档是本店铺精心编制而成的，希望大家下载后，能够帮助大家解决实际问题。
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在进行精氨酸的提取纯化之前，首先要做好充分的准备工作。
精氨酸激酶（AK）的提取与纯化报告题目精氨酸激酶（ＡＫ）的提取与纯化作者姓名徐青龙班级学号1005/2010114020208指导教师汪劲松完成时间2013年10月生物学实验教学中心目录１引言 (1)1.1精氨酸激酶（AK） (1)1.2亲和层析法 (2)1.3电泳法 (2)1.4本实验主要工作 (3)2.1实验用品 (3)2.1.1实验材料 (3)2.1.1实验试剂 (3)2.1.2仪器设备 (4)2.2方法 (5)2.2.1活化菌种 (5)2.2.2 扩大培养 (5)2.2.3 IPTG诱导AK基因的表达 (5)2.2.4 蛋白质提取 (5)2.2.5蛋白质的检测 (6)2.2.6 His-tag Ni亲和层析法纯化融合蛋白 (6)3 结果与分析 (7)3.1蛋白质层析图谱 (7)3.2AK诱导表达电泳图 (8)4总结 (9)参考文献 (10)致谢 (10)精氨酸激酶（AK）的提取与纯化朱景鹏（指导老师：汪劲松）（湖北师范学院生命科学学院生物科学1005班湖北黄石435002）摘要：精氨酸激酶（ATP：N-精氨酸磷酸转移酶EC2.7.3.3）存在无脊椎动物中，是参与细胞代谢的磷酸激酶。
本实验采取含有包含AK基因的重组质粒的表达菌体E. coli Rosetta，在含有50 μg/ml 的卡纳霉素的LB 培养基中培养。
当菌体浓度A600达到0.6-0.8 时，加入异丙基硫代-β-D-半乳糖苷（IPTG）,使培养基中的IPTG终浓度为0.2 mM ,诱导培养3 小时后，从菌体中得到精氨酸激酶粗提液。
再通过Ni离子亲和层析柱分离纯化精氨酸激酶，最后通过SDS-PAGE电泳来检测精氨酸激酶的表达以及其纯化程度。
关键词：精氨酸激酶分离与纯化１引言1.1精氨酸激酶（AK）精氨酸激酶（ATP:N-精氨酸磷酸转移酶E.C.2.7.3.3）是磷酸原胍基化合物激酶的一种，主要存在于无脊椎动物体内，是细胞能量代谢中非常关键的的磷酸激酶[1]。
它的作用是催化可逆反应，将ATP上的磷酸基转移到精氨酸上，从而形成一种具有高能健的储能分子——磷酸精氨酸[3]，在无脊椎动物的能量代谢中起着重要作用。
AK在体内催化反应方程式如下：Mg2+ + ADP + Arginine phosphate Mg2+ + ATP + Arginine AK广泛颁布在许多无脊椎动物体内,目前已经研究过的生物包括：节肢动物、腹足动物、海参、头足类动物，龙虾、海葵、海湾对虾等，这些生物体内都可以分离得到AK。
虽然AK在无脊椎动物中分布十分广泛，生理功能也大致相同，但不同来源的AK在结构上表现出了非常大的多样性。
按照蛋白质的四级结构和分子量，可以划分为以下三类：1.单亚基AK，如海湾对虾中Penaeus aztecrs中提取的AK，相对分子量约为40KD，单亚基AK是目前研究最广泛的，本实验中我们所研究的AK就是单亚基，相对分子量为40KD。
2.海参Stichopusjaponicus中提取的AK为双亚基的蛋白质，相对分子质量约为84KD。
3.环节动物Sabellapavonina中的AK具有四个亚基，分子量为150-160KD。
1.2亲和层析法依赖于蛋白质和它的配体（ligand）之间的相互作用来分离的。
配体通常指的是能与另一个分子或原子结合（一般是非共价结合）的分子、基团、离子、或原子。
