浑源黄芪地上部分与地下部分中黄酮类成分比较徐珍;李倩;刘亮亮;郭爱华【摘要】目的:通过对山西道地药材浑源黄芪地上与地下部分黄酮类成分比较,为黄芪药材地上部分合理应用提供依据.方法:采取HPLC梯度洗脱技术,对黄芪中6种黄酮类成分同时进行分离、定量分析.结果:浑源黄芪地上部分与地下部分均含有6种黄酮类成分,只是含量上略有差异.地上部分总黄酮含量为0.7450 mg/g,地下部分为0.8859 mg/g,其中7,2′-二羟基-3′,4′-二甲氧基异黄烷、毛蕊异黄酮、芒柄花苷在地上部分含量高于地下部分.结论:该结果为黄芪地上部分资源的开发利用提供参考依据.【期刊名称】《山西中医学院学报》【年(卷),期】2017(018)006【总页数】4页(P27-30)【关键词】浑源黄芪;地上部分;黄酮类成分;定性分析;定量分析【作者】徐珍;李倩;刘亮亮;郭爱华【作者单位】山西职工医学院,山西晋中030619;山西职工医学院,山西晋中030619;山西职工医学院,山西晋中030619;山西职工医学院,山西晋中030619【正文语种】中文【中图分类】R285.5黄芪为豆科植物蒙古黄芪或膜荚黄芪的干燥根［1］。
黄芪中含有多种重要的活性成分，其中黄酮类成分具有免疫调节、抗损伤、抗突变、抗肿瘤、抑制动脉粥样硬化等活性［2］。
随着对黄芪深入研究，它不仅可供药用，还被开发为保健品、食品及化妆品等广泛使用，使得黄芪市场出现了供不应求的局面。
黄芪种植地域性广，但其中山西黄芪的种植方式和生长年限最接近传统野生资源，商品药材的性状几乎与野生黄芪无区别，但占用土地年限长，因根深采刨困难，提高了生长成本，故产量有限［3］。
黄芪根入药时，大量地上部分被丢弃或焚烧，造成很大的药源资源浪费。
山西省浑源县是黄芪道地产品“正北芪”的原产地，素有“中国黄芪之乡”“正北芪之乡”的美誉。
课题组以浑源黄芪地上部分（茎、叶、种、秆）作为研究对象，以地下部分作为对比，对其中黄酮类成分进行定性、定量研究，旨在开发黄芪药材新的药用部位，为浑源黄芪地上部分科学合理的应用提供依据，进一步扩大黄芪药用资源的利用价值。
1 实验材料1.1 实验仪器Agilent 1200高效液相色谱系统（Agilent Chemstation色谱工作站、VDW 1314B紫外可见检测器、G1311A四元泵、G1316A柱温箱，美国安捷伦公司）；B-220型旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂）、XB120A型电子分析天平（上海精密化学仪器制造厂）、TCQ-250型超声波清洗机（北京医疗设备生产二厂）。
1.2 实验试剂芒柄花素、毛蕊异黄酮葡萄糖苷对照品（购于上海永恒生物科技有限公司，批号为20120528、20120428）；芒柄花苷、毛蕊异黄酮对照品（购于成都曼斯特生物科技有限公司，批号为13021808、13021808）；3-羟基-9，10-二甲基紫檀烷、7，2′-二羟基-3′，4′-二甲氧基异黄烷对照品（购于江苏永健医药科技有限公司，批号为YJ150718、YJ150717），各对照品质量分数均大于98%。
乙腈（美国Fisher公司，色谱纯）、纯净水（娃哈哈牌），甲醇等其余试剂均为分析纯。
1.3 实验药材本实验所用药材由山西省道地药材——浑源黄芪药材种植基地提供，经山西医科大学药学院白云娥教授鉴定为豆科植物蒙古黄芪的干燥根及地上部分（茎、叶、种、秆）。
2 方法与结果2.1 色谱条件流动相为乙腈（A）-水（B），体积流量 1.0 mL/min，Kromasil C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），紫外检测波长 230 nm，柱温25 ℃，进样量20 μL ［4］。
