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农业经济精氨酸激酶(arginine kinase,AK)是无脊椎动物体内存在一种重要的酶，参与机体的能量代谢、体内离子交换、环境抗逆性和免疫相关等多种生理活动[1-2]，在动物体内发挥着重要作用。
长期以来，人们对精氨酸激酶的研究更集中于昆虫生理生化方面，随着对其研究的不断深入，精氨酸激酶在人类食品安全方面有着密切关系[3]。
水产品是人类重要的食物资源，但每年有大量因水产品食物中毒引发的病患，严重的会导致过敏性休克甚至死亡，严重危及普通消费者的人身健康[3]。
研究发现精氨酸激酶是多种水产品和昆虫食物中导致食物过敏的主要变应原物质之一，因此对精氨酸激酶的进一步研究对水产行业的健康发展起着重要的推动作用，也有利于消费者的身体健康。
1精氨酸激酶的性质精氨酸激酶在不同生物体内的存在形式略有不同，其不同亚基的相对分子量也有所差异，但都能催化精氨酸和三磷酸腺苷的可逆反应[4]。
由于广泛参与机体的能量代谢活动，精氨酸激酶在动物肌肉中表达量较多，特别是在甲壳类动物中分布较广，研究发现精氨酸激酶也是中国人摄食虾蟹类较为常见的过敏原，绝大部分水产品中精氨酸激酶均可导致食物过敏的发生[5]，此外，在蟑螂、蚕蛹等昆虫中该过敏原的研究也较多[1-2]。
2精氨酸激酶蛋白的高效制备及结构分析高效制备精氨酸激酶蛋白分子是开展其免疫学分析的重要前提，目前已有多种方法获得了精氨酸激酶并鉴定了其免疫活性。
陈婷[6]等从刀额新对虾中提取制备了精氨酸激酶，并通过大白兔免疫和利用Q Sep-harose TM-XL强阴离子交换色谱获得了多抗，成功鉴定了其免疫活性。
此外，研究人员利用分子克隆与重组表达技术分别制备了来源于刀额新对虾[7]、凡纳滨对虾[8]、锯缘青蟹[9]、德国小蠊[10]、东亚飞蝗[11]等的精氨酸激酶。
通过对精氨酸激酶相关结构的研究，可以确定其产生免疫作用的表位位点，为定点修饰和消除过敏原性提供了依据。
沈海旺[12]等通过分析甲壳类动物精氨酸激酶的结构特性，确定其含有10个抗原表位位点。
精氨酸激酶（AK）的提取与纯化报告题目精氨酸激酶（ＡＫ）的提取与纯化作者姓名徐青龙班级学号1005/2010114020208指导教师汪劲松完成时间2013年10月生物学实验教学中心目录１引言 (1)1.1精氨酸激酶（AK） (1)1.2亲和层析法 (2)1.3电泳法 (2)1.4本实验主要工作 (3)2.1实验用品 (3)2.1.1实验材料 (3)2.1.1实验试剂 (3)2.1.2仪器设备 (4)2.2方法 (5)2.2.1活化菌种 (5)2.2.2 扩大培养 (5)2.2.3 IPTG诱导AK基因的表达 (5)2.2.4 蛋白质提取 (5)2.2.5蛋白质的检测 (6)2.2.6 His-tag Ni亲和层析法纯化融合蛋白 (6)3 结果与分析 (7)3.1蛋白质层析图谱 (7)3.2AK诱导表达电泳图 (8)4总结 (9)参考文献 (10)致谢 (10)精氨酸激酶（AK）的提取与纯化朱景鹏（指导老师：汪劲松）（湖北师范学院生命科学学院生物科学1005班湖北黄石435002）摘要：精氨酸激酶（ATP：N-精氨酸磷酸转移酶EC2.7.3.3）存在无脊椎动物中，是参与细胞代谢的磷酸激酶。
本实验采取含有包含AK基因的重组质粒的表达菌体E. coli Rosetta，在含有50 μg/ml 的卡纳霉素的LB 培养基中培养。
当菌体浓度A600达到0.6-0.8 时，加入异丙基硫代-β-D-半乳糖苷（IPTG）,使培养基中的IPTG终浓度为0.2 mM ,诱导培养3 小时后，从菌体中得到精氨酸激酶粗提液。
再通过Ni离子亲和层析柱分离纯化精氨酸激酶，最后通过SDS-PAGE电泳来检测精氨酸激酶的表达以及其纯化程度。
关键词：精氨酸激酶分离与纯化１引言1.1精氨酸激酶（AK）精氨酸激酶（ATP:N-精氨酸磷酸转移酶E.C.2.7.3.3）是磷酸原胍基化合物激酶的一种，主要存在于无脊椎动物体内，是细胞能量代谢中非常关键的的磷酸激酶[1]。
![精氨酸激酶的折叠及其部分结构的研究_1[1].1精氨酸激酶_11_15](https://img.taocdn.com/s1/m/39d0317101f69e31433294dd.png)
第一章引言１．１ 精氨酸激酶 精氨酸激酶(Arginine kinase，AK)(E.C.2.7.3.3)是一种磷酸原胍基化合物的激酶。
它的作用是催化如下可逆反应：将ATP上的磷酸基团转移到精氨酸上，从而形成一种具有高能键的储能分子――磷酸精氨酸。
