精氨酸激酶的表达及纯化

农业经济精氨酸激酶(arginine kinase,AK)是无脊椎动物体内存在一种重要的酶，参与机体的能量代谢、体内离子交换、环境抗逆性和免疫相关等多种生理活动[1-2]，在动物体内发挥着重要作用。

长期以来，人们对精氨酸激酶的研究更集中于昆虫生理生化方面，随着对其研究的不断深入，精氨酸激酶在人类食品安全方面有着密切关系[3]。

水产品是人类重要的食物资源，但每年有大量因水产品食物中毒引发的病患，严重的会导致过敏性休克甚至死亡，严重危及普通消费者的人身健康[3]。

研究发现精氨酸激酶是多种水产品和昆虫食物中导致食物过敏的主要变应原物质之一，因此对精氨酸激酶的进一步研究对水产行业的健康发展起着重要的推动作用，也有利于消费者的身体健康。

1精氨酸激酶的性质精氨酸激酶在不同生物体内的存在形式略有不同，其不同亚基的相对分子量也有所差异，但都能催化精氨酸和三磷酸腺苷的可逆反应[4]。

由于广泛参与机体的能量代谢活动，精氨酸激酶在动物肌肉中表达量较多，特别是在甲壳类动物中分布较广，研究发现精氨酸激酶也是中国人摄食虾蟹类较为常见的过敏原，绝大部分水产品中精氨酸激酶均可导致食物过敏的发生[5]，此外，在蟑螂、蚕蛹等昆虫中该过敏原的研究也较多[1-2]。

2精氨酸激酶蛋白的高效制备及结构分析高效制备精氨酸激酶蛋白分子是开展其免疫学分析的重要前提，目前已有多种方法获得了精氨酸激酶并鉴定了其免疫活性。

陈婷[6]等从刀额新对虾中提取制备了精氨酸激酶，并通过大白兔免疫和利用Q Sep-harose TM-XL强阴离子交换色谱获得了多抗，成功鉴定了其免疫活性。

此外，研究人员利用分子克隆与重组表达技术分别制备了来源于刀额新对虾[7]、凡纳滨对虾[8]、锯缘青蟹[9]、德国小蠊[10]、东亚飞蝗[11]等的精氨酸激酶。

通过对精氨酸激酶相关结构的研究，可以确定其产生免疫作用的表位位点，为定点修饰和消除过敏原性提供了依据。

沈海旺[12]等通过分析甲壳类动物精氨酸激酶的结构特性，确定其含有10个抗原表位位点。

精氨酸激酶（AK）的提取与纯化报告题目精氨酸激酶（ＡＫ）的提取与纯化作者姓名徐青龙班级学号1005/2010114020208指导教师汪劲松完成时间2013年10月生物学实验教学中心目录１引言 (1)1.1精氨酸激酶（AK） (1)1.2亲和层析法 (2)1.3电泳法 (2)1.4本实验主要工作 (3)2.1实验用品 (3)2.1.1实验材料 (3)2.1.1实验试剂 (3)2.1.2仪器设备 (4)2.2方法 (5)2.2.1活化菌种 (5)2.2.2 扩大培养 (5)2.2.3 IPTG诱导AK基因的表达 (5)2.2.4 蛋白质提取 (5)2.2.5蛋白质的检测 (6)2.2.6 His-tag Ni亲和层析法纯化融合蛋白 (6)3 结果与分析 (7)3.1蛋白质层析图谱 (7)3.2AK诱导表达电泳图 (8)4总结 (9)参考文献 (10)致谢 (10)精氨酸激酶（AK）的提取与纯化朱景鹏（指导老师：汪劲松）（湖北师范学院生命科学学院生物科学1005班湖北黄石435002）摘要：精氨酸激酶（ATP：N-精氨酸磷酸转移酶EC2.7.3.3）存在无脊椎动物中，是参与细胞代谢的磷酸激酶。

本实验采取含有包含AK基因的重组质粒的表达菌体E. coli Rosetta，在含有50 μg/ml 的卡纳霉素的LB 培养基中培养。

当菌体浓度A600达到0.6-0.8 时，加入异丙基硫代-β-D-半乳糖苷（IPTG）,使培养基中的IPTG终浓度为0.2 mM ,诱导培养3 小时后，从菌体中得到精氨酸激酶粗提液。

再通过Ni离子亲和层析柱分离纯化精氨酸激酶，最后通过SDS-PAGE电泳来检测精氨酸激酶的表达以及其纯化程度。

关键词：精氨酸激酶分离与纯化１引言1.1精氨酸激酶（AK）精氨酸激酶（ATP:N-精氨酸磷酸转移酶E.C.2.7.3.3）是磷酸原胍基化合物激酶的一种，主要存在于无脊椎动物体内，是细胞能量代谢中非常关键的的磷酸激酶[1]。

