陕北苹果常见真菌病害病原菌的分离鉴定研究

文章编号：1005-0906(2010)01-0126-02一种简便的病原真菌单孢分离方法研究龚国淑，徐琴，张敏，杨继芝，陈华保，申世安，唐太飞(四川农业大学农学院，四川雅安625014)摘要：研究一种简便、实用、高效的病原真菌单孢分离法———挑针转移法，即用尖细而光滑的挑针从培养物或标样上挑取孢子，将其转移到清水琼脂块上，然后挑取分散的单个孢子转移到另一琼脂块上获得单孢。

通过对多种真菌的分离表明，该法操作简便，成功率可达90%以上。

关键词：玉米病害；病原真菌；单孢分离；挑针转移法中图分类号：S435.131文献标识码：AA Simple Method for Single Fungal Spore IsolationGONG Guo-shu,XU Qin,ZHANG M in,YANG Ji-zhi,et al.(Agricultural College of Sichuan Agricultural University,Ya’an625014,China) Abstract:This paper presented a method to isolate single fungal spore_dissect needle removing spore method. Spores were removed directly from culture or disease sample using sterilized dissect needle and placed in water agar piece.Single spore then was picked and removed to next water agar piece.Finally,water agar piece containing single spore were cultured until spore reached a clear colony.The method was simple,convenient and practical on fungi dis-ease research.The whole isolation procedure only involved in some simple instruments and success percentage could reach90to obtain single spore.Key words:M aize disease;Pathogenic fungi;Single spore isolation;Dissect needle removing spore method真菌病害研究中常会涉及到病原菌的纯培养问题，尤其在研究病原菌群体遗传特征时总会用到单孢分离技术。

真菌病害拮抗菌的筛选及其对多种植物病原真菌的拮抗活性测定汪茜;胡春锦;黄思良;柯仿钢;黎起秦【摘要】针对广西境内常见多发的12种植物真菌病害,对柑橘、香蕉、甘蔗、辣椒、药用植物等作物根际土壤进行拮抗菌筛选试验.结果从不同作物根际土壤中共分离得到386株菌株,其中有拮抗作用的34株,平皿拮抗效果较好的16株;再经复筛,得到一株对柑橘炭疽菌有较好抑制效果的拮抗菌Bs55;对峙培养试验表明,Bs55菌株对12种常见病原真菌具有较强的抗菌活性,抑菌率最高达87.7%.拮抗菌Bs55具有拮抗作用强、能大量繁殖、抑菌谱广等特点,是具有较好利用前景的生物防治材料.【期刊名称】《南方农业学报》【年(卷),期】2010(041)007【总页数】4页(P675-678)【关键词】Bs55菌株;枯草芽孢杆菌;病原真菌;拮抗活性【作者】汪茜;胡春锦;黄思良;柯仿钢;黎起秦【作者单位】广西大学农学院,南宁,530005;广西农业科学院微生物研究所,南宁,530007;广西农业科学院微生物研究所,南宁,530007;广西作物遗传改良生物技术重点开放实验室,南宁,530007;南阳师范学院生命科学与技术学院,河南南阳,473061;广西大学农学院,南宁,530005;广西大学农学院,南宁,530005【正文语种】中文【中图分类】S476+.1真菌病害是阻碍植物生长、影响作物产量的主要病害［1］，给农业生产带来了严重危害。

土壤是各种微生物良好的栖息场所，生存着许多具有相互拮抗作用的微生物。

在生防菌株的筛选上，考虑到植物与微生物之间的相互作用关系，人们把重点放在从植物根表面或根际土壤中筛选，这样筛选出的微生物接种后在植物根表面具有很好的定殖能力［2］。

本研究针对广西境内常见多发的12种植物真菌病害，从不同作物根际土壤中筛选拮抗菌，为开发广西微生物资源，筛选与环境相容性好的微生物农药奠定基础。

供试病原菌有柑橘炭疽病菌［Colletotrichum gloeosporioides （Penz.）Sacc.］、水稻纹枯病菌（Rhizoctonia solaniKühn）、玉米大斑病菌［Exserohilum turcicum （Pass.） Leonard ＆ Suggs］、玉米小斑病菌［Cochliobolus heterostrophus （Dreschl.）Dreschl.］、茉莉白绢病菌（Sclerotium rolfsiiSacc.）、辣椒炭疽病菌［Colletotrichum gloeosporioides （Penz.） Sacc.］、香蕉炭疽病菌［Colletotrichummusae（Berk.＆Curt）Arx］、冬瓜疫霉（Phytophthora drechsleriTucker）、龙眼链格孢黑斑病菌［Alternaria alternata （Fr.） Keissler］、香蕉大灰斑病菌［Curvularia lunata （Wakker）Boedijin］、香蕉叶缘枯斑病菌（Alternaria musaeBour.et Bat）、杨桃炭疽病菌［Colletotrichum gloeosporioides（Penz.） Sacc.］等12种，均由广西农业科学院微生物研究所保存、提供。

苹果树内生真菌抗腐烂病和炭疽病活性菌株的筛选邓振山;陈苗;张伟民;贺晓龙【摘要】为了明确苹果树中内生真菌的种类及其对苹果树腐烂病菌和苹果树炭疽病菌的抑制作用，对健康富士苹果树茎部和根部中的内生真菌进行了分离和初步鉴定，并采用组织块分离法和平板对峙法筛选出对苹果树腐烂病菌和炭疽病菌有明显抑制效果的拮抗菌，进一步研究了其发酵液对病原菌的抑制效果。

结果表明，从筛选出的49株内生真菌中，8株对苹果树腐烂病和炭疽病病原菌有明显抑制效果，最高抑菌率达到83.93%；拮抗菌发酵液的平均抑菌率均在89%以上，最高达98.81%。

且在同等条件下，拮抗菌对病原菌抑菌率比化学药剂高50%左右。

该研究为新型生物农药的开发和利用提供参考。

%Inordertoconfirmthespeciesofendophyticfungifromappletreebarkand theirinhibitoryeffectsagainst Valsa ceratosperma and Glomerella cingulata,endophytic fungi in Fuji healthy apple stem and root were isolated and preliminary identified,and their inhibitory effects against V. ceratosperma and G. cingulata were tested both through tissue separation and plate confrontation method. Furthermore the inhibitory effects of their fermented broth against the pathogens. The results showed that 8 endophytic fungi from 49 isolates had a significant inhibitory effect against V. ceratosperma and G. cingulata,and the highest inhibitory rate reached 83. 93%;the average inhibition rate of fermen-ted broth was more than 89%,the highest up to 98. 81%. And in the same conditions,the inhibition rates of antifun-gal activity against V. ceratosperma and G. cingulata reached by 50% higher than chemical pesticide. The study pro-vided atheoretical basis for the research and development of new plant sourcebio-pesticide.【期刊名称】《微生物学杂志》【年(卷),期】2015(000)005【总页数】6页(P61-66)【关键词】苹果树;内生真菌;苹果树腐烂病;苹果树炭疽病;拮抗活性【作者】邓振山;陈苗;张伟民;贺晓龙【作者单位】延安大学生命科学学院，陕西延安716000;延安大学生命科学学院，陕西延安 716000;延安大学生命科学学院，陕西延安 716000;延安大学生命科学学院，陕西延安 716000【正文语种】中文【中图分类】Q93-331;S432.4苹果树腐烂病和炭疽病是危害果园的两大病害。

苹果内生菌的分离纯化及发酵产物分析苹果含丰富的碳水化合物、维生素和微量元素、苹果酸、柠檬酸、水溶性膳食纤维（果胶等，在储藏过程或运条件不当的情况下易受微生物性的病害而引起腐败变质，其中酵母菌是常见的病害。

目前对苹果中酵母菌的分离、鉴定研究报道很少，本试验旨在分离和初步鉴定苹果中的酵母菌，并对其进行抑制试验研究，为研究苹果的保鲜和贮藏提供理论依据。

酵母菌分离及其抑菌试验用豆芽汁蔗糖培养基，生化鉴定试验用淀粉培养基、明胶培养基、蛋白陈水培养基、糖发酵培养基、石蕊牛奶培养基。

苹果中酵母菌的分离培养＂采用涂布平板法对样品菌悬液中酵母菌进行分离。

即将苹果菌悬液10倍级进行。

培养特征和形态特征观察：对所分离纯化菌株平板培养后进行培养特征的观察。

取典型菌落涂片，染色后进行显微镜形态观察。

生化鉴定试验：淀粉水解试验、明胶水解试验、石蕊牛乳试验、糖发酵试验、过氧化氢酶试验。

菌种初步鉴定4根据培养特征和形态特征及生化鉴定结果，对典型菌落进行初步菌种鉴定。

抑菌试验肉，取不同浓度的山梨酸和苯甲酸钠溶液，在120℃高压灭菌20min后添加于查氏培养基，然后从腐败部分体积占整体1/2的苹果中分离培养酵母菌，将分离后的酵母菌接种于添加了山梨酸及苯甲酸钠的查氏培养基上，另将酵母菌接种于未添加抑菌剂的查氏培养基作空白对照，培养24 h 后进行活菌菌落记数，计算抑菌率，研究山梨酸和苯甲酸钠对酵母菌的抑制效果。

本试验从苹果中分离到酵母菌4株，初步鉴定为酿酒酵母、出芽短梗霉、产假丝酵母、皮状丝孢酵母。

引起苹果腐败的主要酵母菌是否为此4株，还需进一步研究。

山梨酸和苯甲酸钠对本试验分离4株菌都有很好的抑制效果，其最适抑菌浓度均为0.08%，此浓度在食品安全要求范围之内。

苹果树腐烂病菌挥发性代谢产物的分离提取与致病性研究袁艮霞;李思南;秦辰;王惠;黄丽丽【摘要】为了研究苹果树腐烂病菌的致病活性物质,本研究利用MS液体培养基培养苹果树腐烂病菌,采用普通蒸馏法用乙酸乙酯作溶剂,收集其培养滤液中的挥发性代谢产物,利用气相色谱质谱联用仪(GC-MS)分离各个成分,将各组分质谱图与数据库标准物质质谱图对比,初步进行结构定性,用苹果枝条进行致病活性测定.结果表明,苹果树腐烂病菌在发酵过程中产生的2种挥发性物质的结构分别为异戊醇和2-苯乙醇,这2种物质均对苹果树枝具有致病活性.%Valsa mali was cultured in MS liquid medium to explore its pathogenic active substances.Its volatile metabolites were collected by distillation method with ethyl acetate as absorbing solvent.Volatile constituents dissolved in ethyl acetate were separated and identified by GC-MS.To confirm the structure of each component,their mass spectra were compared with those of standard substances in the database,and their bioactivities were tested on apple branches.Two substances obtained from the culture filtrate were 3-methylbutan-1-ol and 2-phenylethan-1-ol respectively.Both of these substances showed pathogenic activity against apple branches.【期刊名称】《西北林学院学报》【年(卷),期】2018(033)001【总页数】5页(P211-215)【关键词】苹果树腐烂病菌;挥发性代谢产物;致病性;GC-MS【作者】袁艮霞;李思南;秦辰;王惠;黄丽丽【作者单位】西北农林科技大学理学院,陕西杨陵712100;西北农林科技大学植物保护学院,陕西杨陵712100;西北农林科技大学农学院,陕西杨陵712100;西北农林科技大学理学院,陕西杨陵712100;西北农林科技大学植物保护学院,陕西杨陵712100【正文语种】中文【中图分类】S436.611随着苹果种植面积的不断扩大，苹果树腐烂病日趋严重，已经严重影响到我国苹果产业的进一步发展。