反应方程式如下：精氨酸＋ATP・磷酸精氨酸＋ADP・Mg + H+AK被发现已经超过70年的历史了, 它属于磷酸原（胍基化合物）激酶这个大家族中的一员。
现在已经在许多种无脊椎动物中发现了AK, 例如有鳌节肢动物(chelicerate arthropod) Limulus polyphemus[1], 腹足动物(gastropod) Cellana grata 和Aplysia kurodai [2]，海参Stichopus japonicus[3]，头足类动物Nautilus pompilius[4]，龙虾(lobster) Homarus vulgaris[5]，海葵（sea anemone）Anthopleura japonicus[6]，海湾对虾（gulf shrimp）penaeus aztecus[7]等无脊椎动物中都已经分离得到了AK。
尽管说基本功能都是催化同样的高能磷酸键转移反应，但是从不同的无脊椎动物体内得到的AK的结构和分子量大小却存在着很大的差异。
这些不同的精氨酸激酶结构和大小有以下类别：（1）单亚基，如海湾对虾（gulf shrimp）penaeus aztecus 的AK[7]，是一种相对分子量约为40 kDa的单亚基的蛋白质。
单亚基的AK是目前研究最多的一种AK。
本论文中用到的AK就是单亚基，相对分子量约为40 kDa。
（2）双亚基，如海参Stichopus japonicus中分离得到的AK就是一种相对分子量约为84 kDa的双亚基蛋白质[3]。
（3）四个亚基，如环节动物（annelid）Sabella pavonina中具有相对分子量在150～160 kDa之间的四亚基AK[8]。
精氨酸激酶（AK）的提取与纯化报告题目精氨酸激酶（ＡＫ）的提取与纯化作者姓名陈蕾班级学号0902/2009114010223指导教师汪劲松完成时间2012年2月生物学实验教学中心目录１引言 11.1精氨酸激酶（AK） 11.2亲和层析法 21.3电泳法 22.1材料 22.1.1实验材料与试剂 22.1.2仪器设备 32.2方法 32.2.1活化菌种 32.2.2 扩大培养 42.2.3 IPTG诱导AK基因的表达 42.2.4 蛋白质提取 42.2.5蛋白质的检测 42.2.6 His-tag Ni亲和层析法纯化融合蛋白 53 结果与分析 63.1蛋白质层析图谱 63.2 AK诱导表达电泳图 74总结 7参考文献 8致谢 8精氨酸激酶（AK）的提取与纯化陈蕾（指导老师：汪劲松）（湖北师范学院生命科学学院生物科学0902班湖北黄石435002）摘要：精氨酸激酶（ATP：N-精氨酸磷酸转移酶EC2.7.3.3）存在无脊椎动物中，是参与细胞代谢的磷酸激酶。
重组有AK 基因的E. coli Rosetta ，在含有50 μg/ml 的卡纳霉素的LB 培养基中培养。
当A600 达到 0.6-0.8 时，用终浓度为0.2 mM 的异丙基硫代-β-D-半乳糖苷（IPTG）诱导培养3 小时。
加裂解液后用超声破壁离心取上清，得到精氨酸激酶粗提液。
通过Ni离子亲和层析柱分离纯化精氨酸激酶，最后通过SDS-PAGE电泳来检测精氨酸激酶的表达以及其纯化程度。
关键词：精氨酸激酶分离与纯化１引言1.1精氨酸激酶（AK）精氨酸激酶（AK）是一种磷酸原激酶，磷酸原是一种磷酸化的胍基化合物。
AK在体内催化如下反应：Mg2+ATP+Arg Mg2+ADP+Arginine phosphateAK广泛颁布在许多无脊椎动物体内,目前已经研究过的生物包括：节肢动物、腹足动物、海参、头足类动物，龙虾、海葵、海湾对虾等，这些生物体内都可以分离得到AK。
精氨酸激酶基因研究进展张楠;徐贝贝;王建军【摘要】磷酸原激酶(PKs)在细胞能量代谢过程中起着关键作用,其中在无脊椎动物、原生动物和细菌中普遍存在的精氨酸激酶(AKs)已成为开发新型高选择性杀虫剂的潜在靶标.本文从精氨酸激酶基因的表达及其调控、分子进化与功能以及精氨酸激酶基因在害虫防治中的应用等几个方面介绍了国内外有关精氨酸激酶基因的研究进展.