表２ 两种提 取 方法 黄苓提 取 结晶物 的最低 抑 茵 浓度 ＭＩ Ｃ 比 较
１ ． ５抑 菌作用 比较方法 将 实验 用 肠 炎沙 门氏菌接 种 于ＭＨ肉汤 中 ，体 积 约为 ３ ｍＬ，在 ３ ７ ￣ Ｃ 环境 下培养 ｌ ８ ｈ ，并将菌液稀释 到浊度 １ ０ ５ Ｃ Ｆ Ｕ ／ ｍ Ｌ ，然后使用二 倍 稀释法进行提取物 的体外抑菌实验 ，每个浓度 的实验均 重复３ 次。
酸性 氨基 酸及辅 氨 酸。蝮 蛇 中的 类凝血 酶 属胰蛋 白酶 家族 ，通过 切 除血 纤维蛋 白原的凝 聚 ，起凝 血作 用 ，但在体 内因它 不会 激活凝 血 因子
ｘ Ⅲ，所 以 由其 水解 产生 的纤 维蛋 白凝 块 的侧 链 不 能交联 ， 易被 纤 维蛋 白溶 酯降解 ，导致 体 内纤 维蛋 白浓度 下 降而表现 出抗 凝 效应 。
以Ｔ Ａ ＭＥ 为底 物 ，比较不 同含 量待测 酶液条件 下 ，在 ５ ０ ０ ｎ ｍ 处 测 光密度值 并记 录。见表１ 。
表 １ 酶 活 力 测 定
１材 料与仪 器 １ ． １实验材料 药 品和试 剂 ：长白山蝮蛇 蛇毒 、Ｄ Ｅ ＡＥ ． Ｓ ｅ ｐ ｈ ａ ｄ ｅ ｘ Ａ ． ５ ０ Ｓ ＷＥ Ｄ Ｅ Ｎ
＜０ ． ０ ５ ，表 １ ）。
传统 的黄芩苷提取 方法 为水煮法 ，但水煮法 的提 取时间 比较长 ， 而 且提取率 比较 低。因此 ，为 了提 高黄芩苷的提 取率 ，笔者采 用最新 的超声提 取法 和传统 的水煮法进 行对 比分 析 ３ ］ 。研究结 果显示 ，超 声 法 提取黄芩 的抑 菌效果 明显优 于水煮法提取 的黄芩 ，超声法提 取黄芩 结晶物的抑菌效果明显优于水 煮法提取 的黄芩。 综上 所述 ，黄芩具 有 良好 的抑 菌作用 ，并且 使用超声法进 行有效

四、操作步骤
（一）酶液的制备
（二）凝胶层析
1. 凝胶溶胀 根据柱床体积称取一定量 Sephadex G-100 干胶，加入蒸馏水，沸水煮沸2个小时，使之充分溶胀。
2. 装柱 用充分溶胀的Sephadex G-100装柱，装柱前，先 在柱中加入一定量的层析柱平衡液，然后倒入凝胶，打开 柱底部的出口，使其自然沉降,保持柱顶部缓冲液1-2 cm 高。
蛋白质含量及酶活力测定
蛋白质含量测定可采用紫外法或考马斯亮蓝法。 酶活力测定：取3 ml 测活反应液于比色杯中，加入30 l酶液， 立即混匀并测定575 nm处的吸光值，计时，当吸收值达到1.4时 停止测定，并记录所需时间，以每秒575 nm处每变化0.001为一 个酶活力单位，如反应开始时A575为2.0，反应60秒后，A575为 1.4，则酶活力为
恒流泵电源
记录仪
层析柜
思考题
• 1. 影响蛋白质分离效果的因素有哪些? • 2. 获得理想纯化结果应注意哪些关键步骤？ • 3. 蛋白峰的高低和和宽窄与纯化结果有关系？ • 4. 如何确定目的蛋白？ • 5. 如何评价蛋白质纯度？ • 6. 为什么蛋白质纯化过程中每一步都要测定蛋白
质 含量和活性？
精氨酸激酶的提取、 分离、纯化及活力测定
凝胶过滤分离纯化蛋白质
• 实验目的 • 实验原理 • 实验材料、仪器和试剂 • 实验操作步骤 • 仪器使用 • 思考题
一、目的
学习和掌握蛋白质的提取、凝胶层析分离 纯化精氨酸激酶的原理和操作技术，并学习目的 蛋白质的确定方法。
二、原理
凝胶过滤(Gel Fitration Chromatography，GFC) 又称分子筛层析、分子排阻层析、凝胶色谱。基本原理是 混合物中各组分通过层析柱时按其分子大小不同而被分离 的技术。固定相（凝胶）是一种不带电荷的具有三维空间 的多空网状结构的物质，分子量大的蛋白质不能渗入凝胶 颗粒内部，流程短，先被洗脱下来，而分子量小的蛋白质 可可以进入凝胶网孔，流程长，后被洗脱下来，从而达到 分离的目的。