㊀核农学报㊀２０２２，３６（１１）：２１５８ ２１６５ＪｏｕｒｎａｌｏｆＮｕｃｌｅａｒＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ收稿日期：２０２１⁃１２⁃０８㊀接受日期：２０２２⁃０３⁃０１基金项目：国家自然科学基金－新疆联合基金（Ｕ１９０３２０６），国家自然科学基金（３１４７１７３２），陕西省重大专项（２０２０ｚｄｚｘ０３０３－０１）作者简介：王帅乐，男，主要从事植物病理学研究㊂Ｅ⁃ｍａｉｌ：６３１３４２７６０＠ｑｑ．ｃｏｍ∗通讯作者：黄丽丽，女，教授，主要从事小麦㊁果树病害的病原学和综合防治研究㊂Ｅ⁃ｍａｉｌ：ｈｕａｎｇｌｉｌｉ＠ｎｗｓｕａｆ．ｅｄｕ．ｃｎ文章编号：１０００⁃８５５１（２０２２）１１⁃２１５８⁃０８苹果短链脱氢酶基因ＭｄＳＤＲ响应腐烂病菌侵染的功能研究王帅乐㊀肖珂雨㊀王维东㊀黄丽丽∗（西北农林科技大学旱区作物逆境生物学国家重点实验室／植物保护学院，陕西杨凌㊀７１２１００）摘㊀要：短链脱氢／还原酶（ＳＤＲ）是一类ＮＡＤ（Ｐ）（Ｈ）依赖的氧化还原酶，负责催化生物体内各种代谢活动的氧化还原步骤㊂为了探究苹果（Ｍａｌｕｓｄｏｍｅｓｔｉｃａ）ＳＤＲ（ＭｄＳＤＲ）蛋白的功能，利用农杆菌介导的苹果组培苗瞬时转化技术在苹果叶片中瞬时表达ＭｄＳＤＲ，然后通过刺伤接种法研究过表达ＭｄＳＤＲ对叶片抗病性的影响；利用实时荧光定量ＰＣＲ（ｑＲＴ－ＰＣＲ）技术检测瞬时表达ＭｄＳＤＲ后苹果中脂肪酸生物合成相关基因的表达水平；利用气相色谱分析技术检测瞬时表达ＭｄＳＤＲ苹果叶片中的脂肪酸含量；利用尼罗红染色检测苹果叶片中的脂滴（ＬＤｓ）积累情况㊂结果表明，瞬时表达ＭｄＳＤＲ显著增强了苹果叶片对腐烂病菌（Ｖａｌｓａｍａｌｉ）的抗病性，试验组叶片病斑直径相比对照组减小约１４ ４６％（Ｐ＜０ ００１）；瞬时表达ＭｄＳＤＲ后苹果叶片中脂肪酸生物合成相关基因的表达显著上调（Ｐ＜０ ００１），其中ＭｄＡＣＣａｓｅ上调４８ ４１倍，ＭｄＫＡＲ上调１２９ ７９倍，ＭｄＥＮＲ上调１６８ ２０倍，ＭｄＨＡＤ上调８ ６７倍，ＭｄβＣＴ㊁ＭｄＫＡＳⅠ和ＭｄＫＡＳⅡ均上调约５倍；然而过表达ＭｄＳＤＲ后苹果叶片中脂肪酸的积累水平无显著变化（Ｐ＞０ ０５）；进一步研究发现，过表达ＭｄＳＤＲ后苹果叶片中调控脂滴合成的基因ＭｄＳＥＩＰＩＮ显著上调表达（Ｐ＜０ ０５），脂滴数量大量增加㊂本研究初步证明ＭｄＳＤＲ能够通过促进脂肪酸的合成，间接提高脂滴的数量，从而提高苹果的抗病性，为苹果抗性品种的研究提供了一定的理论基础㊂关键词：短链脱氢／还原酶（ＳＤＲ）；脂肪酸；脂滴；抗病性ＤＯＩ：１０ １１８６９／ｊ．ｉｓｓｎ．１００⁃８５５１ ２０２２ １１ ２１５８㊀㊀短链脱氢／还原酶（ｓｈｏｒｔ⁃ｃｈａｉｎｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅｓ／ｒｅｄｕｃｔａｓｅ，ＳＤＲ）是一类ＮＡＤ（Ｐ）（Ｈ）依赖的氧化还原酶，负责催化生物体内的氧化还原反应［１－３］㊂ＳＤＲ在高等植物中分布广泛［４］，主要参与生物碱㊁萜类㊁酚类物质和激素等多种次级代谢途径，增强了植物对细菌㊁真菌㊁病毒㊁动物和昆虫等生物胁迫以及非生物胁迫的适应能力，并且在植物传粉㊁种子传播和种间竞争中发挥重要作用［１，５－８］㊂同时，ＳＤＲ也参与多种初级代谢，维持植物正常的生长发育㊂例如，在叶绿素的合成途径中，ＳＤＲ家族的原叶绿体氧化还原酶（ｐｒｏｔｏｃｈｌｏｒｏｐｙｌｌｉｄｅｏｘｉｄｏｒｅｄｕｃｔａｓｅ，ＰＯＲ）能将原叶绿素转化为叶绿素［９－１０］；在脂肪酸合成途径中，ＳＤＲ家族的β－酮脂酰－ＡＣＰ还原酶（β－ｋｅｔｏａｃｙｌ⁃ＡＣＰｒｅｄｕｃｔａｓｅ，ＫＡＲ）和烯脂酰－ＡＣＰ还原酶（ｅｎｏｙｌ⁃ＡＣＰｒｅｄｕｃｔａｓｅ，ＥＮＲ）能催化还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（ｒｅｄｕｃｅｄｎｉｃｏｔｉｎａｍｉｄｅａｄｅｎｉｎｅｄｉｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｐｈｏｓｐｈａｔｅ，ＮＡＤＰＨ）和还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（ｒｅｄｕｃｅｄｎｉｃｏｔｉｎａｍｉｄｅａｄｅｎｉｎｅｄｉｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ，ＮＡＤＨ）依赖的两个还原步骤，是植物脂肪酸生物合成的两种关键酶［１１－１２］㊂脂肪酸是细胞膜㊁栓质和角质蜡的关键成分，为植物抵御环境胁迫提供了物理屏障［１３－１４］㊂植物能通过改变不饱和脂肪酸的含量来调节膜的流动性，从而维持适合关键整合蛋白（ｉｎｔｅｇｒａｌｐｒｏｔｅｉｎ）发挥功能的环境［１５－１６］㊂例如，在高温胁迫环境下，野生型烟草叶绿体中的光合蛋白出现热变性和光合效率下降㊂而三元脂肪酸（ｔｒｉｅｎｏｉｃｆａｔｔｙａｃｉｄｓ，ＴＡｓ）表达被抑制的转基因植株中，未检测到光合蛋白热变性，其光合效率降幅较小［１７］㊂另外，脂肪酸也参与病原胁迫响应㊂研究发８５１２㊀１１期苹果短链脱氢酶基因ＭｄＳＤＲ响应腐烂病菌侵染的功能研究现，游离亚麻酸既是一种胁迫信号分子，也是植物氧化脂质（如茉莉酸）生物合成的前体［１８－１９］㊂许多研究也证明，叶绿体油酸（ｏｌｅｉｃａｃｉｄ，ＯＡ）和壬二酸（ａｚｅｌａｉｃａｃｉｄ，ＡＺＡ）水平对拟南芥的生物胁迫响应至关重要，可以引发细胞程序性死亡（ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄｃｅｌｌｄｅａｔｈ，ＰＣＤ）和激发系统获得性抗性（ｓｙｓｔｅｍｉｃａｃｑｕｉｒｅｄｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ，ＳＡＲ）［２０－２１］㊂另外，植物叶片中脂肪酸的积累能刺激植物脂滴（ｌｉｐｉｄｄｒｏｐｌｅｔｓ，ＬＤｓ）的产生㊂而脂滴在植物胁迫应答㊁激素信号途径和植物生长发育中起重要作用［２２－２３］㊂例如，脂滴表面的油体钙蛋白ｃａｌｅｏｓｉｎ和油体固醇蛋白ｓｔｅｒｏｌｅｏｓｉｎ等蛋白具有酶活性，其中ｃａｌｅｏｓｉｎ具有过氧化酶活性，可以将α－亚麻酸衍生物转化为各种氧化脂类植保素；ｓｔｅｒｏｌｅｏｓｉｎ是一种甾醇脱氢酶，可以将甾醇底物转化为油菜素类固醇（ｂｒａｓｓｉｎｏｓｔｅｒｏｉｄｓ，ＢＲｓ），从而调控生长发育和胁迫响应［２４－２５］㊂上述研究结果均表明，脂肪酸在植物抵抗生物胁迫中发挥着重要的作用㊂在苹果（Ｍａｌｕｓｄｏｍｅｓｔｉｃａ）中，目前关于ＳＤＲ基因功能的研究仍鲜有报道㊂西北农林科技大学果树病害病原生物学及综合防治团队前期以富士苹果ｃＤＮＡ为模板克隆获得ＭｄＳＤＲ基因编码区（ｃｏｄｉｎｇｓｅｑｕｅｎｃｅ，ＣＤＳ）全长序列，并通过预测发现其可能与脂肪酸的合成有关［２６］㊂为了验证ＭｄＳＤＲ蛋白是否参与脂肪酸的合成和调控植物免疫，本研究通过农杆菌介导的瞬时表达技术及实时荧光定量ＰＣＲ（ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅｒｅａｌ⁃ｔｉｍｅＰＣＲ，ｑＲＴ－ＰＣＲ）技术探究苹果ＭｄＳＤＲ对脂肪酸合成中关键基因表达的影响，揭示ＭｄＳＤＲ在脂肪酸合成中的重要作用，并利用苹果瞬时表达技术探究ＭｄＳＤＲ对苹果树腐烂病菌侵染的影响，初步研究其抗逆功能和作用机理，旨在为苹果抗性品种的研究提供一定的理论基础㊂１㊀材料与方法１ １㊀植物材料嘎啦苹果组培苗（Ｍａｌｕｓｄｏｍｅｓｔｉｃｃｖ．Ｒｏｙａｌｇａｌａ）由西北农林科技大学园艺学院李明军教授实验室惠赠㊂组织培养植株生长于ＭＳ培养基中，培养基配方为：４ ４３ｇ㊃Ｌ－１ＭＳ＋３０ｇ㊃Ｌ－１蔗糖＋８ｇ㊃Ｌ－１琼脂＋０ ３ｍｇ㊃Ｌ－１６－苄氨基嘌呤＋０ ２ｍｇ㊃Ｌ－１吲哚－３－乙酸，ｐＨ值为５ ８；组培苗置于人工智能气候箱（ＲＸＺ－５００－Ｄ⁃ＰＥＤ，宁波江南仪器厂）内培养，培养条件为：温度２５ħ，光照１６ｈ／黑暗８ｈ，光照度６４００Ｌｘ，相对湿度６０％㊂每１５ｄ更换一次培养基㊂１ ２㊀菌株和质粒载体大肠杆菌ＤＨ５α㊁农杆菌ＧＶ３１０１及载体ｐＣＡＭＢＩＡ１３０２均购自北京擎科新业生物技术有限公司；苹果腐烂病菌０３－８（Ｖａｌｓａｍａｌｉ）保存于西北农林科技大学㊂１ ３㊀植物表达载体的构建以富士苹果ｍＲＮＡ反转录合成的ｃＤＮＡ为模板，利用特异性引物ＭｄＳＤＲ－Ｆ㊁ＭｄＳＤＲ－Ｒ对ＭｄＳＤＲ基因进行ＰＣＲ扩增，采用快捷型琼脂糖凝胶ＤＮＡ回收试剂盒ＩＩ（ＤＰ１７２２，Ｂｉｏｔｅｋｅ，北京）对目的基因条带进行回收㊂将回收产物与线性化载体ｐＣＡＭＢＩＡ１３０２连接构建重组质粒ｐＣＡＭＢＩＡ１３０２－ＭｄＳＤＲ㊂热激法转化大肠杆菌ＤＨ５α，进行卡那霉素抗性筛选及菌落ＰＣＲ验证后提取质粒送至上海生工生物工程股份有限公司测序㊂将测序重组质粒及空载体（对照）分别电击转化至农杆菌ＧＶ３１０１，卡那霉素抗性筛选及菌落ＰＣＲ验证后于－８０ħ冰箱保存备用㊂１ ４㊀农杆菌介导的苹果组培苗瞬时转化用含５０μｇ㊃ｍＬ－１卡那霉素及５０μｇ㊃ｍＬ－１利福平的ＹＥＰ培养基，以２８ħ㊁２００ｒ㊃ｍｉｎ－１的条件培养含有ｐＣＡＭＢＩＡ１３０２－ＭｄＳＤＲ和ｐＣＡＭＢＩＡ１３０２表达载体的农杆菌１６ｈ，６０００ｒ㊃ｍｉｎ－１离心１０ｍｉｎ收集菌体，用０ ０１ｍｏｌ㊃Ｌ－１的ＭｇＣｌ２溶液清洗２次，最终用含１００μｍｏｌ㊃Ｌ－１乙酰丁香酮及１０μｍｏｌ㊃Ｌ－１２－吗啉乙磺酸（４－ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｅｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃａｃｉｄ，ＭＥＳ）的ＭｇＣｌ２溶液重悬菌体，使其ＯＤ６００值为１㊂挑选健康㊁长势相近的４周龄组培苗若干，使用真空渗透的方法［２６］对其进行瞬时转化，转化后的组培苗培养条件与１ １中的组培条件相同㊂１ ５㊀苹果总ＲＮＡ提取及ｃＤＮＡ的合成组培苗瞬时表达４８ｈ后随机选取叶片样品进行苹果总ＲＮＡ的提取，提取方法参照快速通用植物ＲＮＡ提取试剂盒说明书（０４１６－５０ｇｋ，北京华越洋生物有限公司），提取完成后对其浓度进行测定，于－８０ħ冰箱保存备用㊂ｃＤＮＡ的合成参照ＨｉｇｈＣａｐａｃｉｔｙｃＤＮＡ反转录试剂盒说明书（４３６８８１３，ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，美国）进行，反转录产物于－８０ħ冰箱保存备用㊂１ ６㊀实时荧光定量ＰＣＲ分析在ＮＣＢＩ数据库中找到ＭｄβＣＴ㊁ＭｄＡＣＣａｓｅ㊁ＭｄＫＡＲ㊁ＭｄＫＡＳⅠ㊁ＭｄＫＡＳⅡ㊁ＭｄＨＡＤ㊁ＭｄＥＮＲ等与苹果脂肪酸合成相关的基因序列以及与植物脂滴调控相关基因ＭｄＳＥＩＰＩＮ［２７－２８］，并以ＭｄＥＦ－１α为内参基因［２９］㊂使用Ｐｒｉｍｉｅｒ５软件对上述基因进行引物设计（表１）㊂９５１２核㊀农㊀学㊀报３６卷表１㊀引物序列Ｔａｂｌｅ１㊀Ｐｒｉｍｅｒｓｅｑｕｅｎｃｅｓ引物名称Ｐｒｉｍｅｒｎａｍｅ引物序列（５ᶄң３ᶄ）Ｐｒｉｍｅｒｓｅｑｕｅｎｃｅ（５ᶄң３ᶄ）产物大小Ｐｒｏｄｕｃｔｓｉｚｅ／ｂｐＭｄβＣＴ－ＦＡＴＡＴＣＡＴＴＡＴＴＧＣＣＧＡＡＣＣＣＡＡ９１ＭｄβＣＴ－ＲＴＴＴＴＣＧＴＡＡＡＡＴＣＴＣＧＣＣＴＡＣＴＭｄＡＣＣａｓｅ－ＦＧＡＣＣＡＴＧＡＣＣＣＡＴＣＡＡＡＧＴＴＡＡ１５１ＭｄＡＣＣａｓｅ－ＲＣＴＣＣＡＧＡＡＧＣＡＧＧＴＧＡＡＡＧＡＡＧＭｄＫＡＲ－ＦＴＧＧＴＴＧＣＡＧＧＧＴＣＣＴＴＧＴＴ８０ＭｄＫＡＲ－ＲＣＡＣＣＧＡＡＴＧＣＣＴＣＡＡＴＣＴＣＭｄＫＡＳⅠ－ＦＡＴＣＧＴＧＡＴＧＧＴＴＴＣＧＴＴＡＴＧＧＧ９１ＭｄＫＡＳⅠ－ＲＧＣＡＡＴＴＡＴＣＧＧＴＧＣＴＣＣＴＣＴＴＴＭｄＫＡＳⅡ－ＦＣＴＴＡＴＧＣＴＣＴＧＴＧＧＴＧＧＴＴＣＡ１３６ＭｄＫＡＳⅡ－ＲＡＧＣＣＡＴＣＡＣＧＡＴＴＡＣＴＡＴＣＣＣＭｄＥＮＲ－ＦＣＡＡＡＴＧＧＡＣＣＧＧＡＧＧＴＴＧ１１３ＭｄＥＮＲ－ＲＴＧＧＧＡＧＧＡＡＡＴＧＣＴＴＧＡＧＴＡＭｄＨＡＤ－ＦＡＡＡＴＧＣＴＣＣＣＴＣＣＣＧＡＡＴＣ９１ＭｄＨＡＤ－ＲＧＧＴＴＧＡＧＴＴＣＣＴＣＣＴＣＴＴＡＧＴＴＭｄＳＥＩＰＩＮ－ＦＣＴＣＧＧＡＧＴＣＴＴＴＣＡＧＧＴＣＡＧＧ１１２ＭｄＳＥＩＰＩＮ－ＲＡＴＡＧＡＡＧＧＣＧＧＡＴＡＧＧＣＴＣＡＣＭｄＥＦ－１α－ＦＡＴＴＣＡＡＧＴＡＴＧＣＣＴＧＧＧＴＧＣ１８９ＭｄＥＦ－１α－ＲＣＡＧＴＣＡＧＣＣＴＧＴＧＡＴＧＴＴＣＣ㊀㊀利用ＰＣＲ技术检测上述引物的特异性，ＰＣＲ反应体系为２０μＬ：１０μＬ２ˑＴａｑＭａｓｔｅｒＭｉｘ㊁上下游引物各０ ５μＬ㊁１μＬｃＤＮＡ㊁８μＬｄｄＨ２Ｏ㊂反应程序：９５ħ预变性５ｍｉｎ；９５ħ变性３０ｓ，５５ħ退火３０ｓ，７２ħ延伸３０ｓ，３０个循环㊂基因相对表达水平测定：按照２ˑＳＹＢＲ ＧｒｅｅｎＰＣＲＭａｓｔｅｒＭｉｘ（Ａ３１１－１０，北京康润诚业生物科技有限公司）说明书配制ｑＲＴ－ＰＣＲ反应体系，每个样品设３个重复㊂ｑＲＴ－ＰＣＲ反应体系为２０μＬ：１０μＬ２ˑＲｅａｌＳｔａｒＧｒｅｅｎＰｏｗｅｒＭｉｘｔｕｒｅ㊁１０μｍｏｌ㊃Ｌ－１正反向引物各０ ５μＬ㊁１ ５μＬｃＤＮＡ㊁７ ５μＬｄｄＨ２Ｏ㊂使用罗氏ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ９６实时荧光定量ＰＣＲ仪，反应程序：９５ħ预变性５ｍｉｎ；９５ħ变性１０ｓ，５８ħ退火３０ｓ，７２ħ延伸３０ｓ，４５个循环；熔解反应程序为：９５ħ１０ｓ，６５ħ６０ｓ，９７ħ１ｓ㊂１ ７㊀真菌活化与侵染试验将苹果腐烂病菌（Ｖ．ｍａｌｉ）在马铃薯葡萄糖琼脂（ｐｏｔａｔｏｄｅｘｔｒｏｓｅａｇａｒ，ＰＤＡ）培养基上活化，于２５ħ条件下培养３ｄ㊂组培苗瞬时转化４８ｈ后取叶片刺伤接种Ｖ．ｍａｌｉ㊂将叶柄插入水琼脂中保湿，２５ħ共培养３６ｈ左右，拍照并用ＩｍａｇｅＪ软件计算病斑直径，重复３次㊂使用ＧｒａｐｈＰａｄＰｒｉｓｍ９作图并用ＳＰＳＳ２６ ０进行ｔ测验分析㊂为了减少试验误差，每次重复使用至少３０个叶片，取自长势相似的组培苗㊂１ ８㊀苹果叶片脂肪酸含量的测定组培苗瞬时表达４８ｈ后取叶片样品，液氮速冻后用干冰保存运输，送至西安迈维代谢生物科技有限公司进行脂肪酸含量及种类的测定㊂处理组与对照组各做３次重复，使用ＧｒａｐｈＰａｄＰｒｉｓｍ９作图并用ＳＰＳＳ２６ ０进行ｔ测验分析㊂１ ９㊀苹果叶片中脂滴的染色观察尼罗红（ＨＹ⁃Ｄ０７１８，ＭｅｄＣｈｅｍＥｘｐｒｅｓｓ，美国）在缓冲液中稀释至２００ｍｍｏｌ㊃Ｌ－１，ｐＨ值为７㊂将组培苗瞬时表达４８ｈ后取叶片样品，在尼罗红染液中３７ħ避光孵育５ １０ｍｉｎ，洗去染色液后制片㊂用ＦＶ３０００激光共聚焦扫描显微镜（奥林巴斯，日本）观察，由４８８ｎｍ激发，在５００ ５４０ｎｍ光谱下收集信号㊂２㊀结果与分析２ １㊀苹果叶片抗病性检测为了探究ＭｄＳＤＲ蛋白在植物抗生物胁迫中的作用，在苹果组培苗叶片中瞬时表达ＭｄＳＤＲ基因后接种Ｖ．ｍａｌｉ，检测病斑变化情况㊂结果显示，过表达ＭｄＳＤＲ的苹果叶片的病斑明显小于对照（图１－Ａ）㊂平均病斑直径统计结果显示，过表达ＭｄＳＤＲ的苹果叶片的病斑直径显著小于（Ｐ＜０ ００１）对照（约１４ ４６％）（图１－Ｂ），表明过表达ＭｄＳＤＲ提高了苹果叶片对Ｖ．ｍａｌｉ的抗病性㊂注：Ａ：Ｖ．ｍａｉｌ．侵染苹果叶片３６ｈ后的叶片表型；Ｂ：Ｖ．ｍａｉｌ．侵染苹果叶片３６ｈ后的平均病斑直径㊂∗∗∗表示在Ｐ＜０ ００１水平差异显著㊂Ｎｏｔｅ：Ａ：ＲｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｖｅｄｉｓｅａｓｅｓｙｍｐｔｏｍｓｏｆｔｈｅａｐｐｌｅｌｅａｖｅｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇＭｄＳＤＲａｔ３６ｈｏｕｒｓｐｏｓｔ⁃ｉｎｏｃｕｌａｔｉｏｎ（ｈｐｉ）ｏｆＶ．ｍａｌｉ．Ｂ：ＴｈｅａｖｅｒａｇｅｌｅｓｉｏｎｄｉａｍｅｔｅｒｏｆａｐｐｌｅｌｅａｖｅｓｉｎｗｈｉｃｈＭｄＳＤＲｉｓｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｗａｓｅｖａｌｕａｔｅｄａｔ３６ｈｐｉｏｆＶ．ｍａｌｉ．∗∗∗ｉｎｄｉｃａｔｅｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅａｔ０ ００１ｌｅｖｅｌ．图１㊀瞬时表达ＭｄＳＤＲ抑制Ｖ．ｍａｌｉ的侵染Ｆｉｇ．１㊀ＯｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＭｄＳＤＲｉｎｈｉｂｉｔｓｔｈｅｉｎｆｅｃｔｉｏｎｏｆＶ．ｍａｌｉ２ ２㊀脂肪酸合成相关关键基因的表达水平检测为了探究ＭｄＳＤＲ对植物脂肪酸合成的影响，对脂０６１２㊀１１期苹果短链脱氢酶基因ＭｄＳＤＲ响应腐烂病菌侵染的功能研究肪酸合成通路关键酶编码基因的表达水平进行了检测㊂与对照相比，瞬时过表达ＭｄＳＤＲ苹果叶片中脂肪酸从头合成通路中的相关基因全部显著上调表达，其中ＭｄＡＣＣａｓｅ㊁ＭｄＫＡＲ和ＭｄＥＮＲ上调幅度较大，ＭｄＡＣＣａｓｅ上调４８ ４１倍，ＭｄＫＡＲ上调１２９ ７９倍，ＭｄＥＮＲ上调１６８ ２０倍㊂ＭｄβＣＴ㊁ＭｄＫＡＳⅠ㊁ＭｄＫＡＳⅡ和ＭｄＨＡＤ均呈现出上调表达的趋势，其中ＭｄβＣＴ㊁ＭｄＫＡＳⅠ和ＭｄＫＡＳⅡ均上调约５倍，ＭｄＨＡＤ上调８ ６７倍（图２）㊂上述结果表明，ＭｄＳＤＲ蛋白参与调控脂肪酸的生物合成㊂注：∗∗∗表示在Ｐ＜０ ００１水平差异显著；∗∗∗∗表示在Ｐ＜０ ０００１水平差异显著㊂Ｎｏｔｅ：∗∗∗ｉｎｄｉｃａｔｅｓｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅａｔ０ ００１ｌｅｖｅｌ．∗∗∗∗ｉｎｄｉｃａｔｅｓｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅａｔ０ ０００１ｌｅｖｅｌ．图２㊀ＭｄＳＤＲ㊁ＭｄＡＣＣａｓｅ㊁ＭｄＫＡＲ㊁ＭｄＥＮＲ㊁ＭｄβＣＴ㊁ＭｄＫＡＳⅠ㊁ＭｄＫＡＳⅡ和ＭｄＨＡＤ相对表达量Ｆｉｇ．２㊀ＲｅｌａｔｉｖｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＭｄＳＤＲ㊁ＭｄＡＣＣａｓｅ㊁ＭｄＫＡＲ㊁ＭｄＥＮＲ㊁ＭｄβＣＴ㊁ＭｄＫＡＳⅠ㊁ＭｄＫＡＳⅡａｎｄＭｄＨＡＤ２ ３㊀苹果叶片脂肪酸含量测定为了探究过表达ＭｄＳＤＲ对植物叶片中脂肪酸积累水平的影响，对苹果叶片中的脂肪酸含量进行了测定㊂通过对试验组与对照组数据进行差异显著性分析，发现过表达ＭｄＳＤＲ的苹果叶片中各种脂肪酸含量未发生显著变化（Ｐ＞０ ０５）（图３）㊂２ ４㊀脂滴合成关键基因的表达水平检测为了验证上述推测，过表达ＭｄＳＤＲ后检测了调控脂滴形成的关键基因ＭｄＳＥＩＰＩＮ的表达水平变化㊂结果显示，瞬时表达ＭｄＳＤＲ后，苹果叶片中ＭｄＳＥＩＰＩＮ基因的表达水平显著提高（图４－Ａ）（Ｐ＜０ ０５），表明瞬时表达ＭｄＳＤＲ促进了脂滴的生物合成㊂ＷｅｓｔｅｒｎＢｌｏｔ结果显示，在瞬时表达ＭｄＳＤＲ基因的苹果组培苗叶片中检测到ＭｄＳＤＲ蛋白（图４－Ｂ），表明通过农杆菌介导瞬时表达技术，ＭｄＳＤＲ蛋白在苹果组培苗叶片中成功表达㊂２ ５㊀苹果叶片中脂滴的染色观察本研究采用尼罗红染色［３０］观察瞬时表达ＭｄＳＤＲ图３㊀脂肪酸相对含量Ｆｉｇ．３㊀Ｒｅｌａｔｉｖｅｃｏｎｔｅｎｔｏｆｆａｔｔｙａｃｉｄ的苹果叶片样品，结果显示，瞬时表达ＭｄＳＤＲ后的苹果叶片出现大量的点状绿色荧光（图５－Ａ），而在对照中并未发现有大量的点状绿色荧光（图５－Ｂ）㊂本试验过表达的ＭｄＳＤＲ蛋白上融合有ＧＦＰ标签，因此为了排除ＧＦＰ荧光给试验带来的干扰，单独表达了ＭｄＳＤＲ⁃ＧＦＰ１６１２核㊀农㊀学㊀报３６卷注：Ａ：ＭｄＳＥＩＰＩＮ相对表达水平；Ｂ：ＭｄＳＤＲ蛋白表达检测㊂∗表示在Ｐ＜０ ０５水平差异显著㊂Ｎｏｔｅ：Ａ：ＲｅｌａｔｉｖｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＭｄＳＥＩＰＩＮ．Ｂ：ＷｅｓｔｅｒｎＢｌｏｔｏｆＭｄＳＤＲ．∗ｉｎｄｉｃａｔｅｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅａｔ０ ０５ｌｅｖｅｌ．图４㊀ＭｄＳＥＩＰＩＮ相对表达量与ＭｄＳＤＲ蛋白表达检测Ｆｉｇ．４㊀ＲｅｌａｔｉｖｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＭｄＳＥＩＰＩＮａｎｄｄｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆＭｄＳＤＲｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ注：脂滴被尼罗红染色后激发出的荧光呈点分布㊂Ａ：瞬时表达ＭｄＳＤＲ⁃ＧＦＰ后用尼罗红染色的苹果叶片；Ｂ：瞬时表达ＧＦＰ后用尼罗红染色的苹果叶片；Ｃ：瞬时表达ＭｄＳＤＲ⁃ＧＦＰ后未染色的苹㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀果叶片；Ｄ：瞬时表达ＧＦＰ后未染色的苹果叶片㊂Ｎｏｔｅ：ＴｈｅｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅｅｘｃｉｔｅｄｂｙｌｉｐｉｄｄｒｏｐｌｅｔｓｓｔａｉｎｅｄｗｉｔｈＮｉｌｅｒｅｄｓｈｏｗｓａｄｏｔｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ．Ａ：ＡｐｐｌｅｌｅａｖｅｓｓｔａｉｎｅｄｗｉｔｈＮｉｌｅＲｅｄａｆｔｅｒｔｒａｎｓｉｅｎｔｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＭｄＳＤＲ－ＧＦＰ．Ｂ：ＡｐｐｌｅｌｅａｖｅｓｓｔａｉｎｅｄｗｉｔｈＮｉｌｅＲｅｄａｆｔｅｒｔｒａｎｓｉｅｎｔｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＧＦＰ．Ｃ：ＵｎｓｔａｉｎｅｄａｐｐｌｅｌｅａｖｅｓａｆｔｅｒｔｒａｎｓｉｅｎｔｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＭｄＳＤＲ－ＧＦＰ．Ｄ：Ｕｎｓｔａｉｎｅｄａｐｐｌｅｌｅａｖｅｓ㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀ａｆｔｅｒｔｒａｎｓｉｅｎｔｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＧＦＰ．图５㊀ＭｄＳＤＲ瞬时表达增加苹果叶片中脂滴数量Ｆｉｇ．５㊀ＭｄＳＤＲｔｒａｎｓｉｅｎｔｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｉｎｃｒｅａｓｅｓｔｈｅｎｕｍｂｅｒｏｆＬＤｓｉｎａｐｐｌｅｌｅａｖｅｓ和ＧＦＰ，观察并未发现点状绿色荧光（图５－Ｃ㊁Ｄ）㊂综上所述，瞬时表达ＭｄＳＤＲ促进了脂滴的形成㊂３㊀讨论短链脱氢／还原酶不仅可以参与调控植物初级代谢，如脂肪酸生物合成㊁叶绿素生物合成或降解，还可以参与调控植物的次级代谢，如萜类㊁类固醇㊁酚类和生物碱的生物合成［３１］㊂在脂肪酸生物合成的过程中，乙酰ＣｏＡ的羧化反应是脂肪酸合成通路的限速步骤，故乙酰ＣｏＡ羧化酶（ａｃｅｔｙｌＣｏＡｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ，ＡＣＣａｓｅ）活性控制着脂肪酸的合成速度；在脂肪酸链延伸阶段中，β－酮脂酰⁃ＡＣＰ合酶（β－ｋｅｔｏａｃｙｌ⁃ＡＣＰｓｙｎｔｈａｓｅⅡ，ＫＡＳ）能催化第一步的缩合反应；同时，β－酮脂酰⁃ＡＣＰ还原酶（β⁃ｋｅｔｏａｃｙｌ⁃ＡＣＰｒｅｄｕｃｔａｓｅ，ＫＡＲ）和烯脂酰⁃ＡＣＰ还原酶（ｅｎｏｙｌ⁃ＡＣＰｒｅｄｕｃｔａｓｅ，ＥＮＲ）负责催化其中两步还原反应，即在还原型辅酶ＩＩＮＡＤＰＨ的协助下，ＫＡＲ催化β－酮丁酰基的β－位羰基还原为羟基，ＥＮＲ催化ә２－烯丁酰基的α－双键还原为单键；而β－羟脂酰－ＡＣＰ脱水酶（β⁃ｈｙｄｒｄｏｘｙａｃｙｌ⁃ＡＣＰｄｅｈｙｄｒａｓｅ，ＨＡＤ）则负责催化β－羟丁酰基α㊁β－碳原子间的脱水反应［３２］㊂本研究发现瞬时过表达ＭｄＳＤＲ后，苹果中乙酰ＣｏＡ羧化酶（ＭｄＡＣＣａｓｅ）基因㊁β－酮脂酰－ＡＣＰ合酶（ＭｄＫＡＳ）基因㊁β－酮脂酰－ＡＣＰ还原酶（ＭｄＫＡＲ）基因㊁烯脂酰－ＡＣＰ还原酶（ＭｄＥＮＲ）基因的表达水平显著上调（图２）㊂上述结果表明，ＭｄＳＤＲ能参与调控植物脂肪酸的生物合成过程，这与本实验室前期预测的结果［２６］一致㊂已有研究表明脂肪酸能参与调控植物的免疫反应［１，２１］㊂例如茄子中棕榈油酸的积累提高了植物对白粉病菌的抗病性［３３］；番茄中棕榈油酸的积累增加了植物对黄萎病菌的抗病性［３４］；亚油酸和亚麻酸的积累会显著提升鳄梨对炭疽病菌（Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍｇｌｏｅｏｓｐｏｒｉｏｉｄｅｓ）和番茄对丁香假单胞菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｓｙｒｉｎｇａｅ）的抗病性［３５－３６］；根际微生物诱导植物对灰霉病菌（Ｂｏｔｒｙｔｉｓｃｉｎｅｒｅａ）的抗病性同样与植物中亚油酸和亚麻酸积累水平密切相关［３７］㊂本研究发现，过表达ＭｄＳＤＲ能够提高苹果对腐烂病菌的抗性（图１），然而苹果叶片中脂肪酸含量无显著变化（图３）（Ｐ＞０ ０５）㊂因此推测ＭｄＳＤＲ参与调控脂肪酸的生物合成，但并未通过增加脂肪酸含量来提高苹果抗性㊂脂肪酸作为初级代谢产物，是生物体内多种中性脂质生物合成的前体㊂然而过高水平的脂肪酸会对细胞造成损伤［３８］㊂因此生物体会通过多种途径将脂肪酸转化成中性脂质，例如脂肪酸能够通过多步反应，最终在ＳＥＩＰＩＮ蛋白调控下形成了成熟的脂滴［２８，３０］，保２６１２㊀１１期苹果短链脱氢酶基因ＭｄＳＤＲ响应腐烂病菌侵染的功能研究持了细胞内的脂肪酸水平的稳态［２２，３９］㊂脂滴是由富含膜蛋白的单层磷脂分子层包裹中性脂类物质组成的细胞器［４０］㊂脂滴一般存在于种子等植物的营养储存器官中，为植物提供能量和参与植物生长发育调控㊂叶片等光合组织中脂滴的数量通常远小于种子和花，但叶片脂滴能参与调控植物的非生物和生物胁迫响应［２３，３９］㊂例如，脂滴相关蛋白（ＬＤ⁃ａｓｓｏｃｉａｔｅｄｐｒｏｔｅｉｎ，ＬＤＡＰ）能调控植物脂滴的产生㊂对拟南芥ｌｄａｐ１／ｌｄａｐ３双敲除突变体的研究发现，突变体植物比野生型更容易受到干旱胁迫的影响［４１］㊂而过表达ｌｄａｐ基因的拟南芥显著提高了对干旱胁迫的抗性，这说明脂滴参与调控植物的干旱胁迫响应；另外两种脂滴表面的双加氧酶（ｄｉｏｘｙｇｅｎａｓｅ）和ｃａｌｅｏｓｉｎ能将α－亚麻酸转化为氧化脂类（ｏｘｙｌｉｐｉｎ）植保素，从而作为一种信号分子触发植物的超敏反应（ｈｙｐｅｒｓｅｎｓｉｔｉｖｅｒｅｓｐｏｎｓｅ，ＨＲ）［２１，２５］㊂这些研究均表明脂滴参与植物的非生物和生物胁迫响应㊂本研究发现过表达ＭｄＳＤＲ促进了脂滴的产生（图４㊁５），同时也提高了苹果对病原菌的抗性（图１）㊂因此推测ＭｄＳＤＲ蛋白通过调控脂肪酸的生物合成间接提高了脂滴的积累水平，从而提高了苹果对腐烂病菌的抗性，但脂滴提高苹果抗病性的具体调控机制还有待进一步研究㊂４　结论本研究利用农杆菌介导的瞬时转化体系在苹果组培苗中过表达ＭｄＳＤＲ，检测到苹果叶片中脂滴数量增加，并且对Ｖ．ｍａｌｉ的抗性显著提高㊂初步证明ＭｄＳＤＲ可以通过促进脂肪酸的生物合成，间接提高叶片脂滴的水平，从而增加植物的抗病性㊂该研究为理解植物抵抗病原胁迫的途径提供了新思路㊂参考文献：［１］㊀ＹｕＳＨ，ＳｕｎＱＧ，ＷｕＪＸ，ＺｈａｏＰＣ，ＳｕｎＹＭ，ＧｕｏＺＦ．