梯度洗脱条件见表1。
表1 梯度洗脱条件时间（m i n）流动相A（%）流动相B（%）0～8 2 0 8 0 8～1 5 2 0→3 0 8 0→7 0 1 5～3 0 3 0→4 3 7 0→5 7 3 0～4 0 4 3→6 0 57→4 0 4 0～5 0 6 0→1 0 0 5 7→4 0 5 0～6 0 1 0 0 4 0→02.2 配制对照品溶液本实验采用多指标定量法对黄芪中6种黄酮类成分进行同时测定，故对照品应配制成混合对照品溶液，即该溶液中含有含量已知的6种黄酮类对照品。
具体配制方法如下：精密称取对照品适量置于10 mL容量瓶中，用甲醇定容，由此，可得到6种黄酮化合物各自的对照品储备液。
然后每种储备液取适量，置于25 mL容量瓶中，甲醇定容，即制得混合对照品溶液（A）。
各储备液浓度及混合对照品溶液中各成分浓度见表2。
表2 混合对照品溶液各成分浓度表编号名称对照品浓度（μ g/m L）混合对照品中浓度（μ g/m L）1 芒柄花素 6 1 0.0 1 2.2 2 毛蕊异黄酮葡萄糖苷 1 0 3 0.0 2 0 6.0 3 芒柄花苷 6 5 0.0 7 8.0 4 毛蕊异黄酮 6 7 0.0 2 6.8 5 3-羟基-9,1 0-二甲基紫檀烷9 8 0.0 1 1 7.6 6 7,2′-二羟基-3′,4′-二甲氧基异黄烷 9 9 0.0 5 9.42.3 供试品溶液的制备刘宗彬等［5］通过单因素实验考察黄芪黄酮最佳提取工艺条件为：颗粒细度0.075～0.25 mm之间，超声20 min，料液比达到1∶15，乙醇浓度为80%。
取黄芪药材，粉碎，过80目筛，备用。
精密称取黄芪地上部分、地下部分粉末各5 g，放入锥形瓶（具塞）中，加15倍量的80%乙醇，超声20 min，提取2次，合并滤液，滤过，置于水浴锅上蒸馏浓缩至干，用甲醇将残渣溶解后定容至10mL容量瓶中，振摇、混匀，即可。
2.4 标准曲线的制备以对照品的浓度为横坐标（X），峰面积积分值为纵坐标（Y），绘制标准曲线，可得线性回归方程。
本实验中作为横坐标的一系列对照品的浓度是将“对照品溶液的配置”中制备的6种对照品的储备液按照原溶液浓度的1倍、1/2倍、1/4倍、1/8倍、1/16倍、1/32倍、1/64倍稀释，每个对照品制成7种不同浓度的溶液，分别用0.45 μm的滤膜过滤，进样量20 μL，记录峰面积的积分值。
6种对照品的线性回归方程结果见表3。
表3 对照品线性回归方程及其线性范围成分回归方程线性范围（μ g） r 2芒柄花苷 Y=4 1 2 3 7 0 5 X+2 0 0 8 3 9 0.2 0～1 2.8 0 0.9 9 9 9毛蕊异黄酮葡萄糖苷 Y=2 4 1 6 9 5 6 X+3 0 0 3 1 2 0.6 0～1 9.2 0 0.9 9 9 0毛蕊异黄酮 Y=4 8 2 9 3 3 9 X+5 2 1 9 9 0 0.0 5～1.6 0 0.9 9 9 1芒柄花素 Y=6 2 8 5 8 9 0 X+5 8 1 3 2 2 0.6 0～1 9.2 0 0.9 9 9 3 3-羟基-9,1 0-二甲氧基紫檀烷 Y=1 3 2 9 0 7 2 4X+1 2 1 5 1 8 4 0.1 0～3.2 0 0.9 9 9 3 7,2′-二羟基-3′,4′-二甲氧基异黄烷 Y=1 1 8 3 5 9 9 3 X+2 4 6 2 0 0 8 0.1 0～3.2 0 0.9 9 9 16种对照品在各自的线性范围内都表现出良好的线性关系。
2.5 方法学考察2.5.1 精密度实验取混合对照品溶液（A）10μL，采用2.1项下的色谱条件，连续进样，共6次，依据峰面积积分值分别计算其RSD值。