第一章引言１．１　精氨酸激酶　精氨酸激酶(Arginine kinase，AK)(E.C.2.7.3.3)是一种磷酸原胍基化合物的激酶。

它的作用是催化如下可逆反应：将ATP上的磷酸基团转移到精氨酸上，从而形成一种具有高能键的储能分子――磷酸精氨酸。

反应方程式如下：精氨酸＋ATP・磷酸精氨酸＋ADP・Mg + H+AK被发现已经超过70年的历史了, 它属于磷酸原（胍基化合物）激酶这个大家族中的一员。

现在已经在许多种无脊椎动物中发现了AK, 例如有鳌节肢动物(chelicerate arthropod) Limulus polyphemus[1], 腹足动物(gastropod) Cellana grata 和Aplysia kurodai [2]，海参Stichopus japonicus[3]，头足类动物Nautilus pompilius[4]，龙虾(lobster) Homarus vulgaris[5]，海葵（sea anemone）Anthopleura japonicus[6]，海湾对虾（gulf shrimp）penaeus aztecus[7]等无脊椎动物中都已经分离得到了AK。

尽管说基本功能都是催化同样的高能磷酸键转移反应，但是从不同的无脊椎动物体内得到的AK的结构和分子量大小却存在着很大的差异。

这些不同的精氨酸激酶结构和大小有以下类别：（1）单亚基，如海湾对虾（gulf shrimp）penaeus aztecus 的AK[7]，是一种相对分子量约为40 kDa的单亚基的蛋白质。

单亚基的AK是目前研究最多的一种AK。

本论文中用到的AK就是单亚基，相对分子量约为40 kDa。

（2）双亚基，如海参Stichopus japonicus中分离得到的AK就是一种相对分子量约为84 kDa的双亚基蛋白质[3]。

（3）四个亚基，如环节动物（annelid）Sabella pavonina中具有相对分子量在150～160 kDa之间的四亚基AK[8]。

图8 融合蛋白经 PH6.0-7.5,25℃ 处理后的聚丙烯酰胺凝胶电泳图
结果分析 实验结果表明： 1. 通过图1至图5可知，精氨酸激酶N末端 和C末端结构域基因已经位于pET-28a 载体质粒上，等待测序结果，载体的 构建工作已经基本完成。 2. 通过图6测序结果可知，精氨酸激酶N 端结构域载体已确定构建完成。 3. 通过图7至图8可知，虽然获得了N端结 构域，但是浓度较低，需要进一步摸 索条件，以获得浓度较高的N端结构域。 C端结构域载体构建工作还未完成。
1.3 研究意义
蛋白质折叠问题的研究具有重要的生物学意义: 一是可以大大加快对蛋白质空间结构的认识；二是能对恢 复无活性蛋白质的活性起到很好的指导作用；三是能指导 新药物、新蛋白的研制；四是能帮助认识相关疾病的治病 机理，并为寻找有效的治病方法提供理论指导。 精氨酸激酶的折叠机制还尚未完全阐明，本课题通过对精 氨酸激酶两个结构域的折叠机制进行研究，进一步阐明精 氨酸激酶的整个折叠过程，有利于更深刻地掌握精氨酸激 酶结构、性质以及功能之间的相互关系，对了解一般蛋白 质折叠机制具有重要的借鉴意义。
From Genfa Zhou
AK的N端结构域与C端结构域在折叠的过程中的相互 关系到目前还没有明确的论述，两个结构域在各自折 叠时折叠的先后顺序，有无相互作用，以及作用的机 制，是本文的研究目标。
1.2 蛋白质内含子简介 1.2 Ssp DnaB 蛋白质内含子简介
蛋白质内含子(intein)是一类具有自我剪切功能的 多肽，它能将自身从前体蛋白中切出并催化其两 侧的肽链之间形成肽键。 Ssp DnaB是一种小型蛋白质内含子。近年来越来 越多地被应用于多肽融合标签技术以获取小肽药 物（如 人脑纳素、抗病毒多肽、抗肿瘤多肽）。 该方法成本低、效率高，无需采用蛋白水解酶或 化学水解试剂就可得到传统方法难以获得的小型 蛋白质或多肽。