Ｇｅｎｏｍｅ⁃ｗｉｄｅｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎａｎｄｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎｏｆｓｈｏｒｔ⁃ｃｈａｉｎｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ／ｒｅｄｕｃｔａｓｅ（ＳＤＲ）ｇｅｎｅｆａｍｉｌｙｉｎＭｅｄｉｃａｇｏｔｒｕｎｃａｔｕｌａ［Ｊ］．ＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌＪｏｕｒｎａｌｏｆＭｏｌｅｃｕｌａｒＳｃｉｅｎｃｅｓ，２０２１，２２（１７）：９４９８［２］㊀ＫａｌｌｂｅｒｇＹ，ＯｐｐｅｒｍａｎｎＵ，ＪöｒｎｖａｌｌＨ，ＰｅｒｓｓｏｎＢ．Ｓｈｏｒｔ⁃ｃｈａｉｎｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅｓ／ｒｅｄｕｃｔａｓｅｓ（ＳＤＲｓ）［Ｊ］．ＥｕｒｏｐｅａｎＪｏｕｒｎａｌｏｆＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２００２，２６９（１８）：４４０９－４４１７［３］㊀ＭｏＸＨ，ＺｈａｎｇＨ，ＤｕＦＹ，ＹａｎｇＳ．Ｓｈｏｒｔ⁃ｃｈａｉｎｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅＮｃｍＤｉｓｒｅｓｐｏｎｓｉｂｌｅｆｏｒｔｈｅＣ－１０ｏｘｉｄａｔｉｏｎｏｆｎｏｃａｍｙｃｉｎＦｉｎｎｏｃａｍｙｃｉｎｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ［Ｊ］．ＦｒｏｎｔｉｅｒｓｉｎＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，２０２０，１１：６１０８２７［４］㊀ＫａｖａｎａｇｈＫＬ，ＪｏｒｎｖａｌｌＨ，ＰｅｒｓｓｏｎＢ，ＯｐｐｅｒｍａｎｎＵ．ＴｈｅＳＤＲｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ：Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌａｎｄｓｔｒｕｃｔｕｒａｌｄｉｖｅｒｓｉｔｙｗｉｔｈｉｎａｆａｍｉｌｙｏｆｍｅｔａｂｏｌｉｃａｎｄｒｅｇｕｌａｔｏｒｙｅｎｚｙｍｅｓ［Ｊ］．ＣｅｌｌｕｌａｒａｎｄＭｏｌｅｃｕｌａｒＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅｓ，２００８，６５（２４）：３８９５－３９０６［５］㊀ＳｔｏｃｋｉｎｇｅｒＰ，ＲｏｔｈＳ，ＭüｌｌｅｒＭ，ＰｌｅｉｓｓＪ．Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃｅｖａｌｕａｔｉｏｎｏｆｉｍｉｎｅ⁃ｒｅｄｕｃｉｎｇｅｎｚｙｍｅｓ：Ｃｏｍｍｏｎｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓｉｎｉｍｉｎｅｒｅｄｕｃｔａｓｅｓ，β－ｈｙｄｒｏｘｙａｃｉｄｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅｓ，ａｎｄｓｈｏｒｔ⁃ｃｈａｉｎｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅｓ／ｒｅｄｕｃｔａｓｅｓ［Ｊ］．ＣｈｅｍＢｉｏＣｈｅｍ，２０２０，２１（１８）：２６８９－２６９５［６］㊀ＦｅｒｒｅｒＪＬ，ＡｕｓｔｉｎＭＢ，ＳｔｅｗａｒｔＣＪｒ，ＮｏｅｌＪＰ．Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅａｎｄｆｕｎｃｔｉｏｎｏｆｅｎｚｙｍｅｓｉｎｖｏｌｖｅｄｉｎｔｈｅｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓｏｆｐｈｅｎｙｌｐｒｏｐａｎｏｉｄｓ［Ｊ］．ＰｌａｎｔＰｈｙｓｉｏｌｏｇｙＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２００８，４６（３）：３５６－３７０［７］㊀ＹｕＪ，ＳｕｎＨ，ＺｈａｎｇＪＪ，ＨｏｕＹＹ，ＺｈａｎｇＴＪ，ＫａｎｇＪＭ，ＷａｎｇＺ，ＹａｎｇＱＣ，ＬｏｎｇＲＣ．Ａｎａｌｙｓｉｓｏｆａｌｄｏ⁃ｋｅｔｏｒｅｄｕｃｔａｓｅｇｅｎｅｆａｍｉｌｙａｎｄｔｈｅｉｒｒｅｓｐｏｎｓｅｓｔｏｓａｌｔ，ｄｒｏｕｇｈｔ，ａｎｄａｂｓｃｉｓｉｃａｃｉｄｓｔｒｅｓｓｅｓｉｎＭｅｄｉｃａｇｏｔｒｕｎｃａｔｕｌａ［Ｊ］．ＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌＪｏｕｒｎａｌｏｆＭｏｌｅｃｕｌａｒＳｃｉｅｎｃｅｓ，２０２０，２１（３）：７５４［８］㊀ＣｈｏｉＨＷ，ＬｅｅＢＧ，ＫｉｍＮＨ，ＰａｒｋＹ，ＬｉｍＣＷ，ＳｏｎｇＨＫ，ＨｗａｎｇＢＫ．Ａｒｏｌｅｆｏｒａｍｅｎｔｈｏｎｅｒｅｄｕｃｔａｓｅｉｎｒｅｓｉｓｔａｎｃｅａｇａｉｎｓｔｍｉｃｒｏｂｉａｌｐａｔｈｏｇｅｎｓｉｎｐｌａｎｔｓ［Ｊ］．ＰｌａｎｔＰｈｙｓｉｏｌｏｇｙａｎｄＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２００８，１４８（１）：３８３－４０１［９］㊀ＧａｂｒｕｋＭ，Ｍｙｓｌｉｗａ⁃ＫｕｒｄｚｉｅｌＢ．Ｔｈｅｏｒｉｇｉｎ，ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｎｄｄｉｖｅｒｓｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｍｕｌｔｉｐｌｅｉｓｏｆｏｒｍｓｏｆｌｉｇｈｔ⁃ｄｅｐｅｎｄｅｎｔｐｒｏｔｏｃｈｌｏｒｏｐｈｙｌｌｉｄｅｏｘｉｄｏｒｅｄｕｃｔａｓｅ（ＬＰＯＲ）：Ｆｏｃｕｓｏｎａｎｇｉｏｓｐｅｒｍｓ［Ｊ］．ＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｌＪｏｕｒｎａｌ，２０２０，４７７（１２）：２２２１－２２３６［１０］㊀ＶｅｄａｌａｎｋａｒＰ，ＴｒｉｐａｔｈｙＢＣ．Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎｏｆｌｉｇｈｔ⁃ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔｐｒｏｔｏｃｈｌｏｒｏｐｈｙｌｌｉｄｅｏｘｉｄｏｒｅｄｕｃｔａｓｅ［Ｊ］．Ｐｒｏｔｏｐｌａｓｍａ，２０１９，２５６（２）：２９３－３１２［１１］㊀Ｏ ＨａｒａＰ，ＳｌａｂａｓＡＲ，ＦａｗｃｅｔｔＴ．Ｆａｔｔｙａｃｉｄａｎｄｌｉｐｉｄｂｉｏｓｙｎｔｈｅｔｉｃｇｅｎｅｓａｒｅｅｘｐｒｅｓｓｅｄａｔｃｏｎｓｔａｎｔｍｏｌａｒｒａｔｉｏｓｂｕｔｄｉｆｆｅｒｅｎｔａｂｓｏｌｕｔｅｌｅｖｅｌｓｄｕｒｉｎｇｅｍｂｒｙｏｇｅｎｅｓｉｓ［Ｊ］．ＰｌａｎｔＰｈｙｓｉｏｌｏｇｙ，２００２，１２９（１）：３１０－３２０［１２］㊀ＯｈｌｒｏｇｇｅＪＢ，ＪａｗｏｒｓｋｉＪＧ．Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｏｆｆａｔｔｙａｃｉｄｓｙｎｔｈｅｓｉｓ［Ｊ］．ＡｎｎｕａｌＲｅｖｉｅｗｏｆＰｌａｎｔＰｈｙｓｉｏｌｏｇｙａｎｄＰｌａｎｔＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ，１９９７，４８：１０９－１３６［１３］㊀ＢｅｉｓｓｏｎＦ，ＬｉＹ，ＢｏｎａｖｅｎｔｕｒｅＧ，ＰｏｌｌａｒｄＭ，ＯｈｌｒｏｇｇｅＪＢ．ＴｈｅａｃｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅＧＰＡＴ５ｉｓｒｅｑｕｉｒｅｄｆｏｒｔｈｅｓｙｎｔｈｅｓｉｓｏｆｓｕｂｅｒｉｎｉｎｓｅｅｄｃｏａｔａｎｄｒｏｏｔｏｆＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ［Ｊ］．ＰｌａｎｔＣｅｌｌ，２００７，１９（１）：３５１－３６８［１４］㊀ＬｅｅＳＢ，ＳｕｈＭＣ．Ｄｉｓｒｕｐｔｉｏｎｏｆｇｌｙｃｏｓｙｌｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｉｎｏｓｉｔｏｌ⁃ａｎｃｈｏｒｅｄｌｉｐｉｄｔｒａｎｓｆｅｒｐｒｏｔｅｉｎ１５ａｆｆｅｃｔｓｓｅｅｄｃｏａｔｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙｉｎＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ［Ｊ］．ＰｌａｎｔＪｏｕｒｎａｌ，２０１８，９６（６）：１２０６－１２１７［１５］㊀ＩｖａｎｏｖａＴＶ，ＶｏｒｏｎｋｏｖＡＳ，ＫｕｚｎｅｔｓｏｖａＥＩ，ＫｕｍａｃｈｏｖａＴＫ，ＺｈｉｒｏｖＶＫ，ＴｓｙｄｅｎｄａｍｂａｅｖＶＤ．ＬｉｐｉｄｆａｔｔｙａｃｉｄｆｒｏｍｔｈｅｐｅｒｉｃａｒｐＣｙｄｏｎｉａｏｂｌｏｎｇａＭｉｌｌ．ａｎｄＭｅｓｐｉｌｕｓｇｅｒｍａｎｉｃａＬ．ｉｎｖｏｌｖｅｄｉｎｐｌａｎｔａｄａｐｔａｔｉｏｎｔｏａｌｔｉｔｕｄｉｎａｌｚｏｎａｌｉｔｙ［Ｊ］．ＤｏｋｌａｄｙＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙａｎｄＢｉｏｐｈｙｓｉｃｓ，２０１９，４８６（１）：２２９－２３３［１６］㊀ＲａｂｅｒｔＣ，ＩｎｏｓｔｒｏｚａＫ，ＢｒａｖｏＳ，ＳｅｐúｌｖｅｄａＮ，ＢｒａｖｏＬＡ．Ｅｘｐｌｏｒａｔｏｒｙｓｔｕｄｙｏｆｆａｔｔｙａｃｉｄｐｒｏｆｉｌｅｉｎｔｗｏｆｉｌｍｙｆｅｒｎｓｗｉｔｈｃｏｎｔｒａｓｔｉｎｇｄｅｓｉｃｃａｔｉｏｎｔｏｌｅｒａｎｃｅｒｅｖｅａｌｔｈｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎｏｆｖｅｒｙｌｏｎｇｃｈａｉｎｐｏｌｙｕｎｓａｔｕｒａｔｅｄｏｍｅｇａ－３ｆａｔｔｙａｃｉｄｓ［Ｊ］．Ｐｌａｎｔｓ（Ｂａｓｅｌ），２０２０，９（１１）：１４３１［１７］㊀ＩｂａＫ．Ａｃｃｌｉｍａｔｉｖｅｒｅｓｐｏｎｓｅｔｏｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅｓｔｒｅｓｓｉｎｈｉｇｈｅｒｐｌａｎｔｓ：Ａｐｐｒｏａｃｈｅｓｏｆｇｅｎｅｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇｆｏｒｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅｔｏｌｅｒａｎｃｅ［Ｊ］．３６１２核㊀农㊀学㊀报３６卷ＡｎｎｕａｌＲｅｖｉｅｗｏｆＰｌａｎｔＢｉｏｌｏｇｙ，２００２，５３：２２５－２４５［１８］㊀Ｂｌ ｅＥ．Ｉｍｐａｃｔｏｆｐｈｙｔｏ⁃ｏｘｙｌｉｐｉｎｓｉｎｐｌａｎｔｄｅｆｅｎｓｅ［Ｊ］．ＴｒｅｎｄｓｉｎＰｌａｎｔＳｃｉｅｎｃｅ，２００２，７（７）：３１５－３２２［１９］㊀ＣｈｒｉｓｔｉｅＷＷ，ＨａｒｗｏｏｄＪＬ．Ｏｘｉｄａｔｉｏｎｏｆｐｏｌｙｕｎｓａｔｕｒａｔｅｄｆａｔｔｙａｃｉｄｓｔｏｐｒｏｄｕｃｅｌｉｐｉｄｍｅｄｉａｔｏｒｓ［Ｊ］．ＥｓｓａｙｓｉｎＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２０２０，６４（３）：４０１－４２１［２０］㊀ＫａｃｈｒｏｏＰ，ＳｈａｎｋｌｉｎＪ，ＳｈａｈＪ，ＷｈｉｔｔｌｅＥＪ，ＫｌｅｓｓｉｇＤＦ．Ａｆａｔｔｙａｃｉｄｄｅｓａｔｕｒａｓｅｍｏｄｕｌａｔｅｓｔｈｅａｃｔｉｖａｔｉｏｎｏｆｄｅｆｅｎｓｅｓｉｇｎａｌｉｎｇｐａｔｈｗａｙｓｉｎｐｌａｎｔｓ［Ｊ］．ＰｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓｏｆｔｈｅＮａｔｉｏｎａｌＡｃａｄｅｍｙｏｆＳｃｉｅｎｃｅｓｏｆｔｈｅＵｎｉｔｅｄＳｔａｔｅｓｏｆＡｍｅｒｉｃａ，２００１，９８（１６）：９４４８－９４５３［２１］㊀ＣｅｃｃｈｉｎｉＮＭ，ＳｐｅｅｄＤＪ，ＲｏｙｃｈｏｕｄｈｒｙＳ，ＧｒｅｅｎｂｅｒｇＪＴ．ＫｉｎａｓｅｓａｎｄｐｒｏｔｅｉｎｍｏｔｉｆｓｒｅｑｕｉｒｅｄｆｏｒＡＺＩ１ｐｌａｓｔｉｄｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎａｎｄｔｒａｆｆｉｃｋｉｎｇｄｕｒｉｎｇｐｌａｎｔｄｅｆｅｎｓｅｉｎｄｕｃｔｉｏｎ［Ｊ］．ＰｌａｎｔＪｏｕｒｎａｌ，２０２１，１０５（６）：１６１５－１６２９［２２］㊀ＨｕａｎｇＡＨＣ．Ｐｌａｎｔｌｉｐｉｄｄｒｏｐｌｅｔｓａｎｄｔｈｅｉｒａｓｓｏｃｉａｔｅｄｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｐｏｔｅｎｔｉａｌｆｏｒｒａｐｉｄａｄｖａｎｃｅｓ［Ｊ］．ＰｌａｎｔＰｈｙｓｉｏｌｏｇｙ，２０１８，１７６（３）：１８９４－１９１８［２３］㊀ＰｙｃＭ，ＣａｉＹＱ，ＧｒｅｅｒＭＳ，ＹｕｒｃｈｅｎｋｏＯ，ＣｈａｐｍａｎＫＤ，ＤｙｅｒＪＭ，ＭｕｌｌｅｎＲＴ．Ｔｕｒｎｉｎｇｏｖｅｒａｎｅｗｌｅａｆｉｎｌｉｐｉｄｄｒｏｐｌｅｔｂｉｏｌｏｇｙ［Ｊ］．ＴｒｅｎｄｓｉｎＰｌａｎｔＳｃｉｅｎｃｅ，２０１７，２２（７）：５９６－６０９［２４］㊀ＬｉａｎｇＴ，ＳｈｉＣ，ＰｅｎｇＹ，ＴａｎＨＪ，ＸｉｎＰＹ，ＹａｎｇＹ，ＷａｎｇＦ，ＬｉＸ，ＣｈｕＪＦ，ＨｕａｎｇＪＲ，ＹｉｎＹＲ，ＬｉｕＨＴ．Ｂｒａｓｓｉｎｏｓｔｅｒｏｉｄ⁃ａｃｔｉｖａｔｅｄＢＲＩ１－ＥＭＳ⁃ＳＵＰＰＲＥＳＳＯＲ１ｉｎｈｉｂｉｔｓｆｌａｖｏｎｏｉｄｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓａｎｄｃｏｏｒｄｉｎａｔｅｓｇｒｏｗｔｈａｎｄＵＶ⁃Ｂｓｔｒｅｓｓｒｅｓｐｏｎｓｅｓｉｎｐｌａｎｔｓ［Ｊ］．ＰｌａｎｔＣｅｌｌ，２０２０，３２（１０）：３２２４－３２３９［２５］㊀ＳｈｉｍａｄａＴＬ，Ｈａｒａ⁃ＮｉｓｈｉｍｕｒａＩ．Ｌｅａｆｏｉｌｂｏｄｉｅｓａｒｅｓｕｂｃｅｌｌｕｌａｒｆａｃｔｏｒｉｅｓｐｒｏｄｕｃｉｎｇａｎｔｉｆｕｎｇａｌｏｘｙｌｉｐｉｎｓ［Ｊ］．ＣｕｒｒｅｎｔＴｏｐｉｃｓｉｎＰｌａｎｔＢｉｏｌｏｇｙ，２０１５，２５：１４５－１５０［２６］㊀龚婉，吕路琼，王维东，黄丽丽．富士苹果ＳＤＲｓ家族基因ＭｄＳＤＲ的克隆及序列分析［Ｊ］．分子植物育种，２０２０，１８（１４）：４５９７－４６０４［２７］㊀ＷａｎｇＷＤ，ＮｉｅＪＪ，ＬｖＬＱ，ＧｏｎｇＷ，ＷａｎｇＳＬ，ＹａｎｇＭＭ，ＸｕＬＳ，ＬｉＭＪ，ＤｕＨＸ，ＨｕａｎｇＬＬ．ＡＶａｌｓａｍａｌｉｅｆｆｅｃｔｏｒｐｒｏｔｅｉｎ１ｔａｒｇｅｔｓａｐｐｌｅ（Ｍａｌｕｓｄｏｍｅｓｔｉｃａ）ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ⁃ｒｅｌａｔｅｄ１０ｐｒｏｔｅｉｎｔｏｐｒｏｍｏｔｅｖｉｒｕｌｅｎｃｅ［Ｊ］．ＦｒｏｎｔｉｅｒｓｉｎＰｌａｎｔＳｃｉｅｎｃｅ，２０２１，１２：７４１３４２［２８］㊀ＧｒｅｅｒＭＳ，ＣａｉＹ，ＧｉｄｄａＳＫ，ＥｓｎａｙＮ，ＫｒｅｔｚｓｃｈｍａｒＦＫ，ＳｅａｙＤ，ＭｃＣｌｉｎｃｈｉｅＥ，ＩｓｃｈｅｂｅｃｋＴ，ＭｕｌｌｅｎＲＴ，ＤｙｅｒＪＭ，ＣｈａｐｍａｎＫＤ．ＳＥＩＰＩＮｉｓｏｆｏｒｍｓｉｎｔｅｒａｃｔｗｉｔｈｔｈｅｍｅｍｂｒａｎｅ⁃ｔｅｔｈｅｒｉｎｇｐｒｏｔｅｉｎＶＡＰ２７－１ｆｏｒｌｉｐｉｄｄｒｏｐｌｅｔｆｏｒｍａｔｉｏｎ［Ｊ］．ＰｌａｎｔＣｅｌｌ，２０２０，３２（９）：２９３２－２９５０［２９］㊀ＹｉｎＺＹ，ＫｅＸＷ，ＫａｎｇＺＳ，ＨｕａｎｇＬＬ．ＡｐｐｌｅｒｅｓｉｓｔａｎｃｅｒｅｓｐｏｎｓｅｓａｇａｉｎｓｔＶａｌｓａｍａｌｉｒｅｖｅａｌｅｄｂｙｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｉｃｓａｎａｌｙｓｅｓ［Ｊ］．ＰｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌＭｏｌｅｃｕｌａｒＰｌａｎｔＰａｔｈｏｌｏｇｙ，２０１６，９３：８５－９２［３０］㊀ＣａｉＹ，ＧｏｏｄｍａｎＪＭ，ＰｙｃＭ，ＭｕｌｌｅｎＲＴ，ＤｙｅｒＪＭ，ＣｈａｐｍａｎＫＤ．ＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓＳＥＩＰＩＮｐｒｏｔｅｉｎｓｍｏｄｕｌａｔｅｔｒｉａｃｙｌｇｌｙｃｅｒｏｌａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎａｎｄｉｎｆｌｕｅｎｃｅｌｉｐｉｄｄｒｏｐｌｅｔｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ［Ｊ］．ＰｌａｎｔＣｅｌｌ，２０１５，２７（９）：２６１６－２６３６［３１］㊀ＴｏｎｆａｃｋＬＢ，ＭｏｕｍｍｏｕＨ，Ｌａｔｃｈ Ａ，ＹｏｕｍｂｉＥ，ＢｅｎｉｃｈｏｕＭ，ＰｅｃｈＪＣ，ＶａｎＤｅｒＲｅｓｔＢ．ＴｈｅｐｌａｎｔＳＤＲｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ：Ｉｎｖｏｌｖｅｍｅｎｔｉｎｐｒｉｍａｒｙａｎｄｓｅｃｏｎｄａｒｙｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ［Ｊ］．ＣｕｒｒｅｎｔＴｏｐｉｃｓｉｎＰｌａｎｔＢｉｏｌｏｇｙ，２０１１，１２：４１－５３［３２］㊀郭蔼光．基础生物化学第２版［Ｍ］．北京：高等教育出版社，２００９［３３］㊀ＷａｎｇＣ，ＣｈｉｎＣＫ，ＣｈｅｎＡ．Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｔｈｅｙｅａｓｔｄｅｌｔａ－９ｄｅｓａｔｕｒａｓｅｇｅｎｅｉｎｔｏｍａｔｏｅｎｈａｎｃｅｓｉｔｓｒｅｓｉｓｔａｎｃｅｔｏｐｏｗｄｅｒｙｍｉｌｄｅｗ［Ｊ］．ＰｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌａｎｄＭｏｌｅｃｕｌａｒＰｌａｎｔＰａｔｈｏｌｏｇｙ，１９９８，５２（６）：３７１－３８３［３４］㊀ＸｉｎｇＪＳ，ＣｈｉｎＣＫ．ＭｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｆａｔｔｙａｃｉｄｓｉｎｅｇｇｐｌａｎｔａｆｆｅｃｔｓｉｔｓｒｅｓｉｓｔａｎｃｅｔｏＶｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍｄａｈｌｉａｅ［Ｊ］．ＰｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌａｎｄＭｏｌｅｃｕｌａｒＰｌａｎｔＰａｔｈｏｌｏｇｙ，２０００，５６（５）：２１７－２２５［３５］㊀ＭａｄｉＬ，ＷａｎｇＸＪ，ＫｏｂｉｌｅｒＡ，ＬｉｃｈｔｅｒＡ，ＰｒｕｓｋｙＤ．Ｓｔｒｅｓｓｏｎａｖｏｃａｄｏｆｒｕｉｔｓｒｅｇｕｌａｔｅｓә９－ｓｔｅａｒｏｙｌＡＣＰｄｅｓａｔｕｒａｓｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，ｆａｔｔｙａｃｉｄｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ，ａｎｔｉｆｕｎｇａｌｄｉｅｎｅｌｅｖｅｌａｎｄｒｅｓｉｓｔａｎｃｅｔｏＣｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍｇｌｏｅｏｓｐｏｒｉｏｉｄｅｓａｔｔａｃｋ［Ｊ］．ＰｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌａｎｄＭｏｌｅｃｕｌａｒＰｌａｎｔＰａｔｈｏｌｏｇｙ，２００３，６２（５）：２７７－２８３［３６］㊀ＹａｅｎｏＴ，ＭａｔｓｕｄａＯ，ＩｂａＫ．Ｒｏｌｅｏｆｃｈｌｏｒｏｐｌａｓｔｔｒｉｅｎｏｉｃｆａｔｔｙａｃｉｄｓｉｎｐｌａｎｔｄｉｓｅａｓｅｄｅｆｅｎｓｅｒｅｓｐｏｎｓｅｓ［Ｊ］．ＰｌａｎｔＪｏｕｒｎａｌ，２００４，４０（６）：９３１－９４１［３７］㊀ＯｎｇｅｎａＭ，ＤｕｂｙＦ，ＲｏｓｓｉｇｎｏｌＦ，ＦａｕｃｏｎｎｉｅｒＭＬ，ＤｏｍｍｅｓＪ，ＴｈｏｎａｒｔＰ．ＳｔｉｍｕｌａｔｉｏｎｏｆｔｈｅｌｉｐｏｘｙｇｅｎａｓｅｐａｔｈｗａｙｉｓａｓｓｏｃｉａｔｅｄｗｉｔｈｓｙｓｔｅｍｉｃｒｅｓｉｓｔａｎｃｅｉｎｄｕｃｅｄｉｎｂｅａｎｂｙａｎｏｎｐａｔｈｏｇｅｎｉｃＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｓｔｒａｉｎ［Ｊ］．ＭｏｌｅｃｕｌａｒＰｌａｎｔ⁃ＭｉｃｒｏｂｅＩｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ，２００４，１７（９）：１００９－１０１８［３８］㊀ＫｕｎｚＨＨ，ＳｃｈａｒｎｅｗｓｋｉＭ，ＦｅｕｓｓｎｅｒＫ，ＦｅｕｓｓｎｅｒＩ，ＦｌｕｇｇｅＵＩ，ＦｕｌｄａＭ，ＧｉｅｒｔｈＭ．ＴｈｅＡＢＣｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒＰＸＡ１ａｎｄｐｅｒｏｘｉｓｏｍａｌｂｅｔａ⁃ｏｘｉｄａｔｉｏｎａｒｅｖｉｔａｌｆｏｒｍｅｔａｂｏｌｉｓｍｉｎｍａｔｕｒｅｌｅａｖｅｓｏｆＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓｄｕｒｉｎｇｅｘｔｅｎｄｅｄｄａｒｋｎｅｓｓ［Ｊ］．ＰｌａｎｔＣｅｌｌ，２００９，２１（９）：２７３３－２７４９［３９］㊀ＩｓｃｈｅｂｅｃｋＴ，ＫｒａｗｃｚｙｋＨＥ，ＭｕｌｌｅｎＲＴ，ＤｙｅｒＪＭ，ＣｈａｐｍａｎＫＤ．Ｌｉｐｉｄｄｒｏｐｌｅｔｓｉｎｐｌａｎｔｓａｎｄａｌｇａｅ：Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ，ｆｏｒｍａｔｉｏｎ，ｔｕｒｎｏｖｅｒａｎｄｆｕｎｃｔｉｏｎ［Ｊ］．ＳｅｍｉｎａｒｓｉｎＣｅｌｌａｎｄＤｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌＢｉｏｌｏｇｙ，２０２０，１０８：８２－９３［４０］㊀ＯｎａｌＧ，ＫｕｔｌｕＯ，ＧｏｚｕａｃｉｋＤ，ＤｏｋｍｅｃｉＥｍｒｅＳ．Ｌｉｐｉｄｄｒｏｐｌｅｔｓｉｎｈｅａｌｔｈａｎｄｄｉｓｅａｓｅ［Ｊ］．ＬｉｐｉｄｓｉｎＨｅａｌｔｈａｎｄＤｉｓｅａｓｅ，２０１７，１６（１）：１２８［４１］㊀ＧｉｄｄａＳＫ，ＰａｒｋＳ，ＰｙｃＭ，ＹｕｒｃｈｅｎｋｏＯ，ＣａｉＹ，ＷｕＰ，ＡｎｄｒｅｗｓＤＷ，ＣｈａｐｍａｎＫＤ，ＤｙｅｒＪＭ，ＭｕｌｌｅｎＲＴ．Ｌｉｐｉｄｄｒｏｐｌｅｔ⁃ａｓｓｏｃｉａｔｅｄｐｒｏｔｅｉｎｓ（ＬＤＡＰｓ）ａｒｅｒｅｑｕｉｒｅｄｆｏｒｔｈｅｄｙｎａｍｉｃｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｏｆｎｅｕｔｒａｌｌｉｐｉｄｃｏｍｐａｒｔｍｅｎｔａｔｉｏｎｉｎｐｌａｎｔｃｅｌｌｓ［Ｊ］．ＰｌａｎｔＰｈｙｓｉｏｌｏｇｙ，２０１６，１７０（４）：２０５２－２０７１４６１２ＪｏｕｒｎａｌｏｆＮｕｃｌｅａｒＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ５６１２２０２２，３６（１１）：２１５８ ２１６５ＦｕｎｃｔｉｏｎＥｘｐｌｏｒａｔｉｏｎｏｆＡｐｐｌｅＳｈｏｒｔ⁃ＣｈａｉｎＤｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅｓ／ＲｅｄｕｃｔａｓｅｉｎＲｅｓｐｏｎｓｅｔｏＶａｌｓａｍａｌｉＷＡＮＧＳｈｕａｉｌｅ㊀ＸＩＡＯＫｅｙｕ㊀ＷＡＮＧＷｅｉｄｏｎｇ㊀ＨＵＡＮＧＬｉｌｉ∗（ＳｔａｔｅＫｅｙＬａｂｏｒａｔｏｒｙｏｆＣｒｏｐＳｔｒｅｓｓＢｉｏｌｏｇｙｆｏｒＡｒｉｄＡｒｅａｓ／ＣｏｌｌｅｇｅｏｆＰｌａｎｔＰｒｏｔｅｃｔｉｏｎ，ＮｏｒｔｈｗｅｓｔＡ＆ＦＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｙａｎｇｌｉｎｇ，Ｓｈａａｎｘｉ㊀７１２１００）Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｓｈｏｒｔｃｈａｉｎｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅｓ／ｒｅｄｕｃｔａｓｅ（ＳＤＲ）ｉｓａｋｉｎｄｏｆＮＡＤ（Ｐ）（Ｈ）－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔｏｘｉｄｏｒｅｄｕｃｔａｓｅ，ｗｈｉｃｈｉｓｒｅｓｐｏｎｓｉｂｌｅｆｏｒｃａｔａｌｙｚｉｎｇｔｈｅｒｅｄｏｘｓｔｅｐｓｏｆｖａｒｉｏｕｓｍｅｔａｂｏｌｉｃａｃｔｉｖｉｔｉｅｓｉｎｏｒｇａｎｉｓｍｓ．ＩｎｏｒｄｅｒｔｏｅｘｐｌｏｒｅｔｈｅｆｕｎｃｔｉｏｎｏｆＭｄＳＤＲ，ｔｈｅＭｄＳＤＲｇｅｎｅｓｗｅｒｅｔｒａｎｓｉｅｎｔｅｘｐｒｅｓｓｅｄｉｎＭａｌｕｓｄｏｍｅｓｔｉｃａｃｖ．Ｆｕｊｉｂｙａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ，ａｎｄｔｈｅｎｔｈｅｄｉｓｅａｓｅｒｅｓｉｓｔａｎｃｅｗａｓｓｔｕｄｉｅｄｂｙｐｒｉｃｋｉｎｏｃｕｌａｔｉｏｎｍｅｔｈｏｄ．ＴｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｌｅｖｅｌｏｆｆａｔｔｙａｃｉｄｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓｒｅｌａｔｅｄｇｅｎｅｓｉｎａｐｐｌｅｌｅａｖｅｓｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇＭｄＳＤＲｗｅｒｅｄｅｔｅｃｔｅｄｗｉｔｈｒｅａｌ⁃ｔｉｍｅｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅＰＣＲ（ｑＲＴ－ＰＣＲ）．ＴｈｅｃｏｎｔｅｎｔｏｆｆａｔｔｙａｃｉｄｓｉｎａｐｐｌｅｌｅａｖｅｓｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇＭｄＳＤＲｗｅｒｅａｎａｌｙｓｅｄｂｙＧａｓｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ（ＧＣ）ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．ＴｈｅｌｉｐｉｄｄｒｏｐｌｅｔｓｉｎａｐｐｌｅｌｅａｖｅｓｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇＭｄＳＤＲｗｅｒｅｓｔａｉｎｅｄｂｙｎｉｌｅｒｅｄ．ＴｈｅｒｅｓｕｌｔｓｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｔｈｅａｐｐｌｅｌｅａｖｅｓｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇＭｄＳＤＲｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｅｎｈａｎｃｅｄｔｈｅｒｅｓｉｓｔａｎｃｅｔｏＶａｌｓａｍａｌｉ．Ｔｈｅｌｅｓｉｏｎｄｉａｍｅｔｅｒｏｆｔｈｅｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌｇｒｏｕｐｄｅｃｒｅａｓｅｄｂｙａｂｏｕｔ１４ 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植物真菌病害基础知识及病害诊断
植物真菌病害是植物生长过程中常见的一种病害，它会严重影响植物的生长发育和产量，甚至导致植物死亡。