结果见表4。
6种黄酮类成分RSD值都小于2.0%，提示该方法符合实验要求。
混合对照品（A）HPLC色谱图见图1。
2.5.2 稳定性实验依据“2.3供试品溶液制备方法”制作黄芪地上、地下部分的供试品溶液，每隔2 h进样检测，12 h内共检测6次。
针对不同成分的峰面积积分值计算其RSD值。
结果见表4。
RSD值均小于3.0%，表明各供试品溶液在12 h内稳定性良好。
2.5.3 重复性实验精密称取黄芪地上部分药材样品6份，每份1 g，按本实验方法制备成供试品溶液，进行HPLC检测。
结果见表4。
RSD值都低于2.5%，表明该实验方法具有良好的重复性。
2.5.4 加样回收实验准备黄芪地上、地下部分药材样品6份（要求已知药材中药物含量），制成供试品溶液，量取供试品溶液2 mL，将其置于5mL棕色容量瓶中，加入2.2项下制备的对照品储备液1 mL，再加甲醇定容至满刻度，振摇，混匀。
再进行HPLC检测，测定各成分的峰面积，进而计算平均加样回收率。
结果见表4。
图1 混合对照品（A）HPLC色谱图经以上方法学考察，所建立的含量测定条件其精密度、稳定性、重复性、回收率等均符合规定，可用于黄芪中黄酮类化学成分的含量测定。
2.6 含量测定将供试品溶液稀释至适宜浓度并进行HPLC含量检测，进样量为20 μL。
结果见表5和图2。
图2 黄芪地上、地下部分中黄酮类成分种类与含量的比较黄芪地上部分与地下部分均含有6种黄酮类成分：7，2′-二羟基-3′，4′-二甲氧基异黄烷、芒柄花苷、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、毛蕊异黄酮、芒柄花素、3-羟基-9，10-二甲氧基紫檀烷。
经比较可以发现，黄芪地上部分中毛蕊异黄酮含量为地下部分的4倍，芒柄花苷含量为地下部分的2倍，7，2′-二羟基-3′，4′-二甲氧基异黄烷的含量约为地下部分的1.1倍，芒柄花素和3-羟基-9，10-二甲氧基紫檀烷含量差别不明显，但地下部分中毛蕊异黄酮葡萄糖苷含量高于地上部分，约为2.5倍。
黄芪地下部分总黄酮含量略高于地上部分。
3 讨论中药黄芪中有多个有效部位，包括总黄酮、总皂苷、多糖类等，具有多种生物活性，其中黄酮类化合物是黄芪中分离的抗氧化、清除自由基的主要活性成分，具有明显的抗肿瘤、抗损伤和抗突变的作用［6］。
表4 方法学考察结果稳定性R S D（%）重复性R S D（%）加样回收R S D（%）地上部分地下部分地上部分地上部分地下部分芒柄花苷 0.5 2 1.4 5 1.2 6 2.3 1 1.0 3 1.2 8毛蕊异黄酮葡萄糖苷 0.4 3 0.7 6 1.0 8 1.7 5 2.1 2 0.7 1毛蕊异黄酮0.4 7 0.8 9 1.3 9 0.8 9 1.0 5 1.3 5芒柄花素 0.9 1 1.2 8 0.6 8 1.2 3 1.3 2 2.3 33-羟基-9,1 0-二甲氧基紫檀烷0.3 6 1.4 1 0.9 5 1.1 6 0.9 3 1.9 6 7,2′-二羟基-3′,4′-二甲氧基异黄烷 0.5 0 1.1 2 1.4 1 1.8 1 1.2 8 2.1 1成分精密度R S D（%）本文对山西道地药材——浑源黄芪地上部分与地下部分中黄酮类化合物进行比较，结果发现黄芪地上部分与地下部分所含黄酮类化合物种类相同，只是在含量上存有差别，除了毛蕊异黄酮葡萄糖苷（B）外，地上部分的芒柄花苷（A）、毛蕊异黄酮（C）、7，2′-二羟基-3′，4′-二甲氧基异黄烷（F）的含量明显高于地下部分，而芒柄花素（D）和3-羟基-9，10-二甲氧基紫檀烷（E）的含量不低于地下部分，但就总黄酮含量来说，地下部分略高于地上部分。