精氨酸激酶（AK）的提取与纯化报告题目精氨酸激酶（ＡＫ）的提取与纯化作者姓名陈蕾班级学号0902/2009114010223指导教师汪劲松完成时间2012年2月生物学实验教学中心目录１引言 11.1精氨酸激酶（AK） 11.2亲和层析法 21.3电泳法 22.1材料 22.1.1实验材料与试剂 22.1.2仪器设备 32.2方法 32.2.1活化菌种 32.2.2 扩大培养 42.2.3 IPTG诱导AK基因的表达 42.2.4 蛋白质提取 42.2.5蛋白质的检测 42.2.6 His-tag Ni亲和层析法纯化融合蛋白 53 结果与分析 63.1蛋白质层析图谱 63.2 AK诱导表达电泳图 74总结 7参考文献 8致谢 8精氨酸激酶（AK）的提取与纯化陈蕾（指导老师：汪劲松）（湖北师范学院生命科学学院生物科学0902班湖北黄石435002）摘要：精氨酸激酶（ATP：N-精氨酸磷酸转移酶EC2.7.3.3）存在无脊椎动物中，是参与细胞代谢的磷酸激酶。

重组有AK 基因的E. coli Rosetta ，在含有50 μg/ml 的卡纳霉素的LB 培养基中培养。

当A600 达到 0.6-0.8 时，用终浓度为0.2 mM 的异丙基硫代-β-D-半乳糖苷（IPTG）诱导培养3 小时。

加裂解液后用超声破壁离心取上清，得到精氨酸激酶粗提液。

通过Ni离子亲和层析柱分离纯化精氨酸激酶，最后通过SDS-PAGE电泳来检测精氨酸激酶的表达以及其纯化程度。

关键词：精氨酸激酶分离与纯化１引言1.1精氨酸激酶（AK）精氨酸激酶（AK）是一种磷酸原激酶，磷酸原是一种磷酸化的胍基化合物。

AK在体内催化如下反应：Mg2+ATP+Arg Mg2+ADP+Arginine phosphateAK广泛颁布在许多无脊椎动物体内,目前已经研究过的生物包括：节肢动物、腹足动物、海参、头足类动物，龙虾、海葵、海湾对虾等，这些生物体内都可以分离得到AK。

精氨酸激酶基因研究进展张楠;徐贝贝;王建军【摘要】磷酸原激酶(PKs)在细胞能量代谢过程中起着关键作用,其中在无脊椎动物、原生动物和细菌中普遍存在的精氨酸激酶(AKs)已成为开发新型高选择性杀虫剂的潜在靶标.本文从精氨酸激酶基因的表达及其调控、分子进化与功能以及精氨酸激酶基因在害虫防治中的应用等几个方面介绍了国内外有关精氨酸激酶基因的研究进展.%Phosphagen kinases (PKs) play key roles in cellular energy metabolism,among which arginine kinases (AKs) are widely distributed in invertebrates,protozoan,and bacteria,and have been proposed as a potential molecular target of innovative and highly-selective insecticides.This review introduced the progress in AK gene at home and abroad,including the expression of AK gene and its regulatory mechanisms,molecular evolution and function of AK gene,as well as the application of AK gene in the insect pest control.【期刊名称】《环境昆虫学报》【年(卷),期】2017(039)003【总页数】5页(P730-734)【关键词】精氨酸激酶;基因表达及其调控;分子进化与功能;害虫防治【作者】张楠;徐贝贝;王建军【作者单位】扬州大学园艺与植物保护学院,江苏扬州225009;扬州大学园艺与植物保护学院,江苏扬州225009;扬州大学园艺与植物保护学院,江苏扬州225009【正文语种】中文【中图分类】Q965;S433精氨酸激酶(Arginine Kinase，AK)属于磷酸原激酶(胍基激酶)家族。

精氨酸激酶（AK）的表达及其纯化报告题目藻精氨酸激酶（AK）的表达及其纯化作者姓名余姣班级学号0801/2008114010130指导教师汪劲松完成时间2011年5月生物学实验教学中心目录摘要........................................................................ 错误！未定义书签。

引言.. (2)1 实验材料 (2)2 实验方法 (3)2.1菌种活化 (3)2.2扩大培养 (3)2.3 IPTG诱导AK的表达 (3)2.4 AK的提取及其纯化 (3)2.5His-tag Ni亲和层析法纯化融合蛋白 (3)2.6 AK的检测SDS-PAGE电泳 (4)3 结果与分析 (4)3.1 提取物的层析谱图与分析 (5)3.2 提取物SDS-PAGE电泳图与分析 (6)总结 (6)参考资料 (7)藻精氨酸激酶（AK）的表达及其纯化余姣（指导老师：汪劲松）摘要：精氨酸激酶（AK)(E.C.2.7.3.3)是一种磷酸原胍基化合物激酶，存在无脊椎动物中。