%Phosphagen kinases (PKs) play key roles in cellular energy metabolism,among which arginine kinases (AKs) are widely distributed in invertebrates,protozoan,and bacteria,and have been proposed as a potential molecular target of innovative and highly-selective insecticides.This review introduced the progress in AK gene at home and abroad,including the expression of AK gene and its regulatory mechanisms,molecular evolution and function of AK gene,as well as the application of AK gene in the insect pest control.【期刊名称】《环境昆虫学报》【年(卷),期】2017(039)003【总页数】5页(P730-734)【关键词】精氨酸激酶;基因表达及其调控;分子进化与功能;害虫防治【作者】张楠;徐贝贝;王建军【作者单位】扬州大学园艺与植物保护学院,江苏扬州225009;扬州大学园艺与植物保护学院,江苏扬州225009;扬州大学园艺与植物保护学院,江苏扬州225009【正文语种】中文【中图分类】Q965;S433精氨酸激酶(Arginine Kinase，AK)属于磷酸原激酶(胍基激酶)家族。
精氨酸激酶（AK）的表达及其纯化报告题目藻精氨酸激酶（AK）的表达及其纯化作者姓名余姣班级学号0801/2008114010130指导教师汪劲松完成时间2011年5月生物学实验教学中心目录摘要........................................................................ 错误！未定义书签。
引言.. (2)1 实验材料 (2)2 实验方法 (3)2.1菌种活化 (3)2.2扩大培养 (3)2.3 IPTG诱导AK的表达 (3)2.4 AK的提取及其纯化 (3)2.5His-tag Ni亲和层析法纯化融合蛋白 (3)2.6 AK的检测SDS-PAGE电泳 (4)3 结果与分析 (4)3.1 提取物的层析谱图与分析 (5)3.2 提取物SDS-PAGE电泳图与分析 (6)总结 (6)参考资料 (7)藻精氨酸激酶（AK）的表达及其纯化余姣（指导老师：汪劲松）摘要：精氨酸激酶（AK)(E.C.2.7.3.3)是一种磷酸原胍基化合物激酶，存在无脊椎动物中。
本实验是将具有重组有AK基因的质粒的E.coli，在含有50μg/ml卡那霉素的LB液体培养基中活化和扩大培养。
当菌体密度即OD值为0.6-0.8时，用0.5μg/ml IPTG异丙基硫代- -D-半乳糖诱导lac乳糖操纵子表达AK 5h。
接着5000 r/m离心10分钟，弃上清液获得沉淀物重悬加裂解液后用超声波破壁至沉淀变得澄清，再12000 r/m离心，弃沉淀得到AK的粗提液。
采用亲和层析法（含His-tag Ni的树脂层析柱）纯化AK，最后SDS-PAGE电泳，鉴定。
关键词：精氨酸激酶亲和层析光谱分析精氨酸激酶（AK）的表达及其纯化余姣（指导老师：汪劲松）引言：蛋白质的分离纯化是对蛋白质进行研究的一项必需的和基础的工作。
目前常使用的分离纯化的方法或技术都是在了解蛋白质性质和结构特点的基础上建立的。
精氨酸激酶（AK）的表达及其纯化生物学实验教学中心目录引言 (4)1实验材料、试剂、仪器 (7)2 实验方法 (9)2.1配制LB液体培养基 (9)2.2 活化菌种 (9)2.3 扩大培养 (9)2.4 IPTG诱导AK的表达 (9)2.5蛋白质提取 (9)2.6 His-tag Ni亲和层析法纯化融合蛋白 (10)2.7 上样和洗脱 (10)2.8 SDS-PAGE电泳鉴定纯化程度 (10)3 结果与分析 (11)3.1层析谱图 (11)3.2 SDS-PAGE电泳带型分析 (12)总结 (13)参考文献 (14)精氨酸激酶（AK）的表达及其纯化指导老师：摘要：精氨酸激酶（ATP：N-精氨酸磷酸转移酶EC2.7.3.3）存在无脊椎动物中，是参与细胞代谢的磷酸激酶。
重组有AK基因的E. coli Rosetta，在含有50 μg/ml的卡纳霉素的LB培养基中培养。
当A600达到0.6-0.8时，用终浓度为0.2 mM的异丙基硫代-β-D-半乳糖苷（IPTG）诱导培养3小时。
加裂解液后用超声破壁离心取上清，得到精氨酸激酶粗提液。
通过CM-Cellulose阳离子交换层析，SephacrylTM-100凝胶过滤层析，Q-Sepharose阴离子交换层析分离纯化得到电泳纯的精氨酸激酶。