但在亲和层析中，配体是通过共价键先与基质结合，配体可以是酶结合的一个反应物或产物，或是一种可以识别靶蛋白的抗体。
当蛋白质混合物通过装有连接了配体的基质的亲和层析柱时，只有靶蛋白可以特异地与基质结合，而其它没有结合的蛋白质首先被洗脱下来。
特异结合在基质上的靶蛋白最后可以用含有高浓度自由配体的溶剂洗下。
所以有时只用亲和层析就可使蛋白质的纯化提高1000至10000倍。
His-tag所用层析凝胶的基质上连接了一个氨基三乙酸，可以与Ni离子结合，而Ni 离子与融合蛋白的6Xhis之间产生吸引力，从而将带有组氨酸标签的融合蛋白与其他蛋白区分开来。
加样后，用平衡液可以将杂蛋白洗脱下来，再用可溶的竞争性螯合剂洗脱可回收靶蛋白。
1.3电泳法电泳分离蛋白质是根据蛋白质在电场中的迁移的差别达到分离目的的。
蛋白质样品加到一块预先制好的凝胶介质上，只要在凝胶的两端加上电场，就可以达到分离蛋白质的目的，这样的电泳称之凝胶电泳（gel electrophoresis）。
凝胶可以是淀粉凝胶（starch gel）、琼脂糖凝胶（agarose gel）和聚丙烯酰胺凝胶（polyacrylamide gel）。
一般凝胶介质中的pH 被维持在碱性区，目的是使大多数蛋白质都带有负电荷，这样它们可以向阳极迁移。
蛋白质的迁移与蛋白质的质量和带电荷的多少有关。
聚丙烯酰胺凝胶电泳（英语：sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，简称SDS-PAGE）,其作用是用于分离蛋白质和寡核苷酸。
聚丙烯酰胺凝胶为网状结构，具有分子筛效应。
它有两种形式：非变性聚丙烯酰胺凝胶及SDS-聚丙烯酰胺凝胶（SDS-PAGE）；非变性聚丙烯酰胺凝胶，在电泳的过程中，蛋白质能够保持完整状态，并依据蛋白质的分子量大小、蛋白质的形状及其所附带的电荷量而逐渐呈梯度分开。
而SDS-PAGE仅根据蛋白质亚基分子量的不同就可以分开蛋白质。
该技术最初由Shapiro于1967年建立，他们发现在样品介质和丙烯酰胺凝胶中加入离子去污剂和强还原剂后，蛋白质亚基的电泳迁移率主要取决于亚基分子量的大小（可以忽略电荷因素）。
1.4本实验主要工作1.4.1 从大肠杆菌Rosseta中得到精氨酸激酶的粗提液1.4.2 对精氨酸激酶粗提液通过Ni亲和层析进行进一步纯化1.4.3 对所得结果通过SDS-PAGE进行检测2材料与方法2.1实验用品2.1.1材料含有重组有AK基因质粒的表达菌体E. coli Rosetta2.1.2试剂LB液体培养基（100 mL）：蛋白胨1 g，酵母提取物0.5 g，Nacl 1 g50 mg/mL 卡那霉素（kanamycin）IPTGBinding Buffer : Tris(20 mM)，Nacl(500 mM)，加Hcl调PH至8.0咪唑（10 mM、250 mM）12 %的分离胶（5 mL）:成分体积（mL）水 1.6030 %丙烯酰胺 2.001.5 M Tris (PH 8.8) 1.3010 % SDS 0.0510 % 过硫酸铵0.05TEMED 0.002浓缩胶（2 mL）成分体积（mL）水 1.4030 %丙烯酰胺0.331.0 M Tris (PH 6.8) 0.2510 % SDS 0.0210 % 过硫酸铵0.02TEMED 0.002样品缓冲液考马斯亮蓝R-2502.1.3仪器设备● YC-1型层析实验冷柜（北京博医康实验仪器司）；● CXG-1型电脑恒温层析柜（上海沪西分析仪器厂有限公司）；● TGL-16LA高速冷冻离心机（星科仪器厂有限公司）；● GL-2M型冷冻离心机（湖南星科仪器有限公司）；● 