本实验是将具有重组有AK基因的质粒的E.coli，在含有50μg/ml卡那霉素的LB液体培养基中活化和扩大培养。

当菌体密度即OD值为0.6-0.8时，用0.5μg/ml IPTG异丙基硫代- -D-半乳糖诱导lac乳糖操纵子表达AK 5h。

接着5000 r/m离心10分钟，弃上清液获得沉淀物重悬加裂解液后用超声波破壁至沉淀变得澄清，再12000 r/m离心，弃沉淀得到AK的粗提液。

采用亲和层析法（含His-tag Ni的树脂层析柱）纯化AK，最后SDS-PAGE电泳，鉴定。

关键词：精氨酸激酶亲和层析光谱分析精氨酸激酶（AK）的表达及其纯化余姣（指导老师：汪劲松）引言：蛋白质的分离纯化是对蛋白质进行研究的一项必需的和基础的工作。

目前常使用的分离纯化的方法或技术都是在了解蛋白质性质和结构特点的基础上建立的。

含配体溶液
洗下未结合的蛋白
收集目的蛋白
亲和层析过程
his- tag所用层析凝胶的基质
上连接了一个NTA （[=nitrilotriacetic acid]氮基 三乙酸），可以与Ni离子结合， 而Ni离子与融合蛋白的6Xhis 氨基酸之间产生如图的吸引力， 从而将带有his-tag组氨酸标签 的融合 蛋白与其它蛋白区分 开来。 从图中可以看到，组氨酸残基 红色五元咪唑环是蛋白与Ni离 子作用的关键。 因此带暴露的His-6的蛋白能 结合于固化Ni树脂，用适当缓 冲溶液冲洗去其他蛋白后，再 用可溶的竞争性螯合剂洗脱可 以回收靶蛋白。
白质分离的凝胶主要是聚丙烯酰胺凝胶，该凝胶是 由单体丙烯酰胺和交联剂甲叉双丙烯酰胺配制而成， 其最大的特点是凝胶的孔径可根据需要进行选择。 以聚丙烯酰胺凝胶为支持物，可进行非变性电泳和 变性电泳。
主要内容
1 透析 2 层析原理 3 凝胶过滤 4 离子交换层析 5 亲和层析 6 电泳
1透析
按照分子大
➢ 将作为固相成分的 不溶性基质，例如葡 聚糖凝胶、纤维素、 树脂等填充到柱子中， 用平衡液平衡。
➢ 然后加样品，再用 适当的溶剂洗脱。
➢ 样品中各种成分通 过柱子取决于与固相 成分的相互作用，最 后以不同速率被洗脱 出来，达到将各个成 分分离的目的。
1.2 凝胶过滤层析
凝胶层析是按照蛋 白质分子量大小进行分 离的技术，又称之凝胶 过滤、分子筛层析或排 阻层析。
带有SO3－ 或COO－基团，通常以SO3－Na＋ 或COO－H＋ 形式出现的叫做阳离子交换基；
带有N＋（C2H5）基团通常以N＋（C2H5）Cl－出现的叫做 阴离子交换基。
阳离子交换基
强酸性，聚苯乙烯树脂 弱酸性，羧甲基纤维素 弱酸性，螯合作用，聚苯乙烯树脂

Q SepharoseTM-XL强阴离子交换色谱快速纯化精氨酸激酶及其多克隆抗体的研究陈婷;吴继美;李任强【摘要】Q Sepharose TM-XL strong anion exchange chromatography was used to purify shrimp arginine ki nase from arginine kinase crude extract. After the white rabbit was immunized using arginine kinase,the hyper-immune sera was collected and Q Sepharose TM-XL strong anion exchange chromatography was again used to purify arginine kinase polyclonal antibody from these sera. The high purity and activity of arginine kinase and its polyclonal antibody purified by Q Sepharose TM-XL strong anion exchange chromatography had been proved by SDS-PAGE, Laboratory method for fast and efficiently purification of arginine kinase and its polyclonal antibody has been built,which would be helpful for arginine kinase study and food allergies research.%利用Q SepharoseTM-XL强阴离子交换色谱从虾的精氨酸激酶粗提液中纯化出精氨酸激酶,以其免疫大白兔,然后利用Q SepharoseTM-XL强阴离子交换色谱从高免疫兔血清中纯化精氨酸激酶的多克隆抗体.采用SDS-PAGE检测精氨酸激酶及其抗体的纯度,并进行了活性测定.结果表明,利用Q SepharoseTM-XL强阴离子交换色谱纯化出的精氨酸激酶及其多克隆抗体纯度高、活性强.建立了快速高效、操作方便而又适合实际应用的制备精氨酸激酶及其多克隆抗体的方法,可为精氨酸激酶及食品过敏的相关研究提供帮助.【期刊名称】《化学与生物工程》【年(卷),期】2013(030)003【总页数】5页(P67-70,81)【关键词】Q SepharoseTM-XL强阴离子交换色谱;精氨酸激酶;多克隆抗体;纯化【作者】陈婷;吴继美;李任强【作者单位】暨南大学生物工程学系,广东广州510632;暨南大学生物工程学系,广东广州510632;暨南大学生物工程学系,广东广州510632【正文语种】中文【中图分类】TQ464.7精氨酸激酶(ATP:精氨酸N-磷酸转移酶,EC 2.7.3.3.Argininekinase,AK)是磷酸原激酶家族的一员,对于调节无脊椎动物磷酸精氨酸与ATP之间能量的平衡具有重要作用[1],还与机体的病原识别、免疫反应等多种重要的生理过程密切相关[2-4]。