关键词：精氨酸激酶表达与纯化Expression and Purification of Arginine KinaseAbstract：Arginine kinase（ATP：L-arginine phosphotransferase EC 2.7.3.3），plays an important role in cellular energy metabolism in invertebrate. E. coli Rosetta which2contains recombinant AK gene was grown in LB medium containing kanamycin (Final concentration: 25 μg/m L). When absorbance at 600 nm value was between 0.6 with 0.8, isopropyl β-D-thiogalactopyranoside was added to 0.2 mM and the incubation was continued an addition 3 h. The cell was broken and centrifugated, then the crude cell extract was harvested. Furthermore it was purified by following three methods in turn: CM-Cellulose positive ion exchange chromatography, Sephacryl TM-100gel filtrate chromatography, and Q-Sepharose anion exchange chromatography. A purified AK was found to be homogenous by SDS poly -acrylaminde gel electrophoresis.Key words: arginine kinase expression and purification精氨酸激酶（AK）的表达及其纯化3引言无脊椎动物的精氨酸激酶（Arginine kinase, AK）（ATP:N-精氨酸磷酸转移酶E.C.2.7.3.3）类似于脊椎动物中的肌酸激酶（creatine kinase ，CK）（ATP:N-肌酸磷酸转移酶E.C.2.7.3.3），是细胞代谢中的磷酸激酶，它将Mg2+ATP上的磷酸基转移到精氨酸上，产生磷酸精氨酸和Mg2+ADP，在无脊椎动物的能量代谢中起着重要作用。
AK 在体内催化反应方程式如下：Mg2+ATP+Arg Mg2+ADP+Arginine phosphateAK广泛颁布在许多无脊椎动物体内,目前已经研究过的生物包括：节肢动物、腹足动物、海参、头足类动物，龙虾、海葵、海湾对虾等，这些生物体内都可以分离得到AK。
虽然AK在无脊椎动物中分布十分广泛，生理功能也大致相同，但不同来源的AK 在结构上表现出了非常大的多样性。
按照蛋白质的四级结构和分子量，可以划分为以下三类：1.单亚基AK，如海湾对虾中Penaeus aztecrs中提取的AK，相对分子量约为40KD，单亚基AK是目前研究最广泛的，本实验中我们所研究的AK就是单亚基，相对分子量为40KD。
2.海参Stichopusjaponicus中提取的AK为双亚基的蛋白质，相对分子质量约为84KD。
3.环节动物Sabellapavonina中的AK具有四个亚基，分子量为150-160KD。
某些物种的精氨酸激酶的晶体结构已经被解析出来，AK是由一个小的α螺旋组成的N端结构域和一个大的C端结构域组成的，C端结构域与Glu合成酶的C端结构域相似，8股串起来的反平行β折叠被7个α螺旋所包绕[2]。
过渡态类似物的结合部位不在两个结构域之间，而是在C端结构域的内部[3]。
如下图所示[4]：4图1. 结合有过渡态类似物的AK的晶体结构我们已经克隆有精氨酸激酶基因的菌株，宿主菌含表达质粒pET28a, pET28a含：强启动子序列，两个lac操纵序列；精氨酸激酶基因，核糖体结合位点，多克隆位点，复制起点。
在工程菌株中，导入抗Kana青霉素的pET28a质粒，菌株中原有质粒产生阻遏蛋白，这种阻遏蛋白与pET28a的LacO操纵基因结合，阻止外源基因的表达。
当加入IPTG诱导时，IPTG与阻遏蛋白结合，解除了阻遏蛋白与pET28a操纵基因结合的抑制作用，使pET28a上面的外源基因能够顺利表达[5]。