因此，了解植物真菌病害的基础知识及病害诊断非常重要。

植物真菌病害的基础知识包括病原菌种类、病害发生规律、传播途径等。

常见的真菌病害有白粉病、黑斑病、霜霉病等，它们的传播途径主要包括空气传播、水传播和土传播等。

在病害的预防和控制中，必须针对不同的病原菌采取不同的控制措施。

病害诊断是确定植物是否感染真菌病害的关键步骤。

常见的病害诊断方法包括外观诊断、病原菌分离鉴定、PCR诊断等。

外观诊断是最常用的诊断方法，通过观察植物的叶子、茎、花等部位的症状来确定植物是否感染了真菌病害。

如果需要更加准确的诊断结果，可以采用病原菌分离鉴定和PCR诊断等高级诊断手段。

综上所述，了解植物真菌病害的基础知识及病害诊断对于预防和控制植物真菌病害非常重要。

只有掌握了这些知识，才能更好地保护植物的健康生长。

- 1 -。

桃腐烂病病原菌的分离鉴定引言桃是一种美味的水果，但在生长和储存过程中，常常受到各种病原菌的侵害，其中桃腐烂病是造成桃子腐烂和品质损失的重要病害。

病原菌的分离鉴定对于研究病害发生规律、制定防控措施具有重要意义。

本文将介绍桃腐烂病病原菌的分离鉴定过程及结果。

一、研究背景桃腐烂病是由多种病原菌引起的真菌病害，主要包括青霉病、炭疽病和褐斑病等。

这些病原菌会在桃子表面或内部生长，并产生毒素和酶类，导致果实发生腐烂和变质。

对桃腐烂病的病原菌进行分离鉴定，有助于了解各种病原菌的分布规律、病害发生的原因及防控措施的制定。

二、研究过程1. 样品采集在桃子腐烂发病高发期，采集患病果实样品，并在不同病情严重程度的果实上进行采集，确保所得样品具有代表性。

还需采集正常果实作为对照组样品。

2. 病原菌分离将采集的果实样品表面进行消毒处理，然后取得果实内部组织进行分离操作。

将果实切割成小块，然后分别在含有抗生素的培养基上进行分离培养。

分离成功的菌落将进行单一细菌或真菌的分离纯化工作，获得单一的病原菌纯培养物。

3. 病原菌鉴定通过对分离获得的病原菌进行形态观察、生理生化特性测定和分子生物学方法检测等手段，对病原菌进行鉴定工作。

形态观察包括菌落形态、细胞形态、芽胞形态等特征；生理生化特性测定包括生长条件、代谢产物、生化试剂反应等；分子生物学方法检测包括PCR扩增、酶联免疫吸附实验等。

4. 结果分析对分离鉴定获得的桃腐烂病病原菌的结果进行统计分析，了解各病原菌在样品中的分布情况和比例，以及病害发生的相关因素。

三、研究结果通过对不同病情程度的桃子样品进行病原菌分离鉴定，初步得出了以下结论：1. 桃腐烂病的病原菌主要包括青霉病菌、炭疽病菌和褐斑病菌。

2. 在不同病情程度的桃子样品中，各种病原菌的分布情况存在差异，其中炭疽病菌在严重病情样品中比例较高。

3. 病原菌的鉴定结果为后续的防控措施制定提供了重要依据。

四、研究意义桃腐烂病的病原菌分离鉴定对于了解病害发生的规律、制定防控措施具有重要意义。

232023.5力。

氮肥是温室气体排放的最大贡献者，占我国大棚蔬菜生产温室气体排放量的78.2%。

我国大棚蔬菜生产的氮肥投入量分别比小麦和玉米生产高出67.6%和60.0%，比美国蔬菜种植高出约2.1倍。

因此，降低氮肥施用量对于减少我国蔬菜生产的温室气体排放至关重要。

4.2　温室气体减排潜力减少作物生产产生的温室气体排放是可持续农业发展的一项重大挑战。

研究表明，我国蔬菜生产种植系统的温室气体排放可得到实质性的缓解。

减少氮肥投入是有效的温室气体减排措施。

我国大棚蔬菜生产中存在过量施氮现象，施氮量超过作物实际需水量，将氮肥施用量降低到最佳水平可减少土壤氮过剩，减少温室气体总排放量16.7%。

与此同时仍保持合理的土壤氮积累水平，并适应作物的氮需求。

北方地区的蔬菜生产每公顷温室气体减排潜力相对较大，其减少氮肥的潜力相对较大。

施用高效肥料（如硝化抑制剂）可控制土壤硝化，抑制微生物氨氧化，阻断代谢氮损失途径，减少温室气体排放。

南方地区的蔬菜生产，其种植面积越大，氮肥消耗减少幅度相对较大。

减少氮肥与增效肥联合施用比单独减少氮肥能更有效地减少温室气体排放。

由于种植面积较大，有机肥蔬菜比生长激素蔬菜具有更高的温室气体减排潜力。

因此，优化氮肥施用量和施用高效能肥料可有效减少未来蔬菜生产种植系统的温室气体排放。

5　结论可持续的P G V C 可在各地方、各区域甚至全球范围内提供重要的生态系统服务，可增加粮食产量，但也存在负面环境影响。

农业工作者对农业系统的研究有待深入，目前仅有小部分生态系统服务和环境影响可量化。

我国大棚蔬菜生产系统排放的温室气体排放量超过了其他国家的蔬菜生产系统以及我国的谷物作物生产，我国的蔬菜作物生产需要非常高的氮肥施用率。

在蔬菜生产中的温室气体排放量和强度的巨大空间差异，主要是肥料投入和栽培方法存在区域差异。

氮肥摄入影响温室气体排放和强度的空间分布，其相对影响随地区和省份的变化而变化。

氮肥投入占温室气体排放量的78.2%。