中国农业科学 2006,39(11):2354-2361 Scientia Agricultura Sinica收稿日期：2005-12-27；接受日期：2006-03-18基金项目：国家自然科学基金(30370805;B30080023)，国家重点基础研究发展计划“973”(2005CB121003)，浙江省自然科学基金(Y304352)作者简介：王华兵(1981-)，男，江苏洪泽人，硕士研究生，研究方向为基因工程与生物反应器。

whbwry@ 。

通讯作者徐豫松（1962-），浙江兰溪人，副教授，博士，研究方向为基因工程与生物反应器。

Tel: 0571- 86971658; E-mail: xuyusong@家蚕精氨酸激酶基因的克隆、基因结构与表达分析王华兵，徐豫松（浙江大学动物科学学院，杭州 310029）摘要：【目的】克隆家蚕精氨酸激酶基因，分析其基因结构与表达特性,为揭示无脊椎动物体内能量代谢调节规律提供重要基础。

【方法】通过分析家蚕EST、利用RACE 法和基因组文库筛选法克隆了家蚕精氨酸激酶（Bm AK,Bombyx mori arginine kinase）基因,并对其基因结构和表达特性进行了分析。

【结果】克隆了Bm AK 基因, cDNA全长为1 268bp,编码355个氨基酸，具有精氨酸激酶典型的酶活性部位氨基酸序列，酶活性中心位点氨基酸和能形成离子偶结构氨基酸；该基因由2个外显子和1个内含子组成；5′调控序列存在BRCZ、E74A、FTZ 等多个潜在转录因子结合位点，但没有TATA 盒启动子序列；该基因的表达在不同组织和不同发育时期存在明显差异。

【结论】Bm AK 具有精氨酸激酶的典型特征，Bm AK 基因表达随发育时期不同而发生变化，基因的表达可能受蜕皮激素调控。

关键词：家蚕；精氨酸激酶；基因结构；表达；转录因子cDNA Cloning, Genomic Structure and Expression ofArginine Kinase Gene from Bombyx mori (L.)WANG Hua-bing, XU Yu-song(College of Animal Sciences, Zhejiang University, Hangzhou 310029)Abstract : 【Objective 】In order to clarify regulation mechanisms of energy metabolism of invertebrates, the arginine kinase gene in the silkworm,Bombyx mori was cloned and analyzed.【Method 】Based on the information of silkworm ESTs, the full-length cDNA of arginine kinase gene was cloned using the strategy of rapid amplification of cDNA ends, and then the genomic structure of Bm AK was analyzed. Further, the expression of Bm AK was examined.【Results 】Bm AK cDNA has 1268 bp and contains an open reading frame encoding a 355 amino acid protein. Bm AK contains the active sequence, the active site and a pair of highly conserved amino acids that form an ion pair. The Bm AK gene contains only 2 exons and 1 intron. The Bm AK promoter contains no TATA box, but potential binding sites for the transcription factors in both forward and reverse orientation:BRCZ 、E74A 、FTZ, etc. The expression level of Bm AK in different stages and tissues was obviously different.【Conclusion 】Bm AK has typical character of arginine kinase. The analysis on the transcription factor binding sites and the expression pattern of Bm AK showed that the developmental expression of Bm AK gene might be under control of ecdysone.Key words : Bombyx mori ; Arginine kinase; Gene structure; Expression; Transcription element0 前言【本研究的重要意义】精氨酸激酶是无脊椎动物体内主要的磷酸原激酶，它通过催化精氨酸和ATP 之间的可逆性反应，将能量存储于磷酸精氨酸的高能磷酸键中，或将磷酸精氨酸分解产生ATP [1]。