IPTG是一种乳糖类似物，我们的主要目的是诱导表达并纯化精氨酸激酶，为后续研究其在蛋白质折叠和分子伴侣中的功能做准备亲和层析法依赖于蛋白质和它的配体（ligand）之间的相互作用来分离的。
配体通常指的是能与另一个分子或原子结合（一般是非共价结合）的分子、基团、离子、或原子。
但在亲和层析中，配体是通过共价键先与基质结合，配体可以是酶结合的一个反应物或产物，或是一种可以识别靶蛋白的抗体。
当蛋白质混合物通过装有连接了配体的基质的亲和层析柱时，只有靶蛋白可以特异地与基质结合，而其它没有结合的蛋白质首先被洗脱下来。
特异结合在基质上的靶蛋白最后可以用含有高浓度自由配体的溶剂洗下。
所以有时只用亲和层析就可使蛋白质的纯5化提高1000至10000倍。
电泳电泳分离蛋白质是根据蛋白质在电场中的迁移的差别达到分离目的的。
蛋白质样品加到一块预先制好的凝胶介质上，只要在凝胶的两端加上电场，就可以达到分离蛋白质的目的，这样的电泳称之凝胶电泳（gel electrophoresis）。
凝胶可以是淀粉凝胶（starch gel）、琼脂糖凝胶（agarose gel）和聚丙烯酰胺凝胶（polyacrylamide gel）。
一般凝胶介质中的pH被维持在碱性区，目的是使大多数蛋白质都带有负电荷，这样它们可以向阳极迁移。
蛋白质的迁移与蛋白质的质量和带电荷的多少有关。
本实验我们做了以下工作：用含卡那霉素的LB液体培养基活化并扩大培养菌种，利用IPTG诱导精氨酸激酶（AK）的表达，经离心、超声波破壁获得AK粗提液。
粗提液用His-tag Ni 亲和层析纯化，用SDS-PAGE电泳鉴定纯化结果。
61实验材料、试剂、仪器1.1 材料工程菌种：E．coli工程菌株Rossta2.2 试剂LB培养基：蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，Nacl 10 g，溶于950ml水中，用NaOH 调节PH至7.0，加蒸馏水，定容总体积至1L，分装后高压蒸汽灭菌。
5×Binding Buffer : Tris(20 mM)，Nacl(500 mM)，加Hcl调PH至8.0，加蒸馏水定容至1L。
IPTG（1M）：称取2.3831gIPTG，定容到10ml无菌水。
12 %的分离胶（5 mL）:成分体积（mL）水 1.6030 %丙烯酰胺 2.001.5 M Tris (PH 8.8) 1.3010 % SDS 0.0510 % 过硫酸铵0.05TEMED 0.0027浓缩胶（2 mL）成分体积（mL）水 1.4030 %丙烯酰胺0.331.0 M Tris (PH 6.8) 0.2510 % SDS 0.0210 % 过硫酸铵0.02TEMED 0.002样品缓冲液：考马斯亮蓝R-2501.3主要实验仪器● 紫外分光光度计U－4300（Sweden/GE）● YC-1型层析实验冷柜（北京博医康实验仪器司）● CXG-1型电脑恒温层析柜（上海沪西分析仪器厂有限公司）● ORION pH计（美国orion公司）● HD-3紫外检测仪（上海沪西分析仪器厂有限公司）● TGL-16LA，GL-2M型冷冻离心机(湖南星科仪器有限公司）● GL-2M型冷冻离心机（湖南星科仪器有限公司）● 超声破壁仪（上海之信仪器厂有限公司）● 雪山制冰机（北京长洋科学仪器公司）● 超纯水机AYJ1-0501-U（颐洋企业发展有限公司）● 低温恒温槽DH-2120（上海嘉鹏科技有限公司）●电泳仪DYY-5（北京市六一仪器厂）● 电子天平TE412-L，TE2101-L，CP64（德国Satorins公司）8● BS-1E振荡培养箱(江苏省金坛市亿通电子仪器厂)● SW-CJ-1FD单人单面净化工作台（苏州净化设备有限公司）● 3FG-01B电热恒温鼓风干燥箱● 高压灭菌锅YXQ-LS-50S（上海博迅有限公司）2 实验方法2.1配制LB液体培养基称取NaCl 1 g 、蛋白胨 1 g、酵母提取物0.5 g ，加入蒸馏水，配制成100 mL 的LB液体培养基，放入高压灭菌锅中灭菌。
2.2 活化菌种取50 µL表达菌种接入6 mL的LB液体培养基（含有卡那青霉素，其工作浓度为50 µg/mL）中，于37 ℃摇床振荡培养8-12小时。
2.3 扩大培养向100 mL LB液体培养基中加入100 uL 50mg/mL卡那霉素(工作浓度为50 ug/mL)，再加入6 mL活化的菌液，于37 ℃摇床中震荡培养2—3小时。
2.4 IPTG诱导AK的表达实验中在不同的培养时间（用OD值表征菌体密度）加入IPTG诱导表达发现，当OD=0.6-0.8时，加150 μl的IPTG至终浓度为0.2 mM时AK的表达量达到最大。