超声破壁仪；（上海之信仪器厂有限公司）● 雪山制冰机（北京长洋科学仪器公司）● 超纯水机AYJ1-0501-U（颐洋企业发展有限公司）● SDS-PAGE电泳仪● 电子天平TE412-L，TE2101-L，CP64（德国Satorins公司）● BS-1E振荡培养箱(江苏省金坛市亿通电子仪器厂)● SW-CJ-1FD单人单面净化工作台（苏州净化设备有限公司）● 3FG-01B电热恒温鼓风干燥箱● 漩涡混合器XH-C（江苏省金坛市医疗仪器厂）● 高压灭菌锅YXQ-LS-50S（上海博迅有限公司）酒精灯、培养皿、移液枪、枪头、接种环、酒精棉球、离心管、恒温水浴锅等。
2.2方法2.2.1活化菌种取工程菌种50 µL装有6 mL的LB液体培养基的试管（含有6 µL卡那青霉素，其工作浓度为50 µg/mL）中。
于37℃摇床振荡培养8-12小时。
2.2.2 扩大培养将试管中活化的6 mL菌液接种到300 mL LB培养基，同时加入300 µL卡那青霉素（终浓度50 µg/mL）培养基于37℃恒温培养箱中培养2-3小时。
2.2.3 IPTG诱导AK基因的表达实验中在不同的培养时间（用OD值表征菌体密度）加入IPTG诱导表达发现，当OD=0.6-0.8时,加IPTG 150 μL至终浓度为0.2 mM时AK的表达量达到最大。
2.2.4 蛋白质提取（1）将上述各管于4℃，5000 r/m离心10 min；（2）弃上清，加入蒸馏水使沉淀物质重悬，再于4℃，6000 r/m离心10 min；（3）弃上清，使沉淀物质重悬，每1 g沉淀加5 mL裂解液使其重悬；（4）在冰上进行10 min,超声3 s，间隔为2 s的超声波破壁, 反复破壁直到沉淀变得澄清为止；（5）于4℃，12000 r/m，离心15 min，取上清，得到AK的粗提液；2.2.5蛋白质的检测SDS-PAGE电泳检验：1）安装双垂直板电泳槽；2）配12%的分离胶5 mL，浓缩胶3 mL；3) 制样：取样品10 µL加样品缓冲液以40 µL混合，100℃加热5 min ，15000×g，4℃离心1 min；4）上样：用微量注射器加样15-20 µL ；5）电泳：在浓缩胶上加60 V/cm电压，待染料进入分离胶后将电压提高到140 V/cm继续电泳直到染料到达底部；6）固定和染色：用考马斯亮蓝R-250染色液浸泡，加热几分钟；7）脱色：半小时更换一次脱色液，处理3-5次，直到胶板呈现淡蓝色。
2.2.6 His-tag Ni亲和层析法纯化融合蛋白Ni柱预处理：(1)用2 M盐酸胍10 mL与树脂打散混合洗涤，静置10 min；(2)用蒸馏水洗10 min；Stripping Buffer洗20 min；(3)用蒸馏水洗10 min；用0.3 M NaOH洗20 min；(4)用Binding Buffer洗20 min；蒸馏水洗10 min；(5)用1.5 M NaCl洗20 min；用Binding Buffer洗20 min；蒸馏水洗10 min;(6)Ni柱再生：→50 mL 0.1 M NiSO4洗蒸馏水洗(7)6倍柱床体积Binding Buffer（pH=8.0）平衡注：流速控制在2-3 mL/min。
平衡：用Binding Buffer平衡Ni柱。
上样：插A280滤光片，调A=0值、T=100值；打开采集器；打开电脑蛋白核酸检测系统，保存文档并按开始采集。