1、详细介绍碱性磷酸酶（SOD、木瓜凝乳蛋白酶、精氨酸激酶）的提取、分离纯化方案及采用每种技术（如：如果采用阴离子交换层析，那为什么不采用阳离子交换层析呢，要解释清楚）的原因，在分离纯化过程中怎样检测纯度？一、精氨酸激酶的介绍无脊椎动物的精氨酸激酶类似于脊椎动物中的肌酸激酶，是细胞代谢中的磷酸激酶，它将Mg2+和ATP上的磷酸基转移到精氨酸上，产生磷酸精氨酸、Mg2+和ADP，是无脊椎动物体内能量代谢的关键调控酶[1]。

它不仅在对墨鱼的能量代谢过程中具有重要作用，而且在墨鱼体内的表达量也很高。

因此，对精氨酸激酶深入研究十分必要。

本实验主要对墨鱼肌肉组织的精氨酸激酶进行分离、纯化及部分酶学性质的鉴定。

对该酶的性质进行分析结果表明,精氨酸激酶的最适作用温度为55℃,当温度高于65℃时,酶活力显著下降；pH8时酶活力较高,低浓度的精氨酸对酶活力有促进作用。

二、工艺路线三、研究内容与方案1.对虾精氨酸激酶的提取、分离取10g于-20℃贮存的新鲜对虾肌肉,高速组织捣碎机2000r·min-1匀浆5min,加入40mL预冷的缓冲液A(0.1mmol·L-1Tris-HCl,10mmo l·L-1巯基乙醇,5mmol·L-1叠氮化钠,20mmo l·L-1苯甲基磺酰氟(PMSF),pH8.0),搅拌均匀,把悬液放置于预冷的离心管中,4℃,5000×g离心20min后保存上清。

＊选择使用巯基乙醇和PMSF的原因：巯基乙醇可以防止蛋白酶在分离提取过程中的氧化、PMSF是蛋白酶抑制剂，可以防止蛋白酶水解＊注意事项该步骤完成后，要对粗酶液进行酶活力的测定2.对虾精氨酸激酶的纯化1）DEAE-纤维素柱层析装柱直接取商品DEAE cellulose DE-52装柱(2.5x40cm)装柱前，先在柱中加入一定量的层析柱平衡液（约10cm高），然后倒入凝胶，打开柱底部的出口，使其自然沉降，当柱中形成明显分界面时，放入两层大小合适的滤纸片与凝胶顶部，接上恒流泵，流速选用2.5ml/min，当柱不再进一步压缩时，保持柱顶部缓冲液1-2cm高[4]。

各种层析技术的主要原理
凝胶过滤层析
交联的葡聚糖凝胶
凝胶颗粒
凝胶颗粒内部的网状结构
表1 常用凝胶分离范围
凝胶类型及规格 葡聚糖凝胶 （ sephadex)
聚丙烯酰胺凝胶 (Bio-Gel ) 琼脂糖凝胶
（Sepharose）
G-200 G-100 G-50
G-25 P-300 P-150 2B 4B 6B
六、仪器使用
组装蛋白质 纯化系统
整
2
体
蛋
白
质
纯
化
1
3
系
统
4 1：自动馏分收集器 2：梯度混合仪 3：恒流泵 4：核酸蛋白检测仪
各种层析柱
梯度混合仪
核酸蛋白检测仪
光吸收值显示
样品池
灵敏度选择
调光吸收0
调透过率100
部分收集器
当前收集管号显示
洗脱液出口 收集管
当设置键盘 收集时间显示
流速显示窗 流速调节旋钮
分离范围 6×105 1.5×105 3×104
5×103 5×105 1.5×105 1.5×105 1.5×105 1.5×105
精氨酸激酶活力测定(连续测活法)
精氨酸激酶催化精氨酸与ATP合成磷酸精氨酸 时释放出质子 。L-arginine+Mg•ATP
N-phospho-L-argine+Mg•ADP+H+ 用酸碱指示剂 (0.15 g/ml百里酚蓝和 0.025 g/ml 甲酚红) 指示溶液中质子生成的量，可表示精氨酸激 酶的活性。反应液的pH稍大于8.0时，其575 nm 处的吸光值下降（2.2~1.4范围内）与溶液中H+浓 度的增加成线性关系。 精氨酸激酶的活力用 A575/sec 表示。

式行使其生物学功能，在这一点上类似于双亚基精 氨酸激酶 4 氨基酸序列比对的结果表明：海参源双 亚基精氨酸激酶与鲎源单亚基精氨酸激酶的氨基酸 序列同源性为 ($< ，低于它与代表性肌酸激酶，兔 肌肌酸激酶的氨基酸序列同源性 （ =’< ） 4 O.P.@, 等
%""$&"’&%’ 收稿，%""$&"(&%$ 收修改稿 " 清华大学“九八五”学科建设基金资助 " " 通讯作者，)&*+,-：-,./01 23+- 4 35,678.+4 9:. 4 ;6
酸 " 为了揭示海参源精氨酸激酶的催化机理，研究 其与单亚基精氨酸激酶及肌 酸 激 酶 催 化 机 理 的 异 同，我们对海参源精氨酸激酶及其底物复合物进行 了结晶和结晶学的初步研究 "
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结果和讨论
结晶 经过一周左右的时间，悬滴中发现有片状晶体，
! 材料与方法
!"! 材料 精氨酸激酶的基因是在海参肌肉细胞中克隆得 到的，在大肠杆菌 #$%& （ ’(!） 中表达 " 其分离纯化 方法见文献 ［)］ " !"# 晶体生长 采用 悬 滴 气 相 扩 散 法 进 行 晶 体 生 长 " 悬 滴 由 !! $蛋白溶液与 !! $ 池液混合而成，悬挂在硅化玻 璃片上 " 蛋白溶液中精氨酸激酶的浓度为 &* + , $， 另 外 还 含 有 * " % --./ , $ 0+12% ， % --./ , $ 1’3， &* --./ , $精氨酸 " 池液中的沉淀剂使用质量体积比 为 %45 的 聚 乙 二 醇（ 3(6 ）4***， 缓 冲 体 系 为 * " & --./ , $ 789:;<=/， >< ) " & " 晶体生长温度控制在 &?@ 左右 " !"$ % 射线衍射实验 精氨酸激酶复合物晶体 A 射线衍射实验是在美

Abstract In vertebrate, arginine kinase is a phosphotransferase that plays a critical role in energy metabolism, its functional analog in vertebrate is creatine kinase. Crustacean is one of the important groups in arthropoda for its economic values and cult ivated worldwide. The arginine kinase obtained from crustacean is a mono subunit enzyme was carefully characterized to a great extent. In this article, the protein sequence characterization, the molecular conformation, the specific tissue expressions that mediate unique biological functions and the relationship between structure and function of crustacean arginine kinase were reviewed. Meanwhile, the significance and existent problems of the related studies would also be discussed. Key words arginine kinase; crustacean; structure; funct ion

锯缘青蟹精氨酸激酶的分离纯化、分子克隆及过敏原性研究食物过敏是人类常见的一种免疫性疾病,随着社会进步和全球化进程的不断发展,食物过敏的发病率越来越高,成为全球关注的食品安全问题。

食物过敏主要由食物中蛋白质引起,主要症状有哮喘、荨麻疹等,严重的甚至会危及到生命。

水产品是最常见的过敏食物,水产食品中原肌球蛋白、小清蛋白等作为主要过敏原已得到国内外学者的广泛研究,而对于精氨酸激酶(Arginine Kinase,AK)是否为过敏原,其理化特性及致敏性如何,仍有待于进一步的研究证实。

锯缘青蟹(Scylla serrata)肉质鲜美,营养丰富,是我国蟹类增养殖的重要对象,深受我国消费者喜爱,同时其远销日本、东南亚等国家,也是全球的主要经济蟹类。

本研究以国内产量丰富的锯缘青蟹为研究对象,从分离纯化、抗体制备、分子克隆、原核表达、过敏原性等方面对精氨酸激酶进行了研究。

首先采用70-90 %硫酸铵沉淀及HiTrap Q亲和层析方法,从锯缘青蟹肌浆蛋白中分离得到分子量为40 kDa的天然蛋白(nAK),SDS-PAGE(Sodium Dodecyl Sulfate-Polyacrylamide Gel Electrophoresis,SDS-PAGE)及2D-PAGE(Two dimensional-PAGE,2D-PAGE)分析结果显示该蛋白的分子量为40 kDa、等电点为6.5,这与虾类精氨酸激酶Pen m 2性质相近。

兔抗白虾精氨酸激酶IgG抗体及兔抗锯缘青蟹精氨酸激酶IgG抗体的Western-blot结果表明纯化的锯缘青蟹40kDa蛋白为精氨酸激酶。

通过分子生物学技术方法,克隆得到锯缘青蟹精氨酸激酶开放阅读框基因序列。

测序结果显示,该开放阅读框基因的序列长度为1071 bp,编码356个氨基酸残基,该序列登录Genbank(GQ:851626)。

序列比对结果显示,锯缘青蟹精氨酸激酶基因与凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)精氨酸激酶基因的序列同源性高达94 %,与岸蟹(Carcinus maenas)、中华绒鳌蟹(Eriocheir sinensis)等甲壳类动物的精氨酸激酶也有较高的同源性(均&gt;90 %)。